鐘為章，馮衛(wèi)博，許 彬，寧志芳，秦 學，李再興

(1.河北科技大學環(huán)境科學與工程學院，石家莊 050018；2.河北省污染防治生物技術實驗室，石家莊 050018)

據統計，2019年中國抗生素產量達21.8萬t，占全球市場總量的70%以上[1]?？股鼐强股亟洶l(fā)酵液提取后所剩余的殘渣，主要由剩余培養(yǎng)基、菌絲體、代謝中間產物和殘留抗生素組成[2]。按照生產1 t抗生素生成8～10 t濕菌渣估算[3]，2019年中國抗生素菌渣生成量高達約200萬t。因其中殘留抗生素，如果對其處理不當，會造成嚴重的生態(tài)環(huán)境問題，威脅人類健康。依據《國家危險廢物名錄(2021年版)》，抗生素的培養(yǎng)基廢物、中間體為危險廢物，其處理處置已較大限制中國制藥行業(yè)的發(fā)展。焚燒處理和安全填埋，存在著占地面積大、處置成本高和二次污染等問題，而且容易造成菌渣中大量有用有機物的浪費[4-6]。

抗生素菌渣菌絲體中含有多種可利用的活性物質，如蛋白質、殼聚糖、麥角固醇等。其中，蛋白質含量豐富，占干物質的30%～40%，麥角固醇是真菌細胞膜的重要組成部分[7]，而細胞壁上均含有殼聚糖[8]。因此，在抗生素菌渣無害化處理的前提下，其資源化利用已成為相關研究領域的重要課題。

由于抗生素菌渣含有豐富的活性物質，通過微生物發(fā)酵技術將其制成飼料及肥料，但后續(xù)發(fā)現這些產品會造成抗生素殘留在動植物體內產生富集作用，從而進一步地影響人類的健康，因此許多國家都禁止將抗生素菌渣作為飼料添加劑[9]。而將抗生素菌渣中有效活性物質提取出來加以利用，可以很好地解決抗生素殘留造成的不良影響。

現綜述近幾年運用物理、化學和生物法等方法從菌渣中提取蛋白質、殼聚糖和麥角固醇等活性物質的工藝研究進展，分析各提取工藝的優(yōu)劣。最后通過結合抗生素菌渣的特性，分析從抗生素菌渣中提取活性物質的問題，并對其解決方案進行展望。

1 蛋白質

1.1 提取現狀

蛋白質作為生命的物質基礎，在各種生命活動中起著極其重要的作用。由于抗生素菌渣中菌絲體具有剛性細胞壁，胞內蛋白質釋放困難，難以充分利用。因此，從抗生素菌渣中提取蛋白質的關鍵環(huán)節(jié)是實現高效水解，對其進行破壁溶胞。常用的方法包括物理、化學、生物化學和組合技術。其中，物理方法包括超聲波、熱、微波和高壓噴射法等?；瘜W方法包括酸熱、堿熱、pH調節(jié)等。生化方法包括酶處理、輔助酶處理、嗜熱菌。不同的方法與其蛋白質回收效率密切相關，并且蛋白質的水解產物對蛋白質產物的后續(xù)利用具有顯著影響。

物理法如微波輻射法是在微波的照射下，抗生素菌絲體吸熱，細胞壁裂解，使其中的蛋白質等物質溶于液體中，優(yōu)點在于反應速率快，但是前期投入較大。韓洪軍等[10]采用微波輻射法處理青霉素菌渣，在菌渣含水率為90%、微波輻射功率414 W下處理120 s，達到最佳的破壁效果，蛋白質溶出濃度為265.76 μg/mL。Cai等[11]采用微波法處理頭孢霉素菌渣，在含水率為92.5%、微波輻射功率300 W下處理800 s，達到最大的破壁效果，上清液中溶解性蛋白濃度達到6 332.69 mg/L，相較于初試濃度提高了28.4%?；瘜W法是指在強酸或者強堿的作用下，使細胞壁裂解，溶出蛋白質，同時因為抗生素菌渣大多在堿性條件下易溶解，而在酸性條件下會發(fā)生等電點沉淀，所以常用堿解法，優(yōu)點在于反應溫度等條件限制不大，但是反應需要加入大量藥品。王賀飛等[12]運用酸法處理土霉素菌渣，在菌渣含水率96%、pH1.0、反應溫度120 ℃下處理4 h，蛋白質最高溶出率達到29.96%，溶出濃度達到4 784.2 mg/L。王賀飛[13]還利用堿/超聲聯合法處理土霉素菌渣，在菌渣含水率97%、pH13.0、聲能密度7.5 W/mL下反應30 min，蛋白質溶出率為84.11%，溶出濃度達到19 710.94 mg/L。劉玲[14]運用堿法處理青霉素菌渣，在pH9.0、常溫下處理60 min，此時蛋白提取率為60%；在加熱環(huán)境下，溫度40 ℃下處理60 min，蛋白質提取率可達到92.1%，其原因可能是溫度越高，底物被活化的分子越多，越有利于反應速率的加快。生物破壁法是通過直接投加酶或者投加菌，使其在生長過程中產生酶，特定酶作用于抗生素菌絲體細胞壁上，使其斷裂，胞內蛋白質溶出，孟文茹[15]用嗜熱菌DF7在最佳水解溫度60 ℃、最佳投加比10%(V/V)下處理頭孢霉素菌渣，熒光素二乙酸酯(fluorescein diacetate,FDA)水解酶活性可達333.45 μgFDA/(mL·h)，為對照組的3.2倍；溶解性蛋白質濃度達到182.46 mg/L，為對照組的1.4倍。

對比物理法、化學法及聯合法，生物處理技術具有低能耗、低污染、低成本、高效安全等優(yōu)點，其越來越受到重視。尤其利用嗜熱菌分泌的胞外酶對菌渣進行生物溶胞，更是發(fā)展前景廣闊，是其資源化有效利用的新途徑。

1.2 應用現狀

抗生素菌渣中提取的蛋白質用途眾多，可作為發(fā)泡劑原料制備泡沫蛋白滅火劑及泡沫混凝土，也可制備肥料、用作動物飼料添加劑等[16-18]。其具有較高的多肽含量，更有利于蛋白質發(fā)泡劑的制備。菌渣蛋白質泡沫滅火劑可用于撲滅易燃液體引起的火災，但是要檢驗與傳統的滅火器相比的滅火效果。菌渣泡沫混凝土具有良好的隔熱、保溫、隔音、抗凍等性質，無微生物污染和重金屬超標的安全隱患，能夠滿足行業(yè)標準。

從菌渣中提取的蛋白質具有高含量的氨基酸，適合用于制備動物飼料。中國的蛋白質飼料嚴重缺乏，導致中國飼料行業(yè)過度依賴于大豆進口，嚴重阻礙了中國飼料業(yè)和畜牧業(yè)的發(fā)展[19]。提取抗生素菌渣中的蛋白質用于蛋白質飼料的生產具有現實意義，但因中國對于危險廢物的資源化利用管理嚴格，沒有相關的文件規(guī)定蛋白質飼料中檢測抗生素殘留的方法。因此，在保證與傳統飼料具有相同營養(yǎng)價值的同時，需要保證其安全性，不會對動物、人類和生態(tài)產生不良影響。

張蒙蒙等[20]對青霉素菌渣提取的氨基酸進行分析，對比發(fā)現其與大豆蛋白飼料中的氨基酸相同，說明其具有作為蛋白質飼料的潛力。但是其未對蛋白質進行抗生素殘留檢測、有毒物質檢測、急性毒性試驗檢測以及重金屬含量等的檢測?！队袡C肥料中土霉素、四環(huán)素、金霉素與強力霉素的含量測定高效液相色譜法》(GB/T 32951—2016)為抗生素菌渣提取蛋白質的資源化利用提供了參考。

2 殼聚糖

2.1 提取現狀

殼聚糖(chitosan)又名脫乙酰甲殼素，是在堿性條件下通過甲殼素部分脫乙酰之后得到的一種天然氨基多糖，具有良好的生物降解性、抗氧化性和抗菌性等特性，其脫乙酰度的不同，是影響殼聚糖性能的最重要的化學特征之一[21]。甲殼素和殼聚糖是豐富的天然有機化合物，被認為是具有巨大未來潛力的材料，具有進行結構修飾以賦予所需特性和功能并增加其在各種科學領域中無數應用的巨大可能性[22]。甲殼素廣泛存在于海洋甲殼類動物的外殼及真菌、植物的細胞壁中[23-24]。目前主要以蝦、蟹殼為原料，采用化學法提取殼聚糖，可以有效去除有機鹽[25-26]。但是殼聚糖的理化特性因批次而異，這是由于蝦、蟹原料的季節(jié)性、殼的質量、存在的物種、氣候和過程控制的困難。因此，近年來中外有關從易培養(yǎng)且產量穩(wěn)定的真菌中提取殼聚糖研究也越來越多。

殼聚糖提取的關鍵在于對其脫乙酰基的研究。王傳芬[27]以青霉素菌渣為原料提取殼聚糖，首先利用3%的HCl蒸餾處理，然后用15%的NaOH蒸餾處理，固液比均為1∶15，去除其中的蛋白質。其次將雙氧水脫色后的菌渣在50%NaOH處理2.5 h，固液比1∶15，溫度110 ℃的條件下進行脫乙酰反應從而制備殼聚糖，殼聚糖產量為13.02%。其生產的殼聚糖的產品性能指標與殼聚糖標準比較，所得產品優(yōu)良，達到食品級要求。由于濃堿法會容易對環(huán)境造成污染，Sebastian等[28]以真菌為原料提取殼聚糖，在微波功率300 W下反應22 min，在1N NaOH下脫乙酰提取殼聚糖，使蛋白質降解，其脫乙酰化程度可達94.6%，較常規(guī)加熱法提高10%，殼聚糖產率為14.43%。魏燕等[29]采用電解高壓的方法從發(fā)酵后的黑曲霉中提取殼聚糖。首先在菌株與3%NaOH溶液的體積比為1∶12，電壓為8 V條件下電解1.25 h，去掉蛋白質和脂類等有機物，再在堿性條件下，表壓689.5 Pa，121 ℃，反應2 h，再脫乙酰得到殼聚糖，其脫乙酰程度為89.81%，殼聚糖產率為15.6%。但該工藝相對比較復雜，且能耗較大。此外，長時間使用高濃度化學試劑可能會導致聚合物過度水解，溶解的蛋白質和礦物質也不能用作人和動物的營養(yǎng)物質。這些條件會產生大量廢物，并嚴重污染環(huán)境。

因此，生態(tài)友好的生物法近年來越來越受到關注，其還能防止由酸和堿處理引起的不規(guī)則的脫乙?；头肿淤|量降低的問題。由于從抗生素菌渣中提取殼聚糖的研究較少，參考其他真菌的生物法提取。Cai等[30]采用溶菌酶、中性蛋白酶和甲殼素脫乙酰酶提取檸檬酸廢菌體中的殼聚糖，酶在應用過程中可以通過固定化酶技術，使其不溶于水，增加酶的重復使用率。

2.2 應用現狀

殼聚糖作為一種天然的高分子材料，由于其生物降解性、生物相容性、抗菌性、抗氧化劑活性和高安全性，現廣泛應用于食品加工、藥物合成、保健品、水處理等領域[31-33]。

殼聚糖具有優(yōu)異的生物學特性，可以抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，發(fā)揮抗氧化活性和抑制轉移，這主要取決于活性基團中的氨基、羥基可以與自由基反應。同時，其具有良好的生物可降解性，具有清除能力。因此，在生物醫(yī)藥領域[34]，殼聚糖及其不同化合物廣泛應用于可再生醫(yī)學[35]、抗腫瘤活性[36]和抗菌劑[37]等方面。殼聚糖中游離的氨基和羥基在弱堿性條件下產生正電荷[38]，可以有效中和帶負電荷的藻類細胞，產生消毒副產物，可以除去水中的有機污染物，且由于其自身可降解，不會形成二次污染[39]。在水處理中，可應用于絮凝[40]、金屬離子吸附[41]、染料脫色[42]等領域。

殼聚糖在食品保鮮等方面也起著重要的作用，由其制作的薄膜具有良好的生物相容性、化學穩(wěn)定性、無毒無害等特性。殼聚糖薄膜不僅阻隔了空氣進入膜內，同時也能抑制病原微生物與果蔬接觸，而且可以使細胞呼吸的二氧化碳順利排出，從而達到果蔬保鮮的目的。同時殼聚糖及其衍生物的抗菌性和抗氧化性等特性也可以有效地抑制肉類的脂肪氧化，防止其中的蛋白質變性，延緩腐敗，抑菌保鮮，延長肉類的高品質時期[43-46]。

3 麥角固醇

3.1 提取現狀

麥角固醇又名麥角甾醇，是真菌細胞膜的主要成分之一，被廣泛用作活菌生物量的指標分子[47]。游離的麥角固醇在細胞膜的流動性、滲透性和完整性中起重要作用，酯化的麥角固醇在固醇穩(wěn)態(tài)中起作用[48]。目前，麥角固醇主要從酵母菌、霉菌和真菌中，運用物理化學方法提取，但其生長周期長，生產成本較高。因此，每年產量巨大的抗生素菌渣則成為麥角固醇提取的新來源，不僅降低了成本，而且解決了抗生素菌渣的環(huán)境問題，適用于工業(yè)化。

麥角固醇的提取過程為需先裂解細胞壁，再加入堿與醇混合使其皂化，最后通過有機溶劑萃取劑將麥角固醇提取出來。Wang等[49]以黃青霉素菌絲體為原料，通過堿熱法破壁，采用NaOH將麥角固醇皂化以游離的形式釋放，最后用石油醚將麥角固醇萃取出來。由于石油醚會危害環(huán)境，并且其蒸汽會影響人類健康，不適宜用于工業(yè)生產。劉玲等[50]以青霉素廢菌絲體為原料，采用堿溶液皂化麥角固醇，去掉纖維素、無機鹽和大部分蛋白，再加水酶解，使其分離純化，最后乙醇萃取和旋蒸得到麥角固醇。通過正交試驗法得到了提取麥角固醇最佳條件為：在15%NaOH條件下，物料皂化劑比1∶15，溫度85 ℃下皂化2 h，再加入2.0%堿性蛋白酶，在溫度45 ℃，pH8.0的條件下酶解2 h，得到的麥角固醇的純度為70%，提取率為95%。隨著現代生物分離和純化技術的日漸成熟，將產物產業(yè)化、工業(yè)化運行均可通過中試實驗實現。駱昆[51]對青霉素廢菌絲體中提取麥角固醇做了中試研究，對提取方法進行改進，并重選選擇了儀器設備，確定了沉降過程的絮凝劑，選擇用板框過濾法對破壁液進行固液分離，對結晶過程中的有機溶劑進行回收并重復使用。麥角固醇的提取率較試驗階段有所下降，但純度相同，可以滿足維生素D2源的要求。王滋涵等[52]提出在低溫和避光條件下從青霉素發(fā)酵菌絲體中提取麥角固醇制備微生態(tài)的工藝，不僅方法簡單，生產成本低，還能帶來可觀的經濟效益，1 t廢菌渣可產生5 000元的經濟效益。

利用抗生素菌渣提取麥角固醇不僅取得了不錯的效果，而且具有一定的生態(tài)優(yōu)勢，拓寬了麥角固醇提取來源。但也存在一定的問題，如菌渣中麥角固醇的含量少，僅有0.04%～1.6%，產量低，提取工藝復雜。在選擇有機溶劑萃取時，不僅要考慮提取率問題，還應考慮其對環(huán)境的影響。

3.2 應用現狀

麥角固醇可以增強人體抵抗疾病的能力，當機體在受到外來細菌、病毒等侵襲時，免疫系統會做出相應的反應以維持機體內環(huán)境的穩(wěn)定。麥角固醇可以抑制T淋巴細胞，增強機體免疫力[53]。并且其具有一定的抑菌活性，能對金黃色葡萄球菌等產生一定的抑制作用[54]。脂質過氧化失衡會損害人體，并與腫瘤、感染、炎癥、自身免疫性疾病以及心血管和腦血管疾病的形成有關。麥角固醇作為潛在的天然抗氧化劑，在人類抗脂質過氧化物中起重要作用[55]。同時在細胞損傷后，經過麥角固醇處理后的細胞活性氧含量降低，起到保護和修復受損細胞的作用。惡性腫瘤表現為細胞的異常生長，后向組織浸潤，引起主要器官功能衰竭，而導致死亡，這也成為當前危及人類健康的主要疾病之一。麥角固醇可以促使腫瘤細胞凋亡、抑制實體瘤生長，其衍生物可以調控蛋白的表達，繼而發(fā)揮抗腫瘤的作用[48]。抑郁癥作為一種慢性綜合征，不僅給患者帶來極大的精神痛苦，還影響社會以及家庭和諧。輕度抑郁癥以心理治療為主，而中、重度患者則以藥物治療為主，輔以心理治療。經研究發(fā)現，麥角固醇及其衍生物由γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸介導，使其產生抗抑郁活性，從而起到治理抑郁癥的作用[56]。麥角固醇也是重要的脂溶性維生素D2源，對調節(jié)體內的鈣磷代謝具有重要作用，可用于慢性低鈣血癥、低磷血癥、佝僂病及伴有慢性腎功能不全的骨軟化癥等的治療[57]，且可以作為飼料添加劑添加在飼料中，增加畜禽的產蛋率和孵化率。麥角固醇也可以作為重要的醫(yī)藥化工原科，用于生產可的松、激素黃體酮等甾醇類藥物[58]，具有良好的應用價值與發(fā)展前景。

抗生素菌渣因其產量大，生產集中，所以其后續(xù)處置困難，如果將其中的活性物質如蛋白質、殼聚糖、麥角固醇的提取過程設計合理，如圖1所示，不僅可以使菌渣達到減量化的目的，同時也可實現其資源利用最大化，工業(yè)生產前景可觀。

圖1 蛋白質、殼聚糖、麥角固醇提取工藝流程圖Fig.1 Extraction process flow chart of protein,chitosan and ergosterol

4 結論與展望

總結了近年來從抗生素菌渣中提取蛋白質、殼聚糖、麥角固醇等活性物質應用現狀，闡述了其中活性物質的應用價值和提取的必要性。但其仍然存在著諸多挑戰(zhàn)。

(1)抗性基因去除?？股鼐蚱渲械目股貧埩魡栴}，會產生抗性基因，處置不當會使微生物產生抗藥性，進而危害環(huán)境及人類健康。因此，在對菌渣進行活性物質提取的同時，應該對其中的抗性基因等進行檢測及消除，如在提取活性物質之后進行電離輻射、臭氧等[16，61-62]處理，其方法適用性有待進一步研究。

(2)相關政策支持?？股鼐苽涞幕钚晕镔|營養(yǎng)達標，但因其屬于危險固廢的特殊性，現在未能有明確的文件規(guī)定抗生素殘留在多少時對環(huán)境無影響或影響較輕，這需要研究人員對實際應用中的危害性進行試驗檢測[16,61-62]，為相關政策的出臺做理論支持。

(3)優(yōu)化提取工藝?？股鼐钚晕镔|的提取，不同工藝有不同的優(yōu)劣，工藝組合之間也有最適條件的掌控，因此尋求最適生產工藝且易于工業(yè)生產的工藝組合，需要研究者進一步的研究。

(4)后續(xù)廢渣處理?？股鼐崛』钚晕镔|之后，脫去細胞中水分的同時，會改變其中的碳氮含量，剩下的廢渣可以用作生物炭、生物油等[63-64]的制備，從而進一步達到無害化、減量化的目的。

總而言之，對抗生素菌渣的資源化利用，旨在促進制藥行業(yè)的低碳經濟、綠色經濟和循環(huán)經濟發(fā)展。而各種抗生素菌渣資源化利用方式與途徑也不盡相同。不管何種處理技術，最終目標都是要消除各種不利因素的影響，提高處理效率，降低處理成本和實現資源最大化，尋找最佳處理工藝。