呂鎖忠 朱衛(wèi)萍 吳安飛 曹昌娥 鄧 祎 鮑云惠

云南省曲靖市中醫(yī)醫(yī)院,云南 曲靖 655000

梔榆洗劑是根據(jù)曲靖市中醫(yī)醫(yī)院皮膚科診治尋常型銀屑病經(jīng)驗(yàn)處方開發(fā)的院內(nèi)制劑，組方中包含地榆、梔子、苦參、防風(fēng)等。作為院內(nèi)制劑研究開發(fā)過程中，對方中主要藥味展開研究，為有效控制梔榆洗劑的質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(島津，LC-2040C)；電子天平(島津，AP225WD，0.1mg/0.01mg)；超聲波清洗器(南京壘君達(dá)，UP250YHE)

1.2 試劑 試藥苦參對照藥材(121019-201407)、防風(fēng)對照藥材(120947-201409)、梔子苷(110749-201919，供含量測定用，含量97.1%)均來源于中國食品藥品檢定研究院；甲醇[霍尼韋爾(上海)有限公司，Lot：T8LG1H]、乙腈(霍尼韋爾(上海)有限公司，Lot：T84A1H)均為色譜純；水為純化水。

1.3 供試品 梔榆洗劑3批樣品(配制批次分別為S2020002、S2020003、S2020004)及陰性樣品由曲靖市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦參TLC鑒別方法

2.1.1 供試品溶液 制備取梔榆洗劑3批樣品各30 mL，分別濃縮至流浸膏狀，加1 mL濃氨溶液,30 mL三氯甲烷攪拌，30 min超聲提取后過濾，取三氯甲烷液蒸干為殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，制備為供試品溶液。

2.1.2 陰性樣品溶液 制備按處方比例取除苦參的梔榆洗劑所有中藥飲片粉碎混合均勻，取10 g，加2 mL濃氨溶液，60 mL三氯甲烷攪拌，30 min超聲提取后過濾，取三氯甲烷液，蒸干為殘?jiān)?，?.5 mL三氯甲烷使溶解為陰性對照品供試溶液。

2.1.3 對照藥材溶液 制備取1 g苦參標(biāo)準(zhǔn)對照藥材，加3 mL濃氨溶液，80 mL三氯甲烷，30 min 超聲處理后過濾，濾液蒸成殘?jiān)? mL三氯甲烷溶解為對照藥材溶液。

2.1.4 鑒別方法 吸取各5～10 μL供試品溶液和陰性樣品溶液、1～3 μL對照藥材溶液，點(diǎn)于同一硅膠G板上，展開劑為三氯甲烷-甲醇-濃氨溶液(5∶0.6∶0.3)放置10 ℃以下的下層溶液，展開，噴以碘化鉍鉀溶液。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品溶液無干擾，如圖1所示。

1 2 3 4 5 1～3.供試品溶液;4.苦參對照藥材溶液;5.陰性樣品中溶液圖1 苦參TLC鑒別

2.2 防風(fēng)TLC鑒別方法

2.2.1 供試品溶液 制備取梔榆洗劑三批樣品各30 mL，分別蒸干，殘?jiān)?0 mL甲醇，30 min超聲提取后過濾，濾液蒸干成殘?jiān)?，? mL乙醇使溶解為供試品溶液。

2.2.2 陰性樣品溶液 制備按處方比例取除防風(fēng)的梔榆洗劑所有飲片粉碎混合均勻，取5 g粉末，20 mL加甲醇，30 min超聲提取后過濾，濾液蒸干為殘?jiān)?，? mL乙醇使溶解為陰性對照藥材溶液。

2.2.3 對照藥材溶液 制備取2 g防風(fēng)對照藥材粉末，加40 mL甲醇，30 min超聲提取后過濾，濾液蒸干為殘?jiān)?，? mL乙醇使溶解為防風(fēng)對照藥材溶液。

2.2.4 鑒別方法 吸取各5～10 μL供試品溶液和陰性對照溶液、2～5 μL對照藥材溶液，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254板上，展開劑為三氯甲烷-甲醇(4∶1)溶液，按《中國藥典》薄層色譜法試驗(yàn)，噴以10%硫酸乙醇溶液，于365 nm下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品溶液無干擾，如圖2所示。

1～3.供試品溶液;4.防風(fēng)對照藥材溶液;5.陰性樣品溶液圖2 防風(fēng)TLC鑒別

2.3 含量測定方法

2.3.1 色譜條件 色譜柱：GL Science C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)，柱溫：40 ℃，流動(dòng)相：0.1%磷酸-乙腈(90∶10)，流速：1.0 mL/min；檢測波長：238 nm，理論板數(shù)按梔子苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000；進(jìn)樣量10 μL。

2.3.2 溶液制備

2.3.2.1 供試品溶液的制備 取梔榆洗劑供試品，混勻，精密量取10 mL定量至50 mL容量瓶中，混勻過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.2.2 對照品溶液的制備 取梔子苷標(biāo)準(zhǔn)對照品8.43 mg，精密稱定，加甲醇溶液定量至10 mL量瓶中，得0.8186 mg/mL的梔子苷標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液。

2.3.2.3 陰性樣品溶液的制備 按梔榆洗劑處方比例，稱取除梔子外其它全部飲片，照梔榆洗劑供試品生產(chǎn)工藝條件，制備缺梔子陰性對照樣品，再照供試品溶液制備方法制備成陰性對照溶液。

2.3.3 線性關(guān)系 考察取梔子苷對照品溶液適量，精密量取，分別制成含梔子苷8.185、 16.33、 40.84、 81.67、408.4 μg/mL 的系列對照品溶液，照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件實(shí)驗(yàn)，橫坐標(biāo)(X)為對照品濃度，縱坐標(biāo)(Y)為峰面積，結(jié)果：在8.185～408.4 μg/mL范圍內(nèi)梔子苷濃度具有良好線性關(guān)系r2=0.9997。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3.4 精密度考察 取同一梔子苷對照品溶液(含梔子苷40.92 μg/mL)，精密量取，在“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積值。RSD為0.6%，表明儀器的精密度良好。結(jié)果見表1。

2.3.5 重復(fù)性考察 取梔榆洗劑(批號(hào)S2020004)6份，按“2.3.2.1”供試品制備方法處理，記錄峰面積，計(jì)算梔子苷含量，結(jié)果每1 mL樣品中的平均梔子苷含量為0.08229 mg，RSD為1.8%，表明本方法的重復(fù)性良好。結(jié)果見表2。

2.3.6 穩(wěn)定性考察 取梔榆洗劑(批號(hào)S2019004)供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積。結(jié)果梔子苷的RSD為0.26%。表明在24 h內(nèi)供試品溶液質(zhì)量穩(wěn)定。結(jié)果見表3。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批梔榆洗劑(批號(hào)S2020004)5.00 mL共6份，精密量取，再分別精密加入濃度為0.0409 mg/mL的對照品溶液5.0 mL，按“2.3.2.1”項(xiàng)下的方法處理，制備供試液，分別測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。

表1 精密度考察結(jié)果

表2 重復(fù)性考察結(jié)果 (n=6)

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)測定結(jié)果 (n=6 )

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.3.8 專屬性試驗(yàn) 取陰性對照樣品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，色譜圖如圖3所示。結(jié)果色譜圖中在梔子苷相應(yīng)出峰位置未出現(xiàn)干擾峰。

A.梔子苷標(biāo)準(zhǔn)對照品圖;B.陰性樣品圖;C.供試品圖圖4 高效液相色譜圖

2.3.9 樣品測定 取不同批次的供試品3批，精密量取，分別制備成供試品溶液，制備方法見“2.3.2.1 ”項(xiàng)下，測定色譜條件見“2.3.1”項(xiàng)下。按上述色譜條件測定峰面積積分值，以外標(biāo)法計(jì)算梔子苷含量。通過試驗(yàn)確定3批梔榆洗劑中每1 mL梔榆洗劑中含梔子以梔子苷計(jì)(C17H24O10)計(jì)，結(jié)果見表5。

結(jié)果分析：通過對梔榆洗劑中梔子苷的含量測定的方法學(xué)研究，可以看出采用的高效液相色譜法具有強(qiáng)專屬性、高靈敏度、重現(xiàn)性好、高準(zhǔn)確度的特點(diǎn)。

3 討論與結(jié)論

梔榆洗劑是由11味中藥飲片以水為溶媒經(jīng)滲漉、煎煮提取制成的醫(yī)院制劑，成份復(fù)雜。經(jīng)系統(tǒng)性預(yù)試驗(yàn)考察表明該制劑主要含有生物堿、黃酮類成分。

表5 樣品含量測定結(jié)果 (n=3)

定性試驗(yàn)結(jié)果僅有苦參和防風(fēng)成分供試品與對照品在相應(yīng)位置上主斑點(diǎn)顯色清晰、陰性對照無干擾的。在此基礎(chǔ)上對有苦參、防風(fēng)薄層色譜方法的展開系統(tǒng)、供試品提取和前處理方法、點(diǎn)樣方式和點(diǎn)樣量進(jìn)行篩選優(yōu)化，再對方法的耐用性進(jìn)行考察。如苦參，參考文獻(xiàn)[1-2]分別用乙酸乙酯、甲醇、鹽酸加乙酸乙酯、濃氨加三氯甲烷共4種方法進(jìn)行前處理提取，結(jié)果以三氯甲烷提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果最理想。防風(fēng)參考文獻(xiàn)[3-4]分別用丙酮、乙酸乙酯、水飽和正丁醇、甲醇、乙醇對供試品蒸干殘?jiān)M(jìn)行提取，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以甲醇提取效果最好。最后根據(jù)實(shí)驗(yàn)綜合結(jié)果確認(rèn)了本次的實(shí)驗(yàn)方法。

定量檢測選擇梔子苷作為含量控制指標(biāo)。梔榆洗劑中君藥經(jīng)查詢文獻(xiàn)沒有特征性成分，梔子做為處方中的臣藥，其有效成份梔子苷[5]易溶于水，與梔榆洗劑以水為溶媒提取的工藝相適應(yīng)，故以梔子苷為控制梔榆洗劑的含量指標(biāo)進(jìn)行考察。通過方法學(xué)研究，結(jié)果表明，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.1%磷酸-乙腈(90∶10)為流動(dòng)相，檢測波長為238 nm。結(jié)果梔子苷在濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、平均加樣回收試驗(yàn)結(jié)果符合要求。

梔榆洗劑的薄層色譜鑒別方法和含量測定方法專屬性強(qiáng)、簡單易行、節(jié)約時(shí)間和成本，可用于梔榆洗劑的質(zhì)量控制。