張亞麗，郭順萍，尚學峰，李 杰，黃曉宇,2，滾雙寶,2*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省現(xiàn)代養(yǎng)豬工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730070）

近年來，受非洲豬瘟疫情的影響，我國豬肉價格一路飆升，養(yǎng)豬業(yè)作為我國畜牧業(yè)的支柱性產(chǎn)業(yè)，受到了越來越多的關注。隨著我國畜牧業(yè)的集約化、規(guī)?；l(fā)展，飼料原料成為制約養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要因素。我國作為世界上花椒種植規(guī)模最大、種類最全的國家，擁有大量的花椒資源?；ń纷鳛橹参镄燥暳?，分為花椒果皮和花椒籽兩部分，花椒果皮是人們常用的食用調(diào)料，可以被充分利用，然而花椒籽作為花椒生產(chǎn)的主要副產(chǎn)物，并沒有得到充分利用，大量的花椒籽被隨意丟棄，造成了資源浪費?；ń纷褷I養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，油脂和蛋白質(zhì)含量高，是一種優(yōu)質(zhì)的飼料資源。目前，已有試驗證實用5%的花椒籽代替玉米作為能量飼料，對育肥豬生長性能和胴體品質(zhì)具有積極作用。

肌纖維是肌肉的基本組成單位，主要由肌球蛋白和肌動蛋白構(gòu)成，肌球蛋白由4條輕鏈（MLC）和2條重鏈（MyHC）構(gòu)成，豬的肌纖維根據(jù)肌球蛋白重鏈（MyHC）的多態(tài)性可分為1、2a、2b和2x四種類型，在代謝上分別與慢速氧化型、快速氧化型、快速酵解型和中間類型相對應[1]。還有學者將肌纖維分為兩類，即氧化型和酵解型。氧化型肌纖維含有的細胞色素、線粒體和肌紅蛋白多，又被稱為紅肌纖維，酵解型的肌纖維中細胞色素、線粒體和肌紅蛋白少，被稱為白肌纖維。肌纖維類型及組成不僅決定豬骨骼肌的生長發(fā)育類型，而且影響豬肉的生物化學性質(zhì)和感官品質(zhì)，是預測家畜肉質(zhì)性狀的常用指標[2]。以往學者應用實時熒光定量技術比較了中國地方品種豬和引入豬種4種MyHC亞型mRNA在豬背最長肌和半膜肌中的表達水平差異性，初步揭示了肌纖維類型的組成和表達量對豬肉品質(zhì)具有內(nèi)在的影響作用，揭示了品種的特性[3]。也有學者通過研究得出豬的腰大肌與背最長肌相比，具有相對豐富的2a型和2x型肌纖維，擁有更少量的2b型肌纖維，因而肉的品質(zhì)更佳[4]。本試驗研究豬MyHC-2a基因的調(diào)控機制，通過熒光定量技術研究其在不同比例花椒籽飼喂的育肥豬各組織中的表達情況，為花椒籽作為豬飼料的應用、今后豬肉品質(zhì)的改良和育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

以甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院動物遺傳繁殖實驗室保存的試驗組和對照組生長育肥豬的心、肝、脾、肺、腎、背肌等組織樣品作為試驗樣品。具體試驗過程如下：試驗選擇健康的90日齡杜×（長×大）三元豬288頭，預試驗7 d，隨機分為4組，每組4個重復，每個重復18頭，以飼喂基礎日糧為對照組，花椒籽等量代替2.5%、5%、7.5%的玉米飼糧，分別作為試驗組Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組，飼喂期100 d，自由采食，飼喂期滿，屠宰。宰殺后，在無菌條件下，采集試驗Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和對照組的各組織樣品備用，迅速放于液氮中，保存在實驗室-80℃冰箱中。

1.2 主要試劑、耗材

Trizol試劑，PrimeScript ? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，育肥豬各組織的cDNA，MyHC-2a基因的上下游引物，無酶水，內(nèi)參等。

1.3 引物設計與合成

以GenBank中豬MyHC-2a基因核苷酸序列和氨基酸序列（NM_214136.1和NP_999301.1）為參考，采用NCBI中的Primer Premier 5.0設計MyHC-2a基因的熒光定量PCR特異性引物，引物由金唯智生物公司合成，引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物設計

1.4 總RNA提取和cDNA合成

采用Trizol萃取法提取試驗組和對照組育肥豬的心、肝、脾、肺、腎和背肌等組織的總RNA，運用瓊脂糖凝膠電泳實驗和微量分光光度計分別檢測RNA的完整性和純度，將得到的cDNA保存在實驗室-20℃的冰箱中。

1.5 實時熒光定量PCR

實時熒光定量反應體系為20 μl，上下游引物各0.8 μl，cDNA模板2 μl，SYBR酶10 μl，RNase Free H2O補足至20 μl。熒光定量反應條件為95℃，5 min；94℃，30 s；61℃，30 s；72℃，1 min；35個循環(huán)。每個組織做4個樣品，每個樣品同批次做3個復孔。以2-ΔΔCt法計算相對表達量，數(shù)據(jù)用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析，表達量的結(jié)果均以平均數(shù)±標準差表示，最終結(jié)果通過Graphpad Prism 8.0以圖片的形式展現(xiàn)出來。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因擴增曲線

通過圖1和圖2可以得知，MyHC-2a基因和內(nèi)參基因在擴增時，指數(shù)期條帶走向一致且清晰，由此說明cDNA的濃度合適，適用于該試驗進行熒光定量分析。

圖1 MyHC-2a基因的擴增曲線

圖2 內(nèi)參基因的擴增曲線

2.2 基因溶解曲線

通過圖3和圖4可知，MyHC-2a基因和內(nèi)參基因的溶解曲線的多個重復均曲線一致性較好，沒有多余的雜帶出現(xiàn)，證明試驗設計的引物良好，適合后續(xù)的試驗分析。

圖3 MyHC-2a基因的溶解曲線

圖4 內(nèi)參基因的溶解曲線

2.3 MyHC-2a基因在不同組織中的表達分析

采用qPCR方法檢測對照組、試驗Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組育肥豬各組織中MyHC-2a基因的表達情況。結(jié)果表明：在育肥豬的脾和肺組織中，試驗Ⅰ組中MyHC-2a基因的表達量均顯著高于對照組、試驗Ⅱ組和Ⅲ組，對照組MyHC-2a基因的表達量顯著高于試驗Ⅱ組和Ⅲ組，而試驗Ⅱ組和Ⅲ組MyHC-2a基因的表達量差異不明顯；在育肥豬的心、腎和背肌等組織中，對照組MyHC-2a基因的表達量均顯著高于試驗Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組，其中心組織中試驗Ⅰ組MyHC-2a基因的表達量高于試驗Ⅱ組和Ⅲ組，而試驗Ⅱ組和Ⅲ組MyHC-2a基因的表達量差異不明顯。在腎和背肌中，試驗Ⅰ組和Ⅲ組MyHC-2a基因的表達量顯著高于試驗Ⅱ組，但試驗Ⅰ組和Ⅲ組MyHC-2a基因的表達量差異不明顯；在育肥豬的肝組織中，對照組MyHC-2a基因的表達量均顯著高于試驗Ⅱ組和Ⅲ組，試驗Ⅱ組和Ⅲ組MyHC-2a基因的表達量差異不明顯（見圖5）。

圖5 對照組和試驗組育肥豬的不同組織中MyHC-2a基因的表達分析

3 討論

花椒作為優(yōu)質(zhì)的飼料資源，擁有豐富的油脂和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，且價格低廉，目前對于花椒籽的研究主要停留在蛋雞方面，在生豬方面研究很少。鮮凌瑾研究表明，添加1.0%的花椒籽有利于雛雞提高體重和飼料轉(zhuǎn)化率[5]。付興周等研究得出添加花椒籽粉能夠減慢肌肉pH下降的速度，從而延長鮮肉的保存時間[6]。

肌肉中肌纖維類型組成對肌肉功能及屠宰后肉品質(zhì)量產(chǎn)生重要影響，不同品種的豬肌肉組織因能量代謝方式不同，經(jīng)常會導致肌纖維類型分布不同，進而造成肉品質(zhì)差異較大[7]。有許多研究表明肌纖維的類型和組成會直接影響豬肉品質(zhì)，營養(yǎng)和品種等因素不會影響肌纖維的數(shù)量，只會影響肌纖維的類型轉(zhuǎn)化[8]。梁永飛等通過向生長育肥豬的飼料中添加一定比例的花椒籽實，得出添加花椒籽對育肥豬豬肉的肉色、脂肪酸結(jié)構(gòu)改善具有積極作用[9]。本次試驗結(jié)果表明：不同比例花椒籽飼喂育肥豬后，育肥豬的肝、脾和肺組織中MyHC-2a基因高表達，育肥豬的心和背肌組織中MyHC-2a基因低表達；在育肥豬的心、脾和肺等組織中，對照組和試驗Ⅰ組MyHC-2a基因的表達量顯著高于試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組；在育肥豬的肝組織中，對照組MyHC-2a基因的表達量顯著高于試驗Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組，說明不添加花椒籽或添加2.5%的花椒籽有利于MyHC-2a基因的表達。MyHC-2a基因?qū)氖羌t肌纖維，楊海玲等研究表明，紅肌纖維含量高的肌肉不易產(chǎn)生PSE肉且紅肌纖維含有的脂類多，分解和積累脂肪的能力強，更易形成肥美多汁、品質(zhì)優(yōu)良的大理石花紋肉[10]。相類似的，歐秀瓊等研究表明，肌肉品質(zhì)與酵解型肌纖維含量的高低呈負相關，而氧化型肌纖維的含量越高，動物屠宰后胴體的肌肉顏色、風味和多汁性等品質(zhì)越好[11]。辛雪等通過對巴美肉羊進行研究，得出MyHC-2a型肌纖維數(shù)量越多，肉質(zhì)越軟，剪切力越低[12]，Yanru Hou等人通過對蒙古羊的放牧組和禁閉組進行比較分析，也得到了相同的結(jié)果[13]。就肌纖維直徑而言，氧化型肌纖維（如MyHC-2a型）直徑較細，酵解型肌纖維（如MyHC-2b型）直徑較粗[14]。肌纖維直徑越小，面積越小，密度越大，肌肉剪切力越小，肉質(zhì)越好[15]。這些結(jié)果均說明MyHC-2a型肌纖維的表達量對肉質(zhì)的感官、色澤和口感都具有十分重要的作用。

4 結(jié)論

不添加花椒籽或添加2.5%的花椒籽有利于MyHC-2a基因的表達，添加5%或7.5%的花椒籽對MyHC-2a基因的表達有負面影響。本研究可為花椒籽的利用和將來深入探討MyHC-2a基因在改良肉質(zhì)和促進育肥豬肌肉的生長發(fā)育方面提供參考。