劉宏偉 左 玲 柳建軍 許志堅 桂志明

1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，廣東 湛江524001；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 湛江 524003

紅豆杉又名紫杉、赤柏松。辛、甘，大溫，歸胃、肝經(jīng)。紅豆杉的根、莖、葉都可以入藥，具有利尿消腫、通經(jīng)止痛的作用?！侗静菥V目》記載紅豆杉具有治療傷寒、霍亂、排毒等功效。紅豆杉是世界上公認的瀕臨滅絕的天然珍稀抗癌中藥，具有解毒散結(jié)之療效，在1992年被FDA批準用于治療晚期肺癌、卵巢癌、子宮癌等[1]。藥理研究[2]表明紅豆杉具有誘導(dǎo)癌細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移、抑制血管生成、影響癌細胞代謝周期、逆轉(zhuǎn)腫瘤多耐藥性等抗癌藥理作用，其提取物紫杉醇對晚期乳腺癌、卵巢癌、消化道腫瘤、非小細胞肺癌等有明顯療效，總有效率高達75%以上，對膀胱癌也有較好的療效[3-5]。維康醇(Alteronol)是從云南紅豆杉樹皮中分離提取出微生物菌誘變株，對其菌絲體進行特殊發(fā)酵、純化而獲取的一種新型單體化合物，其分子式為C20H14O6，分子量為350.3，是維泰醇(Alternol，C20H16O6，分子量為352.3)的同型異構(gòu)體[6]，與臨床上常用抗腫瘤藥物紫杉醇的來源相同[7]。

研究[6，8]表明維泰醇類化合物能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖，但對維康醇的研究不多。維康醇不僅可以抑制白血病HL-60細胞[9]、肝癌細胞[10]的增殖，而且可以誘導(dǎo)肺癌及前列腺癌細胞的凋亡[11-12]。目前維康醇對膀胱癌細胞的作用未明，本研究擬探討維康醇對膀胱癌細胞增殖、周期的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人膀胱癌T24細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.1.2 藥物、試劑及儀器 維康醇(汕頭市雙駿生物科技有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；青霉素/鏈霉素、MTS、Propidium Iodide、RNase A購自Sigma公司；細胞培養(yǎng)箱購自BINDER公司；SPARK 10 M酶標儀(TECAN公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；QuantstudioTMDX system實時熒光定量 PCR儀(Applied Biosystems公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液將T24細胞制備成細胞懸液，置于37 ℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每1～2天換液，取對數(shù)生長期細胞用于實驗研究。

1.2.2 MTS法檢測維康醇對T24細胞增殖的影響將T24細胞鋪于24孔板，24 h后分別用不同濃度的維康醇(4、8、12、16 μmol/L)進行處理，對照組用等體積RPMI-1640培養(yǎng)基替代，48 h后收集上述五組細胞，重懸細胞并計數(shù)，以1×103個/孔接種于 96 孔板中，每個孔 200 μL，放在37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，然后向每個孔加入 20 μL MTS 溶液，置于細胞培養(yǎng)箱中孵育 2 h，選取 492 nm 波長，在酶標儀上測定OD值，重復(fù)三次，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(Atreat-Ablank)/(Acontrol-Ablank)×100%。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 收集經(jīng)維康醇處理24 h后的T24細胞于離心管中，離心去培養(yǎng)液，加入3 mL預(yù)冷的70%乙醇，用槍頭吹打使細胞分散，置于4 ℃冰箱過夜，然后離心去乙醇，用PBS洗滌2次，加入0.05 mg/mL的Propidium Iodide和0.5 mg/mL的RNase A，避光下染色 30 min，上流式細胞儀檢測細胞周期比例。

1.2.4 實施熒光定量PCR 收集經(jīng)維康醇不同處理組的T24細胞，RNAiso提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。將cDNA稀釋10倍，按 10 uL 反應(yīng)體系采用兩步法進行PCR擴增。所用引物如下：CyclinD1-F：GCATGTTCGTGGCCTCTAAG，CyclinD1-R：CGTGTTTGCGGATGATCTGT；CDK4-F： AGTGTGAGAGTCCCCAATGG；CDK4-R： CCTTGATCTCCCGGTCAGTT；p21-F： TGCCCAAGCTC TACCTTC C，p21-R： CAGGTCCACATGGTCTTCCT；GAPDH-F：GGAGCGAGATCCCT CCAAAAT；GAPDH-R：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。反應(yīng)條件：95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸40 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt統(tǒng)計分析。

1.2.5 Western blot 用12 μmol/L的維康醇孵育T24細胞，48 h后棄培養(yǎng)基，PBS清洗一次，加入RIPA裂解液，收集對照組和處理組蛋白，BCA法測定蛋白濃度，按比例加入loadingbuffer，98 ℃ 5 min 進行蛋白變性。每孔加入30 μg蛋白進行電泳，濃縮膠設(shè)置80 V，分離膠設(shè)定100 V，電泳 90 min。然后采用PVDF膜進行轉(zhuǎn)膜，250 mA，2 h。5%脫脂奶粉封閉1 h，分別孵育Cyclin D1、CDK4、p21兔多克隆抗體(1∶1000，proteintech公司)及GAPDH鼠單克隆抗體(1∶10000，ABclonal公司)，4 ℃過夜。TBST洗膜，室溫下孵育二抗1 h，洗膜后加入化學(xué)發(fā)光液曝光拍照。

2 結(jié)果

2.1 維康醇呈濃度依賴性抑制膀胱癌細胞增殖 以不同濃度的維康醇(4、8、12、16 μmol/L)處理膀胱癌T24細胞48 h，細胞增殖抑制率逐漸增加，分別為9.33%、16.26%、50.56%和61.03%。不同濃度維康醇組OD值與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 不同濃度維康醇對膀胱癌T24細胞增殖的影響

2.2 維康醇呈時間依賴性抑制膀胱癌細胞增殖 以12 μmol/L的維康醇作用于膀胱癌T24細胞，分別作用24、48、72、96 h，MTS結(jié)果顯示隨著時間的延長，維康醇對T24細胞的抑制率逐漸增加，維康醇處理96 h后，細胞的抑制率達74.30%，說明維康醇抑制T24細胞增殖存在時間依賴性。見表2。

2.3 維康醇對膀胱癌細胞周期及相關(guān)蛋白的影響 流式細胞術(shù)測定細胞周期結(jié)果顯示，當以12 μmol/L的維康醇處理T24細胞24 h后，G1期比例由38.77%升至52.01%，S期比例由47.30%降至38.11%，G2期比例稍有下降(圖1A)，進一步對周期相關(guān)蛋白基因進行qRT-PCR和western blot檢測，結(jié)果顯示，與對照組相比，維康醇作用的T24細胞中CDK4和Cyclin D1的mRNA和蛋白水平顯著降低，p21的mRNA和蛋白水平明顯上調(diào)(圖1B、1C)。

表2 不同作用時間維康醇對膀胱癌T24細胞增殖的影響

A.維康醇處理T24后細胞周期改變；B.維康醇處理T24后Cyclin D1、CDK4、p21 mRNA 水平變化(**P<0.01)；C.維康醇處理T24后Cyclin D1、CDK4、p21 蛋白水平變化圖1 維康醇對細胞周期及周期蛋白表達水平的影響

3 討論

維康醇是從云南昆明紅豆杉樹皮中提取、合成的一種新型單體化合物。研究[13]表明，維康醇可通過引起細胞周期阻滯、抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡等發(fā)揮其抗癌作用。如維康醇可能通過線粒體調(diào)控的內(nèi)源通路誘導(dǎo)肺癌A549細胞的凋亡[11]，通過下調(diào)細胞周期蛋白CyclinD1和細胞周期蛋白依賴性激酶的底物磷酸化的Rb蛋白表達抑制白血病HL-60的增殖[9]。維康醇還可以抑制Akt/mTOR和TGFβ/Smad3通路，與自噬抑制劑3-MA聯(lián)合應(yīng)用不僅能顯著抑制黑色素瘤的生長，而且能抑制腫瘤的侵襲和遷移[14]。維康醇和阿霉素聯(lián)合應(yīng)用可顯著抑制乳腺癌4T1細胞周期相關(guān)蛋白CDC2和Cyclin B1的表達水平[15]，誘導(dǎo)細胞周期阻滯于G2/M期，從而抑制細胞增殖[16]。維康醇誘導(dǎo)前列腺癌細胞死亡的方式主要為時間依賴性的晚期凋亡，其效果優(yōu)于傳統(tǒng)化療藥物伊立替康(CPT-11)、多西他賽及紫杉醇[12]。本研究采用不同濃度的維康醇干預(yù)膀胱癌T24細胞，結(jié)果表明維康醇顯著抑制細胞增殖，存在時間和劑量依賴性，說明維康醇亦對膀胱癌發(fā)揮一定的抗癌作用。

G1/S期和G2/M期是細胞周期的兩個關(guān)鍵限制點，其中G1/S期在啟動細胞周期過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為了探討維康醇抑制膀胱癌增殖的作用機制，進一步檢測了其對細胞周期的影響，結(jié)果顯示維康醇處理后T24細胞的G1期比例明顯增加，S期比例明顯下降，與既往研究結(jié)果一致。劉亮亮等[9]研究發(fā)現(xiàn)以1.6 μg/mL維康醇孵育白血病HL-60細胞24 h后，細胞的G1期比例由34.9%增加至53.0%，S期比例由54.4%減少至32.9%。在G1/S限制點，CyclinD1、CyclinE分別與CDK4、CDK2形成激酶復(fù)合物，促進細胞周期G1/S轉(zhuǎn)化，促進細胞異常增殖、惡變。HeLa細胞經(jīng)維康醇處理后，Cyclin D1和CDK4蛋白水平顯著下降[17]。本研究同樣表明，維康醇處理膀胱癌細胞24 h后 Cyclin D1和CDK4表達明顯下調(diào)，p21表達上調(diào)，說明維康醇可能通過下調(diào)Cyclin D1和CDK4表達，上調(diào)p21表達，使T24細胞在G1期受阻，進而抑制膀胱癌細胞的增殖。

誘導(dǎo)細胞凋亡是抗腫瘤藥物研發(fā)的作用機制之一，目前研究報道大多數(shù)腫瘤細胞經(jīng)維康醇處理后出現(xiàn)了凋亡現(xiàn)象，如30 μmol/L維康醇作用于HepG2細胞48 h后，細胞凋亡率顯著升高[10]。唐宇哲等通過維康醇孵育前列腺癌PC3細胞12 h，PC3晚期細胞凋亡率達14.8%±1.2%，明顯高于正常前列腺細胞株BPH1的6.8%±1.1%[12]，但經(jīng)維康醇處理的前列腺癌細胞株DU145和白血病HL-60的凋亡比例較低，均低于10%[9, 12]。維康醇是否也誘導(dǎo)膀胱癌細胞凋亡有待進一步研究。

綜上所述，維康醇能夠抑制膀胱癌T24細胞的增殖，其可能與下調(diào)Cyclin D1和CDK4表達，上調(diào)p21表達，導(dǎo)致細胞G1期阻滯有關(guān)，但其深入機制有待后續(xù)進一步研究。