張振宇 黨姝 龍桂英 羅迪 宮小桐 高乾

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林132101；第一作者：53347007@qq.com；*通訊作者：122561108@qq.com）

水稻是世界上重要的糧食作物之一，我國(guó)是世界上的水稻生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，其中粳稻占稻米消費(fèi)的1/3左右。低溫冷害指作物在其生長(zhǎng)所需適溫以下的溫度范圍內(nèi)，引起生長(zhǎng)停滯或生育障害現(xiàn)象。水稻是對(duì)溫度較為敏感的農(nóng)作物，在冷害脅迫條件下可造成作物體內(nèi)的酶蛋白活性降低甚至變性，作物各種生理機(jī)能受抑制，較為嚴(yán)重的時(shí)候會(huì)導(dǎo)致死亡[1]。水稻遭受冷害脅迫的現(xiàn)象在世界上很多國(guó)家都有發(fā)生，中國(guó)、日本和朝鮮較為嚴(yán)重。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每隔幾年就會(huì)出現(xiàn)1 次較大規(guī)模冷害[2-3]，嚴(yán)重威脅著北方粳稻的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，是限制寒地水稻生產(chǎn)潛力的主要因素。吉林省每3～5 年就會(huì)發(fā)生1 次冷害，每次平均減產(chǎn)在30%左右[4-5]。為解決水稻冷害問(wèn)題，科研工作者進(jìn)行了各種水稻耐冷性試驗(yàn)研究。

本研究以近年吉林省主栽?xún)?yōu)質(zhì)粳稻品種為材料，在冷水脅迫條件下研究不同品種的抗冷性，探討冷害脅迫下各參試品種間的產(chǎn)量及形成機(jī)制的差異，以期為抗逆優(yōu)質(zhì)粳稻品種的培育及生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

試驗(yàn)于2018 年、2019 年在吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院試驗(yàn)田進(jìn)行，土壤有機(jī)質(zhì)21.42 g/kg、堿解氮76 mg/kg、有效磷37 mg/kg、速效鉀135 mg/kg。以吉林省25 個(gè)主栽水稻品種為參試材料（具體名稱(chēng)見(jiàn)表1）。

表1 常溫及冷害脅迫條件下不同水稻品種游離脯氨酸含量 （單位：μg·g-1）

1.2 試驗(yàn)方法

4 月 15 日播種，5 月 25 日移栽，移栽葉齡 3.5 葉左右，插秧規(guī)格30 cm×20 cm，每叢3 株，每個(gè)處理面積9 m2，3 次重復(fù)。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，移栽大田后在水稻孕穗期開(kāi)始用（17±1）℃冷水持續(xù)處理 20 d（每天8∶00—16∶00），保持 25 cm 水層；正常水溫（23±1）℃灌溉作為對(duì)照，栽培方式同冷害脅迫處理。氮、磷、鉀肥施用量一致，分別為尿素400 kg/hm2、磷酸二銨200 kg/hm2、硫酸鉀 200 kg/hm2，按基∶蘗∶調(diào)∶穗=4∶3∶1∶2 比例施入，病、蟲(chóng)、草害防治及田間管理措施一致。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 葉綠素含量

采用80%丙酮提取，用Arnon 法[6]測(cè)定：①剪去水稻葉片頭部和根部，擦凈表面灰塵，剪成細(xì)條后用電子天平稱(chēng)取0.1 g 后倒入具塞刻度試管中；②在放入水稻的具塞試管中加入95%的乙醇丙酮混合溶液10 mL，使剪碎的葉片完全浸入乙醇丙酮混合液中，密封；③放至恒溫箱中，溫度調(diào)至35℃提取葉綠素，等待葉片完全變成白色；④將具塞刻度試管從恒溫箱中取出，取上清液倒到比色皿中，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在位于波長(zhǎng)663 nm 和645 nm 處進(jìn)行比色，計(jì)算葉綠素含量。

1.3.2 脯氨酸含量

采用3%磺基水楊酸提取，酸性茚三酮比色法[7]測(cè)定：①選取新鮮葉片，將其洗干凈、弄干、剪碎后稱(chēng)取2.0 g；②將稱(chēng)取的葉片放入研缽中后加入3 mL 80%乙醇研磨，將其加入具塞刻度試管中；③向裝有葉片的具塞刻度試管中加入80%乙醇，定容至10 mL；④將研磨后的液體放至試管中，在80℃恒溫水浴鍋中加熱20 min；⑤將提取后的液體中的殘?jiān)没钚蕴繛V紙進(jìn)行過(guò)濾，將濾液加入裝有人造沸石的試管中劇烈震蕩5 min；⑥將上層液在16 000 r/min 離心機(jī)上離心10 min，提取上清液；⑦從離心后的上清液取2 mL 放于試管中后加入2 mL 冰醋酸試劑和2 mL 茚三酮試劑進(jìn)行密封；⑧在水浴鍋中沸水加熱15 min 后冷卻，加入甲苯5 mL，在黑暗條件下靜置，待液體完全分層后取甲苯層放置于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)中520 nm 處比色；⑨配制7 個(gè)系列脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述過(guò)程進(jìn)行分層和測(cè)定。橫坐標(biāo)用游離脯氨酸的含量表示，縱坐標(biāo)用光密度值表示，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 可溶性糖含量

用蒽酮比色法[8]測(cè)定：①選取新鮮葉片剪碎并利用電子天平稱(chēng)取0.5 g，放入裝有15 mL 水的大試管中，在水浴鍋中沸水加熱20 min；②待其冷卻后，用活性炭濾紙過(guò)濾，將濾液定容至100 mL 容量瓶中；③從容量瓶中用移液管吸取1 mL 提取液，再向其中加入5 mL蒽酮，搖勻，在水浴鍋中沸水加熱10 min；④待其冷卻后放置在分光光度計(jì)620 nm 波長(zhǎng)處進(jìn)行比色。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用 Excel 2010、SPSS 17.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水稻品種游離脯氨酸含量變化

植物在冷害脅迫下，細(xì)胞膜會(huì)受到不同程度的傷害發(fā)生膜脂過(guò)氧化，游離脯氨酸起穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)的作用。水稻葉片內(nèi)的游離氨基酸量可以在某種程度上反應(yīng)品種的抗逆（抗冷）性，在低溫條件下游離氨基酸含量升高，說(shuō)明抗冷性較好。由表1 可知，與常溫灌溉處理相比，各品種冷害脅迫處理后游離脯氨酸普遍升高，吉粳515、通禾77、吉粳511、通系935，通禾66及秋田小町等品種苗期時(shí)游離脯氨酸積累較多，吉宏9 在冷害脅迫10 d 后升高最多，達(dá)到7.88μg/g，這些品種抗冷性較為突出；吉香6、宏科88 游離脯氨酸積累量最少，僅為1.44 μg/g，抗冷性較弱，在栽培過(guò)程中應(yīng)加強(qiáng)對(duì)低溫冷害的防御。

2.2 不同水稻品種葉綠素含量變化

葉綠素作為植物光合作用中吸收光能的光合色素，其含量的多少直接影響水稻光合作用的強(qiáng)弱。如圖1 所示，在冷害脅迫下各品種的葉綠素含量普遍低于常溫灌溉處理。冷害脅迫5 d 葉綠素含量要比常溫灌溉處理平均降低30%；冷害脅迫10 d 要比常溫灌溉處理平均降低29%，冷害脅迫每增加1 d，葉綠素含量降低0.04 mg/g。冷害脅迫下吉宏9、吉粳809 和通禾66的葉綠素含量與常溫灌溉處理相比變化不顯著，相較于其他品種表現(xiàn)更穩(wěn)定，且生長(zhǎng)較好，說(shuō)明其耐冷性較強(qiáng)。

2.3 不同水稻品種可溶性糖含量變化

水稻在冷害脅迫下苗期可溶性糖普遍升高。一方面，淀粉酶活性在冷害脅迫下增強(qiáng)，引起淀粉分解產(chǎn)生更多的可溶性糖；另一方面，冷害脅迫下植株消耗可溶性糖的能力減弱，導(dǎo)致可溶性糖的累積量增多。從表2可見(jiàn)，在苗期的5 d、7 d、10 d，各品種可溶性糖含量在冷害脅迫處理下要普遍高于常溫灌溉處理，其中，吉農(nóng)大 853、吉宏9、吉農(nóng)大 538 和吉粳515 在苗期10 d 累積的可溶性糖較多，而吉粳507 和秋田小町對(duì)冷害脅迫效應(yīng)不明顯，說(shuō)明這些品種的抗冷性較強(qiáng)。

表2 常溫及冷害脅迫下不同水稻品種可溶性糖含量變化 （單位：g/100 g 鮮質(zhì)量）

2.4 丙二醛含量與不同葉綠素含量的相關(guān)性分析

冷害脅迫下，水稻品種的類(lèi)胡蘿卜素含量增加，增加較多的品種是吉粳95、廩實(shí)528 和吉宏9，比常溫灌溉處理分別增加了51%、40%和22%。類(lèi)胡蘿卜素含量變化不顯著的品種有秋田小町。相關(guān)性分析（圖2）表明，低溫脅迫下，不同水稻品種綠素a、葉綠素b 和類(lèi)胡蘿卜素含量的處理效應(yīng)值隨著丙二醛含量的處理效應(yīng)值的增加而降低，其相關(guān)系數(shù)r 分別為-0.117、-0.049與-0.335（P>0.05），表明葉綠素在冷害脅迫下并沒(méi)有發(fā)生顯著損傷，可能具有對(duì)冷害脅迫正反饋抵御機(jī)制。

3 討論

冷害脅迫下，植物體內(nèi)細(xì)胞在結(jié)構(gòu)、生理生化上會(huì)發(fā)生一系列適應(yīng)性改變。

水稻耐冷程度的高低主要由生物膜結(jié)構(gòu)功能不同引起。低溫脅迫下，水稻植株會(huì)降低細(xì)胞滲透勢(shì)進(jìn)而防止組織脫水，用來(lái)維持植株穩(wěn)定和持續(xù)的生理過(guò)程。植物在冷水脅迫下積累脯氨酸有一定普遍性，脯氨酸可作為滲透調(diào)節(jié)物和膜保護(hù)物質(zhì)及自由基清除劑，進(jìn)而對(duì)植物起到一定的保護(hù)作用[9]。不同水稻品種受冷害脅迫后，游離氨基酸含量明顯增加，而且品種之間存在顯著差異，游離脯氨酸的含量與水稻抗冷性呈正相關(guān)關(guān)系。許多研究通過(guò)分析不同水稻品種處理效應(yīng)值高低來(lái)篩選耐冷性強(qiáng)水稻品種[10-11]。水稻品種的可溶性糖含量在冷害脅迫條件下要普遍高于常溫灌溉條件。

葉綠素大量存在于水稻葉片中，其吸收大量光能后，進(jìn)而變?yōu)榛钴S化學(xué)能，增加水稻的物質(zhì)積累。在水稻全生育期，測(cè)定苗期葉綠素含量對(duì)抗冷性研究有著重要意義[12-14]。朱誠(chéng)等[15]研究表明，低溫會(huì)明顯降低葉片中的葉綠素含量。發(fā)生冷害脅迫時(shí)首先降低了葉片中的葉綠素含量，引起光合速率下降。耐冷性強(qiáng)的品種膜脂不飽和脂肪酸的含量及不飽和程度均高于耐冷性弱的品種[16]。水稻耐冷機(jī)理基因調(diào)控研究已經(jīng)起步，逆境蛋白質(zhì)的生理作用、有關(guān)基因表達(dá)及基因克隆等研究也在進(jìn)行。經(jīng)低溫處理后，通過(guò)對(duì)水稻幼苗葉綠素含量的分析不能明確區(qū)分出耐冷性強(qiáng)的水稻品種，其原因可能是水稻幼苗葉綠素在低溫逆境脅迫下并沒(méi)有發(fā)生顯著損傷。耐冷性是由較復(fù)雜的數(shù)量性狀導(dǎo)致，有待進(jìn)一步開(kāi)展冷害脅迫對(duì)不同水稻品種形態(tài)指標(biāo)、開(kāi)花習(xí)性、結(jié)實(shí)影響的冷害機(jī)制及相關(guān)的生理生化指標(biāo)研究。

4 結(jié)論

本研究表明，發(fā)生冷害脅迫后，吉粳515、通禾77、吉粳511、通系935，通禾66 及秋田小町脯氨酸積累較多，吉粳809、吉宏9 和通禾66 的葉綠素含量相比常溫灌溉下變化不顯著且生長(zhǎng)較好，這些品種的耐冷性較突出；吉粳515、吉農(nóng)大538 和吉農(nóng)大853 累積了更多的可溶性糖，亦具有較好的抗逆性。