孫藝宸，肖黎明，楊瑩，袁媛，于銘，葉菁,，谷雨,

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院a.學(xué)員二大隊五隊，b.病理學(xué)教研室，西安 710032；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院a.病理科，b.超聲醫(yī)學(xué)科，西安 710032)

世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2018年全球約960萬人死于癌癥[1]。但目前癌癥的治療效果尚不令人滿意。鐵死亡是一種鐵依賴的、由活性氧類(reactive oxygen species，ROS)囤積及脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致的細胞死亡過程，也是一種新的可調(diào)控的細胞死亡形式；鐵死亡的基本過程為：在二價鐵離子(Fe2+)作用下，氧化物通過芬頓反應(yīng)形成具有破壞性的自由基，進而催化細胞膜上高表達的多不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化，導(dǎo)致細胞死亡[2]。除Fe2+外，谷胱甘肽(glutathione，GSH)耗盡或谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，Gpx4)失活也是鐵死亡的調(diào)節(jié)位點。GSH是Gpx4的重要輔助因子，GSH缺失或Gpx4活性降低均可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化及細胞損傷[2]。鐵死亡驅(qū)動的納米療法是目前生物醫(yī)學(xué)研究的熱點。利用生物納米技術(shù)開發(fā)的納米給藥系統(tǒng)(nano-drug delivery system，Nano-DDS)具有改善藥物可用性、靶向給藥的獨特優(yōu)勢[3]。Nano-DDS可以很好地克服抗癌藥物溶解度低、膜透性差的缺點。通過對Nano-DDS進行表面特異性修飾可實現(xiàn)主動靶向給藥，合理設(shè)計對腫瘤刺激反應(yīng)的Nano-DDS可實現(xiàn)位點特異性治療作用[4]。目前，一些裝載化療藥物的納米制劑已應(yīng)用于臨床，如脂質(zhì)體阿霉素和紫杉醇的白蛋白納米顆粒等。現(xiàn)就基于鐵死亡的癌癥納米療法的研究進展予以綜述。

1 鐵死亡的分子機制

鐵代謝和脂質(zhì)過氧化是鐵死亡的兩個中心環(huán)節(jié)，F(xiàn)e2+通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生ROS，促進鐵死亡的發(fā)生；而GSH缺乏和Gpx4失活可導(dǎo)致ROS累積，促進脂質(zhì)過氧化和鐵死亡發(fā)生[2]。

1.1鐵代謝在鐵死亡中的作用 鐵是所有真核生物和大多數(shù)原核生物合成鐵硫簇、血紅素和其他輔因子所必需的營養(yǎng)物質(zhì)[5]。細胞內(nèi)的鐵受轉(zhuǎn)鐵蛋白的嚴(yán)密調(diào)控，以維持鐵穩(wěn)態(tài)。細胞內(nèi)大部分Fe2+儲存于鐵蛋白和其他含鐵蛋白質(zhì)中，游離Fe2+數(shù)量非常有限，細胞鐵池主要以Fe2+的形式存在，也稱細胞不穩(wěn)定鐵池；細胞鐵代謝的基本過程為：①血液循環(huán)中的鐵以三價鐵離子(Fe3+)形式與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合；②細胞通過胞膜上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1吸收Fe3+并存儲于核內(nèi)體中，F(xiàn)e3+在鐵還原酶的催化下轉(zhuǎn)變?yōu)镕e2+；③Fe2+通過核內(nèi)體膜上的二價金屬離子轉(zhuǎn)運體釋放到細胞不穩(wěn)定鐵池發(fā)揮生理功能，而多余的Fe2+以鐵蛋白(由鐵蛋白重鏈和輕鏈組成的蛋白復(fù)合體)的形式存儲起來；④細胞膜上的鐵轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)鐵離子的輸出[2]。研究表明，干擾鐵代謝可以導(dǎo)致鐵死亡[6]。沉默轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1抑制鐵吸收可顯著抑制鐵死亡[7]。Dixon等[8]在Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡中發(fā)現(xiàn)了6個高置信度基因，包括鐵反應(yīng)元件結(jié)合蛋白2。抑制鐵反應(yīng)元件結(jié)合蛋白2的表達可上調(diào)鐵代謝相關(guān)基因的表達，進而抑制Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡[9]。另外，RAS基因突變的細胞對鐵死亡異常敏感，同時RAS基因突變可上調(diào)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1表達，下調(diào)鐵蛋白輕鏈和重鏈表達，表明鐵攝取增加和(或)儲存減少導(dǎo)致的鐵超載可以導(dǎo)致鐵死亡[7]。通過鐵螯合劑減少鐵超載可抑制Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡，而外源性鐵可顯著增強Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡[8]。鐵蛋白自噬降解可以產(chǎn)生游離的Fe2+，沉默自噬相關(guān)基因5和自噬相關(guān)基因7均可降低細胞內(nèi)Fe2+水平和減少脂質(zhì)過氧化，從而抑制Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡[10]。

活性Fe2+導(dǎo)致的ROS產(chǎn)生主要取決于芬頓反應(yīng)和脂氧合酶。芬頓反應(yīng)的主要過程是過氧化物與Fe2+反應(yīng)產(chǎn)生的以氧為中心的自由基[11]。細胞內(nèi)活性Fe2+水平升高，可促進ROS產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致鐵死亡，而鐵螯合劑可下調(diào)細胞內(nèi)的活性Fe2+水平，減少ROS產(chǎn)生，抑制脂質(zhì)過氧化及鐵死亡[2]。此外，活性Fe2+也可以通過含鐵酶產(chǎn)生ROS，而脂氧合酶是其中最重要的酶[12]。脂氧合酶可促進ROS產(chǎn)生，產(chǎn)生的ROS反過來又可上調(diào)脂氧合酶的表達，導(dǎo)致ROS水平的進一步升高[13]。

1.2GSH和Gpx4在鐵死亡中的作用 除了鐵超載通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生ROS外，直接抑制Gpx4活性也可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和鐵死亡[14]。Gpx4的功能是將脂肪酸過氧化物轉(zhuǎn)化為脂肪酸醇，去除磷脂膜上的過氧化脂質(zhì)[5]。因此，Gpx4是鐵死亡的關(guān)鍵抑制因子。在脂質(zhì)介導(dǎo)的芬頓反應(yīng)中，累積的脂肪酸過氧化物生成脂質(zhì)過氧化物自由基，脂質(zhì)自由基可以通過攝取質(zhì)子形成新的脂質(zhì)過氧化物自由基，引發(fā)新一輪的脂質(zhì)氧化，導(dǎo)致脂質(zhì)間的氧化損傷不斷擴散，加速脂質(zhì)ROS的產(chǎn)生；多不飽和脂肪酸的氧化和自由基導(dǎo)致多不飽和脂肪酸裂解成各種產(chǎn)物(如丙二醛和4-羥基壬烯醛)，而過氧化多不飽和脂肪酸及其代謝產(chǎn)物均具有細胞毒性[5]。Ras選擇性致死性小分子3可共價靶向Gpx4活性部位的硒基半胱氨酸，抑制Gpx4的活性，誘導(dǎo)鐵死亡[15]。此外，丁硫氨酸亞砜胺(buthionine sulfoximine，BSO)也可靶向Gpx4調(diào)節(jié)鐵死亡。BSO是GSH合成限速酶的不可逆抑制劑，可通過減少GSH的合成抑制Gpx4活性，升高ROS水平，促進鐵死亡[16]。

GSH是Gpx4的輔助因子，因此抑制GSH產(chǎn)生也可導(dǎo)致鐵死亡。胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運體又稱System XC-，是一種跨膜氨基酸轉(zhuǎn)運體，可以用細胞外的胱氨酸交換胞內(nèi)的谷氨酸，從而促進GSH生成，因此SystemXC-可作為治療腫瘤生長和存活的潛在靶點，而Erastin可通過抑制System XC-導(dǎo)致GSH耗竭和Gpx4失活，誘發(fā)鐵死亡[5]。另一個GSH的合成途徑為轉(zhuǎn)硫途徑，即將甲硫氨酸的硫原子轉(zhuǎn)移至絲氨酸，產(chǎn)生半胱氨酸[17]。研究表明，敲低半胱氨酰-轉(zhuǎn)運RNA合成酶可導(dǎo)致胱硫醚積累并上調(diào)轉(zhuǎn)硫化相關(guān)基因，促進絲氨酸合成，以拮抗Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡[2]。

1.3脂質(zhì)代謝途徑在鐵死亡中的作用 鐵死亡最終表現(xiàn)為膜磷脂的過氧化，因此磷脂代謝與鐵死亡密切相關(guān)。長鏈脂肪酸在脂酰輔酶A合成酶催化下轉(zhuǎn)變?yōu)橹］o酶A，進而在溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶(lysophosphatidyl acyltransferase，LPLAT)的作用下合成磷脂[18]。實驗表明，敲除脂酰基輔酶A合成酶4和LPLAT3均可抑制鐵死亡[19]。此外，甲羥戊酸途徑也可以調(diào)節(jié)鐵死亡。甲羥戊酸途徑以乙酰輔酶A為原料合成異戊烯焦磷酸和二甲烯丙基焦磷酸，異戊烯焦磷酸是類固醇、類萜等生物分子的合成前體，對膽固醇的合成、硒半胱氨酸-轉(zhuǎn)運RNA的異戊烯化以及泛醌10的產(chǎn)生至關(guān)重要[18]。異戊烯焦磷酸通過角鯊烯合成酶生成鯊烯，鯊烯進一步轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生成膽固醇，而抑制角鯊烯合成酶參與的膽固醇合成可以抑制鐵死亡的發(fā)生[2]。相反，他汀類藥物可以通過抑制異戊烯焦磷酸合成上游的3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶，促進鐵死亡[20]。甲羥戊酸途徑促進鐵死亡的機制主要為：①通過抑制異戊烯焦磷酸的合成干擾硒半胱氨酸-轉(zhuǎn)運RNA的成熟，而硒半胱氨酸-轉(zhuǎn)運RNA是將硒半胱氨酸嵌入Gpx4所必需[17]；②通過抑制泛醌10的產(chǎn)生導(dǎo)致線粒體的氧化損傷和呼吸功能異常[18]。

2 鐵死亡驅(qū)動的納米療法在癌癥治療中的應(yīng)用

隨著對鐵死亡研究的不斷深入，一系列鐵死亡誘導(dǎo)劑以及治療策略應(yīng)運而生。生物納米技術(shù)可提高藥物的擴散效率、增強藥物的穩(wěn)定性、改善腫瘤微環(huán)境、提升藥物的藥理作用、減少不良反應(yīng)發(fā)生，因而可有效殺傷腫瘤細胞，且療效更好[21]。制備成Nano-DDS的抗癌藥物在提高藥物利用度和靶向傳遞特性等方面具有顯著優(yōu)勢：①Nano-DDS可以很好地解決抗癌藥物溶解度低、膜透過性差的問題，并可增加藥物通透性；②保留滯留效應(yīng)，滯留效應(yīng)可促進藥物在腫瘤組織的選擇性分布，實現(xiàn)抗癌藥物的被動靶向遞送；③對Nano-DDS進行特定的表面修飾，可以實現(xiàn)主動靶向運送和位點特異性治療[22]。鐵死亡與生物納米技術(shù)相結(jié)合的治療策略，在治療癌癥方面效果滿意。

2.1誘導(dǎo)腫瘤細胞鐵死亡的納米療法 通過納米技術(shù)促進鐵死亡的方法主要包括觸發(fā)或促進腫瘤細胞內(nèi)的芬頓反應(yīng)、抑制腫瘤細胞中Gpx4的表達、外源性調(diào)節(jié)腫瘤細胞的脂質(zhì)過氧化等[23]。促進腫瘤細胞內(nèi)的芬頓反應(yīng)、抑制腫瘤細胞中Gpx4的表達是通過調(diào)控細胞內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)增加細胞內(nèi)ROS的積累，而外源性調(diào)節(jié)腫瘤細胞的脂質(zhì)過氧化則是通過補充外源性脂質(zhì)增加細胞內(nèi)過氧化脂質(zhì)的聚積，促進鐵死亡的發(fā)生[22]。

2.1.1促進腫瘤細胞內(nèi)的芬頓反應(yīng) 芬頓反應(yīng)可產(chǎn)生羥自由基，促進脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致鐵死亡。臨床可通過構(gòu)建Nano-DDS和納米催化系統(tǒng)兩種方法誘導(dǎo)芬頓反應(yīng)：①構(gòu)建Nano-DDS補充過氧化氫(H2O2)和鐵離子。Li等[24]將包裹H2O2和鐵離子的納米載體直接輸送至腫瘤組織，以外源性補充腫瘤細胞內(nèi)芬頓反應(yīng)所需的H2O2和鐵離子，但載體中強氧化物的過早泄漏是正常組織氧化損傷的潛在風(fēng)險，安全性較差。Huo等[25]利用納米吸附方法將天然葡萄糖氧化酶和無機催化劑超小四氧化三鐵納米粒子共負載到樹枝狀二氧化硅納米結(jié)構(gòu)中，構(gòu)建了一種可生物降解的大孔徑順序納米催化劑，Nano-DDS中的葡萄糖氧化酶可耗盡腫瘤細胞中的葡萄糖并產(chǎn)生H2O2，而H2O2作為超小四氧化三鐵納米粒子催化的芬頓反應(yīng)的反應(yīng)物，在隨后的催化反應(yīng)中產(chǎn)生大量有毒的羥基自由基，引發(fā)腫瘤細胞的鐵死亡。②構(gòu)建納米催化系統(tǒng)。Huo等[26]開發(fā)的聚乙二醇化單原子含鐵納米催化劑可將鐵原子分散到碳納米材料中，在納米粒子表面修飾聚乙二醇，使H2O2易被無定形的鐵吸收和解離，在腫瘤酸性微環(huán)境下，聚乙二醇化單原子含鐵納米催化劑可引發(fā)芬頓反應(yīng)，且單原子納米催化劑的生物降解性和生物相容性良好，無任何顯著的毒性反應(yīng)。

2.1.2抑制腫瘤細胞Gpx4的表達 在人肝癌荷瘤小鼠模型中，二十二碳六烯酸重組的低密度脂蛋白納米粒可引起脂質(zhì)抗氧化劑Gpx4的失活和脂質(zhì)過氧化，對荷瘤小鼠體內(nèi)移植瘤的生長產(chǎn)生顯著的抑制作用[22]。Wang等[27]構(gòu)建的富含精氨酸的硅酸錳納米氣泡可靶向滅活Gpx4，利用硅酸錳與GSH之間的氧化還原反應(yīng)清除GSH；作為硅酸錳納米氣泡的表面配體，精氨酸可用于腫瘤藥物的歸巢輸送，在GSH耗竭之后，硅酸錳納米氣泡的降解有利于腫瘤的T1加權(quán)磁共振成像和化療藥物的按需釋放，具有良好的療效。

2.1.3外源性調(diào)節(jié)腫瘤細胞脂質(zhì)過氧化 鐵死亡與細胞內(nèi)反應(yīng)性H2O2的積累密切相關(guān)。脂質(zhì)過氧化物主要來源于膜磷脂在氧化刺激下產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸，外源性的脂質(zhì)補充可增加細胞內(nèi)過氧化脂質(zhì)的積聚?？诜曹梺喡樗峥梢哉T導(dǎo)三陰性乳腺癌細胞鐵死亡，且具有較強活性，證明了補充外源性脂質(zhì)誘導(dǎo)鐵死亡治療癌癥的可行性，為構(gòu)建相關(guān)Nano-DDS提供基礎(chǔ)[22]。Zhou等[28]構(gòu)建了基于類芬頓反應(yīng)的Nano-DDS，在氧化鐵納米顆粒表面疏水性亞油酸H2O2和親水性低聚乙二醇共同對磷酸基進行修飾，使得亞穩(wěn)態(tài)的氧化亞鐵和四氧化三鐵在酸性條件下作為鐵源按需釋放Fe2+，補充外源性脂質(zhì)，增加細胞內(nèi)過氧化脂質(zhì)的積聚，誘導(dǎo)鐵死亡。

2.2基于鐵死亡的癌癥Nano-DDS治療策略 近年來，多種藥物聯(lián)合應(yīng)用或治療方法的聯(lián)合使用在癌癥治療中均具有顯著優(yōu)勢。Nano-DDS可將兩種及以上的藥物封裝到一個系統(tǒng)內(nèi)，為聯(lián)合給藥提供了通用平臺，也為鐵死亡驅(qū)動的納米療法開辟了新途徑[22]。

2.2.1鐵死亡與光動力療法(photodynamic therapy，PDT)相結(jié)合的Nano-DDS 一些納米材料在光處理下自身即可產(chǎn)生ROS。氧化石墨烯是一種具有含氧官能團的單原子層，由于其較大的邊界和內(nèi)部空腔，能夠產(chǎn)生類苯基自由基。氧化石墨烯還能增強近紅外處理下自由基的產(chǎn)生能力，是PDT的候選納米材料。然而，氧化石墨烯在近紅外光照射下產(chǎn)生的自由基并不能完全滿足殺傷腫瘤細胞的要求。為了提高氧化石墨烯PDT的效率，He等[29]研發(fā)了基于氧化石墨烯的納米氫氧化鐵/氧化物修飾系統(tǒng)。在近紅外光照射下，基于氧化石墨烯的納米氫氧化鐵/氧化物修飾Nano-DDS中的氧化石墨烯向Fe3+的電子轉(zhuǎn)移增強，可促進Fe3+與氧氣的反應(yīng)，產(chǎn)生超氧陰離子自由基[22]。Fe3+與氧氣反應(yīng)也可生成H2O2，H2O2與Fe2+通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生大量的羥自由基；在近紅外光處理下，基于氧化石墨烯的納米氫氧化鐵/氧化物修飾Nano-DDS的ROS生成活性更強[29]。因此，基于氧化石墨烯的納米氫氧化鐵/氧化物修飾Nano-DDS在近紅外光照射下可有效殺傷腫瘤細胞。基于氧化石墨烯的納米氫氧化鐵/氧化物修飾系統(tǒng)解決了實體瘤中低氧對PDT療效的影響，且光敏劑的安全性良好，因此整合的Nano-DDS不良反應(yīng)小，具有良好的腫瘤治療潛力。

2.2.2鐵死亡與免疫療法相結(jié)合的Nano-DDS 癌癥免疫治療應(yīng)用較廣，美國食品藥品管理局已批準(zhǔn)其相關(guān)抑制劑納武單抗用于臨床[22]。癌癥免疫治療通過刺激機體的免疫系統(tǒng)識別和殺傷腫瘤細胞，對機體正常組織的損害極小，但仍存在一些問題，如潛在的嚴(yán)重不良反應(yīng)、僅對部分患者有反應(yīng)、對實體腫瘤免疫治療的療效不及化療或放療等[30-31]。與單獨免疫治療相比，鐵死亡聯(lián)合免疫療法是一種非常有前途的治療癌癥的方法[22]。鐵死亡與免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)，CD8+T細胞可以通過釋放γ干擾素下調(diào)SLC(solute carrier)3A2和SLC7A11的表達，抑制細胞對胱氨酸的攝取，促進腫瘤細胞的脂質(zhì)過氧化和鐵死亡[32]。Zhang等[33]構(gòu)建的仿生磁小體將四氧化三鐵磁性納米顆粒包覆在白細胞膜上，并將轉(zhuǎn)化生長因子-β抑制劑Ti包裹在膜內(nèi)，將程序性細胞死亡受體1抗體固定在表面，靜脈給藥后，基于磁性四氧化三鐵核心實現(xiàn)磁共振成像引導(dǎo)的藥物輸送；在腫瘤組織內(nèi)，轉(zhuǎn)化生長因子-β抑制劑Ti和Pa協(xié)同創(chuàng)造免疫原微環(huán)境，提高H2O2水平，從而促進鐵離子參與的芬頓反應(yīng)；芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的毒性羥自由基，可引發(fā)腫瘤細胞的鐵死亡，通過死亡細胞釋放的腫瘤抗原反過來促進微環(huán)境的免疫原性。

2.2.3鐵死亡聯(lián)合多種療法的Nano-DDS 鐵死亡聯(lián)合單一的治療方式有時并不能滿足患者的個體化需求，將兩種或兩種以上的治療方法與鐵死亡整合到一個系統(tǒng)中，可以產(chǎn)生更好的療效[34-35]。Bi等[36]構(gòu)建的多功能Nano-DDS由上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子、鉑前體藥物和鐵酸鋅納米粒子同時整合PDT、化療和鐵死亡來協(xié)同治療癌癥；在近紅外光處理下，上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子將低能光子轉(zhuǎn)化為高能光子，促進腫瘤細胞中PDT和鐵酸鋅納米粒子引發(fā)的芬頓反應(yīng)；同時，上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子還具有近紅外激發(fā)、上轉(zhuǎn)換發(fā)光、磁共振成像等特性，因此該Nano-DDS可用于癌癥的多模式影像診斷和高效治療。但每個系統(tǒng)的精確效應(yīng)及如何精確調(diào)控、多個納米系統(tǒng)之間是否存在相互作用、納米材料的疊加是否會在人體中產(chǎn)生長期毒性等問題仍需進一步實驗驗證。

3 小 結(jié)

鐵死亡作為一種新的治療靶點，是目前腫瘤生物學(xué)和抗癌治療的研究熱點，有望成為治療癌癥的重要手段。但仍需進一步探索鐵死亡發(fā)生的機制及作用靶點，充分認識由于鐵死亡誘導(dǎo)劑的免疫原性等而導(dǎo)致的不良反應(yīng)的機制，并有效解決因誘導(dǎo)劑導(dǎo)致的不良反應(yīng)。目前基于鐵死亡的Nano-DDS設(shè)計，還存在諸多問題：①基于鐵死亡的Nano-DDS組成復(fù)雜，潛在的不良反應(yīng)難以控制；②Nano-DDS結(jié)構(gòu)精密，藥物的工業(yè)化生產(chǎn)難度較大；③治療費用昂貴。相信隨著對基于鐵死亡的Nano-DDS研究的不斷深入，未來Nano-DDS可成為經(jīng)濟、有效的治療策略。