吳柳盛，劉繼先，烏達(dá)，李小強(qiáng)1，，鄭于臻，羅瑞星，徐鵬程，吳定旺

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)北大深圳醫(yī)院臨床學(xué)院，廣東 深圳 518036；2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院胸外科，廣東 深圳 518036；3.安徽醫(yī)科大學(xué)，合肥 230032；4.中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院胸外科，廣州 510655)

食管腺癌是一種常見的惡性腫瘤，多發(fā)于食管黏膜下層或賁門腺[1]，發(fā)病率僅次于食管鱗狀細(xì)胞癌，預(yù)后較差。近年來，食管腺癌的發(fā)病率和死亡率均逐漸升高，引起人們的廣泛關(guān)注。更多食管腺癌致癌因素的發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)了人們對食管腺癌的早期發(fā)現(xiàn)和診療進(jìn)展，這對控制疾病死亡率起重要作用。食管腺癌患者術(shù)后化療中常存在抗腫瘤藥物的耐受情況，且腫瘤藥物耐受率不斷增加，給臨床治療帶來一定困難。因此，需要建立一個接近人類食管腺癌臨床特征的腫瘤動物模型來滿足這些條件[2-3]，同時對研究食管腺癌的發(fā)病機(jī)制以及抗腫瘤藥物耐受機(jī)制具有重要意義。但近年來食管腺癌動物模型只是從某單方面建?；蚪７椒枋霾蝗妗，F(xiàn)就不同類型食管腺癌動物模型的研究進(jìn)展予以綜述。

1 食管腺癌不同手術(shù)方式建模

食管腺癌及癌前病變模型多采用外科手術(shù)反流法進(jìn)行構(gòu)建，其演變過程為反流性食管炎→Barrett食管→不典型增生→食管腺癌。常見的哺乳動物包括大鼠、小鼠、兔、犬、豬等。目前SD大鼠是食管腺癌動物模型最常用的建模對象，SD大鼠食管解剖大小理想，手術(shù)實(shí)施簡易方便，且SD大鼠對食管腺癌的敏感性高，在胃食管反流液的刺激下更利于誘導(dǎo)食管腺癌[4-5]。其他動物模型，如比格犬和豬[6]在食管腺癌研究領(lǐng)域也發(fā)揮重要作用，在組織結(jié)構(gòu)和生理功能方面，比格犬和豬的食管與人類相似。該模型已被用于胃腸道營養(yǎng)的相關(guān)研究，但由于實(shí)驗(yàn)成本較高和動物倫理學(xué)問題較少使用。

1.1食管-胃-十二指腸混合反流模型 食管-胃-十二指腸模型的形成機(jī)制主要是胃部和十二指腸部的酸性溶液反流侵蝕食管發(fā)生病變，是用于模擬人類食管癌變常用的動物模型。然而，由于缺乏轉(zhuǎn)基因的大鼠品系，該大鼠模型在機(jī)械和化學(xué)預(yù)防研究中的應(yīng)用受到限制[7]。因此，食管腺癌模型以小鼠為主。有研究對實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行食管-胃-十二指腸吻合術(shù)，術(shù)后添加鐵劑喂養(yǎng)(鐵劑能促進(jìn)誘發(fā)動物食管腺癌)，結(jié)果顯示，食管-胃-十二指腸吻合術(shù)后第3周和第11周，Barrett食管和食管腺癌誘導(dǎo)成功；術(shù)后第23周，Barrett食管的誘導(dǎo)率為58%，在第31周時提高至91%，而食管腺癌的誘導(dǎo)率分別為17%和73%[8]。在實(shí)驗(yàn)中，食管-胃-十二指腸吻合模型最常見，且食管腺癌動物模型的誘導(dǎo)率較高[9]。因此，通過手術(shù)建立大鼠食管-十二指腸吻合模型有利于深入研究抗氧化損傷和預(yù)防食管腺癌，但臨床研究中較少應(yīng)用。

1.2單純十二指腸液反流模型 十二指腸液反流模型主要用于堿性腸液侵蝕食管黏膜上皮細(xì)胞誘發(fā)癌變的研究。堿性的腸液對食管黏膜進(jìn)行長期慢性腐蝕可誘發(fā)癌變。多項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，行胃大部切除術(shù)的患者隨訪10年后晚期并發(fā)癥中有部分患者出現(xiàn)食管下段腺癌，提示十二指腸液反流可能誘發(fā)食管下段腺上皮癌變[10-12]。Jiang等[13]采用手術(shù)建模的方式對40只大鼠進(jìn)行胃大部切除術(shù)同時吻合食管和十二指腸，術(shù)后觀察大鼠食管下端腺上皮癌變率為54%。Choi等[14]和Walsh等[15]對術(shù)后大鼠進(jìn)行解剖病理觀察和化生腺上皮細(xì)胞研究，發(fā)現(xiàn)大鼠食管下端化生的腺上皮可能源于食管干細(xì)胞，這為食管腺癌的發(fā)生機(jī)制研究提供了依據(jù)。但該建模方法操作困難，直接影響術(shù)后大鼠的成活率和建模成功率。

1.3單純胃液反流模型 單純胃液反流模型常以比格犬作為研究對象，通過對比格犬施行賁門擴(kuò)張術(shù)，胃液反流會誘導(dǎo)黏膜腺細(xì)胞增殖，其組織病理活檢表現(xiàn)出早期食管炎和一些癌前病變的表型。張濤等[4]驗(yàn)證了以上觀點(diǎn)，采用酸性的胃液長期侵蝕食管黏膜上皮致黏膜屏障受損，進(jìn)而發(fā)生食管潰瘍出血、水腫狹窄以及癌前病變等，其中以Barrett食管發(fā)病率最顯著。動物實(shí)驗(yàn)中小鼠受損的食管黏膜出現(xiàn)水腫潰瘍、增生以及贅生物的形成，管腔狹窄、管壁變厚等肉眼可觀病理表現(xiàn)。通過手術(shù)來構(gòu)建胃食管反流模型誘導(dǎo)食管腺癌較常見[16]，但特異性差，觀察時間長，較少應(yīng)用。

1.4食管灌注動物模型 食管灌注動物模型指通過人造食管導(dǎo)管置于動物體內(nèi)，灌注酸性液體來模擬胃酸反流，通過酸性液體對食管腺上皮的不斷刺激和損害來誘導(dǎo)食管腺癌模型的構(gòu)建。這種食管灌注動物模型實(shí)驗(yàn)對象有家兔、大鼠、小鼠等[17]。皮下植入大鼠滲透壓微泵的灌注模型可以精確控制灌注的濃度和流量[18]。因此，一些學(xué)者針對不同的實(shí)驗(yàn)對象建立了食管灌注模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酸性液體會直接造成食管黏膜腺上皮損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)食管腺上皮發(fā)生癌變[19]。該建模方法在實(shí)驗(yàn)中較少應(yīng)用，屬于自然性誘發(fā)動物的食管發(fā)生癌變，外部影響因素多，誘發(fā)時間較長，不適合短期研究。

2 食管腺癌不同藥物建模

目前化學(xué)致癌劑(以亞硝胺類為代表)誘導(dǎo)食管腺癌動物模型的技術(shù)趨向成熟和完善，常用甲基芐基亞硝胺(nitrcxsomethylbenzylamine，NMBA)作為致癌劑。國外文獻(xiàn)報道，NMBA是誘發(fā)動物食管腺癌較為理想的化學(xué)制劑，對食管有較高的親和性和特異性[20-21]。其優(yōu)點(diǎn)是誘導(dǎo)的動物食管腺癌病理特性與人食管腺癌細(xì)胞的發(fā)生順序相平行，藥物劑量較小，毒性較弱，該類動物模型操作簡易。亞硝胺類物質(zhì)構(gòu)建食管腺癌模型的給藥方式包括自由取食法、食管內(nèi)灌注及皮下注射法。亞硝胺建模方式的癌變誘發(fā)率高，該類動物模型可以用來研究食管腺癌的發(fā)病機(jī)制和臨床預(yù)后療效評估。同時該類建模技術(shù)特異性差[22]，目前化學(xué)試劑誘癌模型還存在諸多限制，如誘癌成功率低，建模時間長，不同物種和個體間腫瘤的差異較大，所表現(xiàn)出來的腫瘤形態(tài)特征多樣，不適宜作為臨床腫瘤藥物治療的動物模型研究。在藥物誘發(fā)的食管腺癌模型中，實(shí)驗(yàn)動物與致癌因子直接或間接接觸。該建模方式操作簡便，腫瘤誘發(fā)率高，動物成瘤效果好，可肉眼觀察到整個食管黏膜發(fā)生癌變的病理過程。

2.1NMBA喂養(yǎng)法 亞硝胺是強(qiáng)致癌物，也是最重要的化學(xué)致癌物之一。NMBA是亞硝胺的種類之一，消化系統(tǒng)腫瘤(如食管癌)的發(fā)生與飲食中亞硝胺的攝入量相關(guān)。鄒麗輝[23]采用NMBA灌喂SD大鼠的建模方式成功誘導(dǎo)了食管腺癌，選取3～4周齡體重約80 g的大鼠，每5只一組，NMBA儲存液用蒸餾水稀釋，使用溶度為200 μg/mL，劑量為1 mg/kg，每周連續(xù)灌喂3次，持續(xù)3個月，其中半個月后，每一個月處死5只大鼠，誘癌及收集標(biāo)本時間為38周，整理SD大鼠食管病理組織活檢報告發(fā)現(xiàn)食管炎→不典型增生→原位癌→腺癌的動態(tài)病理變化過程。NMBA喂養(yǎng)法是化學(xué)致癌物誘導(dǎo)食管腺癌動物模型構(gòu)建領(lǐng)域中最常用的一種方法，具有操作簡便、成本較低、實(shí)驗(yàn)偏差較小、可行性高等優(yōu)勢[24-25]。

2.2對甲基戊基亞硝胺喂養(yǎng)法 對甲基戊基亞硝胺是亞硝胺中的一種常見亞型，常用作化學(xué)致癌劑誘發(fā)癌變，進(jìn)而構(gòu)建相對應(yīng)的腫瘤模型。鄒晴晴等[26]將對甲基戊基亞硝胺作為大鼠(MRC-Wistar品系)食管腺癌的誘變劑，藥物劑量為12.5～25 mg/kg，每周給藥1次，給藥周期持續(xù)12周，并持續(xù)給予大鼠飲水17～20周，后期處死大鼠并進(jìn)行病理切片處理和蘇木精-伊紅染色，病理結(jié)果顯示食管、鼻腔和肺部組織出現(xiàn)乳頭狀瘤、癌前病變和浸潤癌變，表明癌變誘發(fā)率較高，病理變化與人類相似。對甲基戊基亞硝胺喂養(yǎng)法在食管腺癌動物建模的基礎(chǔ)研究中也是較為常用的一種方式，動物建模成功率較高，實(shí)驗(yàn)周期較短，可節(jié)省大量時間和成本[27-28]。

2.34-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide,4-NQO)喂養(yǎng)方法 4-NQO是一種水溶性喹啉衍生物[29]，最初是應(yīng)用于誘導(dǎo)動物口腔癌模型的化學(xué)致癌物。有研究表明，4-NQO也能誘導(dǎo)小鼠(NOD/SCID品系)發(fā)生食管腺癌，且致癌率較高，建模效果好[30]。但4-NQO喂養(yǎng)模型的藥物劑量大，誘癌周期時間長，毒性大，成本高，特異性較差，致癌物質(zhì)常會誘導(dǎo)其他器官發(fā)生癌變，實(shí)驗(yàn)偏差大，目前較少應(yīng)用。Abdel-Rahman等[31]將105只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組，分別用100、50、10 μg/mL的4-NQO溶液供小鼠自由飲用，實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)劑量為100 μg/mL組的小鼠不良反應(yīng)最明顯，在32周病變進(jìn)一步發(fā)展，出現(xiàn)明顯的原位癌和進(jìn)展期食管腺癌病理表現(xiàn)。在誘導(dǎo)食管腺體發(fā)生癌變過程中，隨著4-NQO濃度升高，食管腺癌發(fā)生率也升高。但在4-NQO所構(gòu)建的腫瘤動物模型也存在一定的局限性，即小鼠自由飲用4-NQO溶液，無法確定每只小鼠具體的4-NQO暴露劑量[32]。

3 食管腺癌不同移植建模

移植腫瘤的動物模型被廣泛應(yīng)用，且是篩選和研究新的抗腫瘤藥物的最常用模型。這種移植方法介于細(xì)胞培養(yǎng)和小鼠腫瘤模型之間，稱為“動物培養(yǎng)”。移植性的動物模型構(gòu)建有同種移植和異種移植兩種方式。但同種移植食管癌動物模型能獲得的鼠食管癌細(xì)胞系較少，其應(yīng)用受到一定限制[33]。異種移植食管癌動物模型是最常用的食管癌動物模型之一，該模型具有較高的腫瘤形成率，并可以反映腫瘤侵襲、生長和藥物敏感性的特征。移植的食管腺癌動物模型可以模擬人體內(nèi)的腫瘤微環(huán)境，研究人體內(nèi)食管腺癌的發(fā)生和進(jìn)展[34]。早期的研究大多使用異位移植模型[35]，其具有制備成功率高和腫瘤形成快的優(yōu)點(diǎn)，但經(jīng)常發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移，從而限制了進(jìn)一步的研究應(yīng)用。

3.1細(xì)胞系建立的食管腺癌動物模型 腫瘤細(xì)胞系的同種異體動物模型在細(xì)胞毒性藥物的研發(fā)中發(fā)揮重要作用。其優(yōu)點(diǎn)是接種特定腫瘤細(xì)胞可以誘導(dǎo)同種異體腫瘤，生長速度相對一致，個體差異小，接種存活率接近100%，容易客觀地判斷療效，可以連續(xù)移植到同一只動物中，且保留時間長，實(shí)驗(yàn)周期短[36]。常用于食管腺癌的細(xì)胞株包括EC109、KYSE510、Casel7等[37]，各細(xì)胞株來源不同，所以增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及基因水平均不同。相關(guān)研究報道[38-39]，多數(shù)的食管腺癌細(xì)胞系經(jīng)過體外多代傳遞培養(yǎng)后，細(xì)胞系可能會出現(xiàn)突變情況，其組織學(xué)特征不穩(wěn)定，無法還原和體現(xiàn)之前食管腺癌患者的多樣性和個體化，因此在食管腺癌機(jī)制研究中的應(yīng)用受限。

3.2免疫缺陷食管腺癌小鼠模型 因正常小鼠對腫瘤存在免疫排斥反應(yīng)，造成腫瘤在普通小鼠上種植的成功率不高，因此對于腫瘤動物模型的構(gòu)建需要專門的免疫缺陷小鼠作為載體。Abdel-Rahman等[31]首次成功建立食管腺癌腫瘤組織移植模型，高度還原了腫瘤在體外培養(yǎng)的動態(tài)發(fā)展環(huán)境，目前仍是前沿的腫瘤動物模型技術(shù)。Ceylan等[32]和Schellnegger 等[33]首先使用人食管腺癌細(xì)胞系成功建立小鼠皮下異種移植腫瘤。免疫缺陷食管腺癌小鼠模型可高度模擬食管腺癌患者腫瘤細(xì)胞的生長環(huán)境，但不同個體間對抗腫瘤藥物的敏感性和耐受性存在差異，這種方法可以有效避免臨床上食管腺癌患者的個體差異[40]。同時醫(yī)務(wù)工作者還可以利用該模型進(jìn)行抗腫瘤藥物試驗(yàn)，患者評估療效后再接受靶向治療，可以制訂出有前瞻性和預(yù)見性的治療方案，改善患者的生活質(zhì)量并延長其生存時間。

3.3人源化食管腺癌小鼠模型 近年來隨著腫瘤免疫治療研究的快速發(fā)展，腫瘤免疫浸潤也成為研究熱點(diǎn)。人源化小鼠模型是指攜帶有功能性的人類基因，能體現(xiàn)出人類腫瘤微環(huán)境特征的小鼠模型[41]。有研究報道，食管腺癌裸鼠模型病變特征與人類相似，近交系組織相容性好，腫瘤移植效果較佳，可用于篩選抗腫瘤藥物以及進(jìn)行腫瘤耐藥機(jī)制學(xué)研究[42]。Ceylan等[32]利用移植的手段將人體食管腺癌細(xì)胞或組織接種于動物體內(nèi)建立食管腺癌的動物模型，并通過異種移植將食管腺癌組織或癌細(xì)胞植入除食管外的實(shí)驗(yàn)動物的其他部位。

3.4基因工程食管腺癌小鼠模型 隨著人們對基因工程和生物技術(shù)研究的深入，食管腺癌內(nèi)源性的發(fā)生機(jī)制研究成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。Matsumoto等[34]第一次通過將純化的DNA與小鼠胚胎原核相結(jié)合，成功獲得了轉(zhuǎn)基因動物。隨著基因編輯技術(shù)(CRISPR/Cas9)的發(fā)展，現(xiàn)已形成一套成熟的基因工程技術(shù)體系[35]?；蚬こ绦∈竽Ｐ蛯ΜF(xiàn)代癌癥研究具有重要意義，為腫瘤治療提供了個性化診療方案和思路，同時為基因工程的轉(zhuǎn)基因小鼠提供了一個可預(yù)測的模型，用來測試癌基因是否可以導(dǎo)致生物體內(nèi)正常細(xì)胞在正常情況下致癌，基因工程食管腺癌動物模型是研究食管腺癌內(nèi)在因素的最佳選擇。

4 體內(nèi)外腫瘤動物模型前沿技術(shù)

免疫熒光成像技術(shù)是目前腫瘤分子生物學(xué)研究中常用的影像學(xué)輔助技術(shù)。在腫瘤動物模型的構(gòu)建中，這種活體成像技術(shù)能夠通過無創(chuàng)的方式動態(tài)觀察體內(nèi)成瘤情況，包括大小、位置以及腫瘤侵犯范圍等，大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時間和成本，有利于提高科研效率。Lee等[36]的研究方向是目前腫瘤動物模型構(gòu)建的最前沿技術(shù)——可視化原位人源腫瘤模型[37]構(gòu)建?？梢暬蝗嗽茨[瘤模型通過對SD大鼠進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的原位皮下移植，最大限度地還原患者機(jī)體內(nèi)腫瘤的動態(tài)環(huán)境變化，后期通過綠色熒光蛋白/熒光素酶成像技術(shù)呈現(xiàn)其發(fā)展趨勢[23]。該模型的構(gòu)建極大地推動了臨床腫瘤的個性化治療和精準(zhǔn)治療，特別是食管腺癌術(shù)后化療中不同個體對抗腫瘤藥物耐受機(jī)制的研究[43]。柏文等[12]使用無創(chuàng)生物體內(nèi)成像方法監(jiān)測食管腺癌裸鼠腫瘤模型，并成功構(gòu)建了綠色熒光蛋白/熒光素酶雙標(biāo)記人食管腺癌ECA109細(xì)胞系(ECA109-熒光素酶-綠色熒光蛋白)，其原理是采用動物活體成像技術(shù)觀察食管腺癌細(xì)胞在動物模型中的生長和轉(zhuǎn)移。Chen等[39]提出將綠色熒光蛋白/熒光素酶雙重標(biāo)記技術(shù)用于體內(nèi)成像監(jiān)測，這結(jié)合了兩種成像技術(shù)的優(yōu)勢，擴(kuò)大了體內(nèi)成像的應(yīng)用范圍。此外，綠色熒光蛋白/熒光素酶雙重標(biāo)記技術(shù)與體內(nèi)成像技術(shù)相結(jié)合，在食管腺癌的裸鼠腫瘤模型上進(jìn)行動態(tài)觀察研究[40]，以可視化了解食管腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為和特征。這種活體成像技術(shù)為食管腺癌治療藥物的研發(fā)、腫瘤耐藥性和基因治療效果驗(yàn)證等提供了新思路。

5 小 結(jié)

隨著近年來免疫工程和基因工程的快速發(fā)展，腫瘤動物模型的構(gòu)建技術(shù)越來越成熟。腫瘤動物模型從早期的化學(xué)致癌劑亞硝胺類毒物誘發(fā)動物食管腺癌模型的形成到目前的可視化原位人源腫瘤模型的成功構(gòu)建，更加精準(zhǔn)地模擬腫瘤在人體內(nèi)生長環(huán)境，隨著相關(guān)技術(shù)的成熟和發(fā)展，腫瘤動物模型的構(gòu)建更加個性化、更有針對性、更加精準(zhǔn)化。對食管腺癌腫瘤動物模型構(gòu)建并進(jìn)行活體的動態(tài)示蹤[42-43]，清晰了解食管腺癌動態(tài)的生物學(xué)行為，能夠快速、精準(zhǔn)、個性化地建立理想的腫瘤動物模型，可為食管腺癌抗癌藥物的研發(fā)、臨床診斷和治療以及預(yù)后評估等提供新思路。實(shí)驗(yàn)動物人源化[44]是近年的研究熱點(diǎn)，期望通過人源化實(shí)驗(yàn)動物來構(gòu)建腫瘤動物模型，在一定程度上高度還原腫瘤的生長環(huán)境。