畢方川綜述 許紅梅審校

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院感染科 兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家兒童健康與疾病臨床 醫(yī)學(xué)研究中心 兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地 兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（重慶 400014）

手足口病（hand,foot,and mouth disease，HFMD）是一種常見的兒童傳染性疾病，其特征表現(xiàn)為發(fā)熱，口腔后部多發(fā)潰瘍及手、足底、臀部丘疹或皰疹，部分危重患兒可出現(xiàn)無菌性腦膜炎、急性弛緩性癱瘓、腦干腦炎、肺水腫、心肺衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥[1]。HFMD具有高度傳染性，可通過糞-口途徑、直接接觸、間接接觸及呼吸道飛沫等途徑進(jìn)行傳播[2]。HFMD通常發(fā)生于5歲以下兒童，全年均可發(fā)生，具有明顯的季節(jié)分布特點(diǎn)。每年4～8 月份和9～12 月份為亞太地區(qū)HFMD流行高峰期[3]。

HFMD 的致病原為腸道病毒，屬小RNA 病毒科腸道病毒屬，主要有柯薩奇病毒（Coxsackieviru，CV）A 組的4、5、6、7、9、10、16 型和B 組的1、2、3、5 型，?？刹《荆‥chovirus）的部分血清型和腸道病毒71型（Enterovirus A71，EV-A71）等。EV-A71具有較強(qiáng)的嗜神經(jīng)毒性，易引發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，是造成重癥HFMD的主要病原[4]。

1 EV-A71的流行病學(xué)

1969年EV-A71首次在美國加利福尼亞的神經(jīng)系統(tǒng)感染患兒糞便中被分離。20世紀(jì)70年代，澳大利亞、日本相繼報道EV-A71流行爆發(fā)，隨后馬來西亞（1986年）、中國臺灣（1998年）、中國大陸（2008年）先后報道EV-A 71 相關(guān)的HFMD 重大疫情[5]。此外，許多亞太地區(qū)國家每2～3 年會經(jīng)歷一次周期性的EV-A 71 爆發(fā)。

EV-A 71 分為A、B、C 基因組。A 組為原型EVA 71 病毒株（BrCr-CA-70），B 組分為B 1～B 5 五種亞基因型，C 組分為C 1～C 5 五種亞基因型[6]。1997 年后亞太地區(qū)流行的EV-A71以B、C組為主，主要包括B3～B5、C1～C4；1963年至1990年期間，歐美地區(qū)流行的EV-A71以B1、B2為主，1990年以后逐漸被C組替代，此后C1、C2成為歐美地區(qū)的主要基因型別[7]。

2 EV-A71的結(jié)構(gòu)

EV-A71是無包膜小RNA病毒，直徑24～30 nm。EV-A 71 基因組為單股正鏈RNA，大約由7 411 個核苷酸組成，具有一個完整的開放編碼框，可編碼大約含2 100 個氨基酸的蛋白，該蛋白可進(jìn)一步形成P 1、P2、P3三種前體蛋白。P1前體蛋白可裂解形成VP0、VP1、VP3蛋白，VP0進(jìn)一步裂解形成VP2和VP4蛋白，VP 1、VP 2、VP 3、VP 4 屬于結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成病毒衣殼，主要參與免疫應(yīng)答。P2、P 3 前體蛋白裂解形成2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D共7種非結(jié)構(gòu)蛋白[8]，主要控制病毒的復(fù)制和毒力。開放閱讀框的兩側(cè)是5’非編碼區(qū)和3’非編碼區(qū)，5’非編碼區(qū)參與基因復(fù)制、翻譯[6]。EV-A71病毒衣殼由60個結(jié)構(gòu)蛋白原聚體組成，包含VP1、VP2、VP3和VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白，VP1、VP2及VP3位于衣殼外部，VP4位于衣殼內(nèi)部[8]。

3 EV-A71疫苗

在研的EV-A 71 疫苗包括滅活全病毒疫苗、減毒活疫苗、病毒樣顆粒疫苗、重組VP1蛋白疫苗和合成多肽疫苗。目前僅有滅活EV-A71全病毒疫苗完成Ⅲ期臨床試驗(yàn)并已廣泛應(yīng)用。

3.1 滅活全病毒疫苗

滅活全病毒疫苗是利用理化方法處理人工大量培養(yǎng)的完整病毒，使其喪失感染性和毒性而保持其免疫原性，并結(jié)合相應(yīng)的佐劑而制成的疫苗。迄今為止，中國大陸、中國臺灣、新加坡已開發(fā)了完整的滅活全病毒EV-A71疫苗。

科興生物技術(shù)有限公司（Sinovac）、微谷生物技術(shù)有限公司（Vigoo）和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所（CAMS）于2010年至2011年完成滅活全病毒EVA71疫苗的Ⅰ期臨床試驗(yàn)，于2013年完成Ⅲ期臨床試驗(yàn)，并于2015年獲得中國食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)正式投入使用。這三個單位使用不同的病毒株開發(fā)疫苗，分別為：H 07 菌株、FY 7 VP 5 菌株、FY-23 菌株，均屬于EV-A71 C4亞型，是中國最常見的EV-71A亞型。CAMS使用KMB-17人類二倍體細(xì)胞作為細(xì)胞庫使用細(xì)胞工廠擴(kuò)增EV-A71病毒，Vigoo和Sinovac使用Vero 細(xì)胞作為細(xì)胞庫分別通過微載體生物反應(yīng)器和細(xì)胞工廠擴(kuò)增EV-A71病毒。三個單位均使用甲醛滅活EV-A71病毒，并添加鋁明礬佐劑來制備EV-A71滅活全病毒疫苗。

Sinovac的Ⅲ期臨床試驗(yàn)納入10 077名6～35月齡的嬰幼兒，隨機(jī)接受400 U 滅活EV-A 71 全病毒疫苗（5 044名）或安慰劑（5 033名，ClinicalTrials.gov，編號NCT01507857）。在第1年監(jiān)測期內(nèi)，其針對EV-A71相關(guān)HFMD 或皰疹性咽峽炎的保護(hù)率為94.8%，針對EV-A71相關(guān)的住院及神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的保護(hù)率為100%[9]。其中9 595 名嬰幼兒繼續(xù)隨訪，第2 年針對EV-A71相關(guān)疾病的保護(hù)率為95.1%，且兩年總體保護(hù)率為94.7%。同時還證實(shí)，接種疫苗后能針對EVA71不同基因型（B4、B5、C2和C5型）產(chǎn)生交叉免疫，但對CV-A 16 等其他腸病毒相關(guān)的HFMD 保護(hù)率僅為6.8%，不具備交叉保護(hù)能力[10]。其中343名受試者繼續(xù)隨訪至5年，仍具有較高滴度的特異性免疫抗體，提示Sinovac EV-A71疫苗具有長期的免疫持久性[11]。兩組受試者產(chǎn)生的不良反應(yīng)相似，最常見的全身不良反應(yīng)為發(fā)熱、腹瀉和食欲不振，最常見的注射部位不良反應(yīng)是局部發(fā)紅、硬化和疼痛。實(shí)驗(yàn)期間，共報道242例嚴(yán)重疫苗接種不良事件（疫苗組111例、發(fā)生率2.2%，對照組131 例、發(fā)生率2.6%），但沒有受試者因接種疫苗死亡，提示該疫苗具有良好的安全性[9]。

Vigoo 的Ⅲ期臨床試驗(yàn)納入10 245 名6～35 月齡嬰幼兒，分別接受320 U 滅活EV-A 71 全病毒疫苗（5 120 名）或安慰劑（5 125 名，ClinicalTrials.gov，編號NCT 01508247）。在1 年的監(jiān)測期內(nèi)，其針對 EV-A 71 相關(guān)HFMD 的疫苗效力為90%，針對其他EV-A71相關(guān)疾病的疫苗效力為80.4%[12]；在第2年的隨訪中，針對EV-A 71 相關(guān)HFMD 的兩年總體疫苗效力為94.42%，第2 年疫苗效力為100%，提示該疫苗能提供持續(xù)的保護(hù)[13]。實(shí)驗(yàn)期間，疫苗組有62例（1.2%）出現(xiàn)嚴(yán)重的不良事件，安慰劑組有75 例（1.5%），兩組嚴(yán)重不良事件發(fā)生率無顯著差異[12]。

CAMS 的Ⅲ期臨床試驗(yàn)納入12 000 名6～71 月齡嬰幼兒，分別接受100 U 的滅活EV-A 71 全病毒疫苗（6 000名）或安慰劑（6 000名，ClinicalTrials.gov，編號NCT 01569581）。在第1 年的監(jiān)測期內(nèi)，其針對 EV-A 71 相關(guān)HFMD 的疫苗效力為97.4%，對CVA16等其他腸病毒引起的HFMD不具有保護(hù)作用[14]。

中國臺灣研制的滅活EV-A 71 全病毒疫苗采用EV-A 71 臨床分離株E 59 菌株（B 4 亞型）[15]。于2019 年啟動Ⅲ期臨床試驗(yàn)（ClinicalTrials.gov，編號NCT03865238），預(yù)計將于2022年完成。新加坡使用B3亞型，已完成Ⅰ期臨床研究[16]。

以上研究表明，滅活EV-A 71 全病毒疫苗具有良好的保護(hù)性和安全性，但僅能預(yù)防部分EV-A71感染，仍需進(jìn)行進(jìn)一步研究。

3.2 減毒活疫苗

減毒活疫苗是通過將微生物的自然強(qiáng)毒株通過物理、化學(xué)或生物學(xué)等方法進(jìn)行處理而制成的疫苗，減毒活疫苗喪失致病力或只引起亞臨床感染，但仍保持良好的免疫原性。

研究者參照脊髓灰質(zhì)炎病毒減毒的策略對 EV-A 71 BrCr 株基因組5’非編碼區(qū)、3 D基因和3’非編碼區(qū)進(jìn)行變異，得到EV-A 71 減毒株（S 1-3’）。接種了EV-A 71（S 1-3’）的食蟹猴可在致死劑量的 EV-A 71 攻擊下存活，產(chǎn)生針對EV-A 71 不同基因型（A、B1、B4、C2和C4型）的中和抗體，但部分猴子接種疫苗后出現(xiàn)震顫，并在脊髓中分離出減毒病毒[17]。研究表明，EV-A71減毒活疫苗是可行的，但應(yīng)該進(jìn)一步改善疫苗的安全性。近年來出現(xiàn)了一種使用密碼子去優(yōu)化病毒制備減毒疫苗的方法，研究者將病毒特定氨基酸對應(yīng)優(yōu)選密碼子替換為與之對應(yīng)的最不優(yōu)選密碼子，使其雙核苷酸CpG和UpA水平升高，從而降低病毒的毒力及生存能力[18]。研究顯示，通過對病毒3D RNA聚合酶的L123F和G64R兩處氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行修飾，構(gòu)建高保真的EV-A 71 減毒株，接種該減毒株小鼠產(chǎn)生針對EV-A71的特異性中和抗體且未產(chǎn)生體質(zhì)量減輕、癱瘓、死亡等嚴(yán)重不良反應(yīng)。提示該減毒株具有較高的免疫原性及較低的毒力[19]。密碼子去優(yōu)化是一種開發(fā)安全穩(wěn)定的減毒疫苗的新方法。

3.3 病毒樣顆粒疫苗

病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）是由病毒單一或多個結(jié)構(gòu)蛋白自行裝配而成的高度結(jié)構(gòu)化的蛋白質(zhì)顆粒，在形態(tài)特征和抗原性上與天然病毒顆粒相似，具備激發(fā)宿主免疫反應(yīng)的能力。VLP 不含病毒基因組，不能自發(fā)復(fù)制感染，是構(gòu)建候選疫苗的安全 之選。

基于制備脊髓灰質(zhì)炎病毒VLP疫苗的經(jīng)驗(yàn)，可構(gòu)建昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，制備EV-A71 B5亞型VLP疫苗。該疫苗能誘導(dǎo)恒河猴產(chǎn)生高水平的針對EV-A71不同亞型（B4、B5、C2和C4亞基因型）的特異性抗EV-A71病毒IgG和IgM，阻止EV-A71在恒河猴中傳播[20]。除桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)外，EV-A71 VLP 還可以在酵母中產(chǎn)生，使用畢赤酵母表達(dá)EV-A 71 VLP，能有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對同源和異源EV-A 71株的中和抗體，還能通過母體免疫保護(hù)新生小鼠免于EV-A71攻擊[21]。EV-A71 VLP疫苗具有良好的保護(hù)效果，具較高安全性且易于制備，是優(yōu)質(zhì)的EV-A71候選疫苗，但VLP疫苗的生產(chǎn)成本較高，產(chǎn)量相對較低，仍需進(jìn)一步改進(jìn)。

3.4 重組VP1蛋白疫苗

病原體引起免疫反應(yīng)的主要成分是抗原蛋白上的抗原決定簇，抗原決定簇是由數(shù)量不等的抗原表位組成。EV-A71的主要抗原表位大多位于VP1蛋白。

將重組桿狀病毒Bac-Pie1-gp64-VP1轉(zhuǎn)入昆蟲細(xì)胞后成功表達(dá)了C4亞基因EV-A71的VP1，這種VP1蛋白與原始病毒VP 1 蛋白具有相同的形態(tài)結(jié)構(gòu)及免疫原性。小鼠接種這種重組蛋白后能產(chǎn)生高滴度的針對EV-A71病毒所有基因亞型的中和抗體[22]。研究顯示，通過基因重組技術(shù)獲得包含gag蛋白（人免疫缺陷病毒結(jié)構(gòu)性多蛋白Pr 55 gag 的前體蛋白）和EV-A 71 VP1 蛋白的VLP（gag-VP1 VLP）。這種疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，還能通過母體免疫保護(hù)新生小鼠免受致命劑量EV-A71的攻擊[23]。以上研究表明，重組VP1蛋白疫苗能同時誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，并能對不同亞基因型的EV-A71產(chǎn)生交叉中和作用，具有較好的發(fā)展前景。但VP1蛋白疫苗的保護(hù)作用仍需進(jìn)一步強(qiáng)化。

3.5 合成肽疫苗

合成肽疫苗是根據(jù)病原體抗原表位或者抗原決定簇氨基酸序列特點(diǎn)而開發(fā)設(shè)計的一類疫苗。這種疫苗通過人工合成病原微生物的保護(hù)性多肽或抗原表位，并輔以適當(dāng)?shù)妮d體與佐劑而制成的一種新型基因工程疫苗。

EV-A 71 病毒上的多肽SP 70 位于VP 1 蛋白，是EV-A71的主要中和表位的重要組成之一。研究顯示，利用B 4 亞基因型EV-A 71 的SP 70 免疫小鼠，小鼠可產(chǎn)生同原病毒免疫相似效價的特異性IgG，且能對B2、B5、C2、C4亞基因型病毒產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng)[24]。抗SP70血清能對同源及異源EV-A71（B2、B4、B5、C2、C4）的攻擊提供較強(qiáng)的保護(hù)作用[25]。

研究發(fā)現(xiàn)，CV-A16抗原表位PEP71能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對同源和異源CV-A 16 菌株的中和抗體；且CV-A16 的SP70肽的氨基酸排列與PEP71高度重疊，提示SP 70 可能同樣具有開發(fā)通用CV-A 16 疫苗的潛力[26]?；诖搜芯?，將EV-A 71 VLP 中的SP 70 肽替換為CV-A 16 的SP 70 肽，設(shè)計一個嵌合的EV-A 71 VLP（ChiEV-A71 VLP）。這種疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對EV-A 71 和CV-A 16 的特異性體液免疫，還能誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞IFN-c，IL-2，IL-4和IL-6顯著升高，激活小鼠針對EV-A71的有效細(xì)胞免疫應(yīng)答；小鼠注射抗ChiEV-A71血清后可在致死量的EV-A71和 CV-A16攻擊下存活。研究提示，抗ChiEV-A71血清能同時具有針對EV-A71和CV-A16感染的保護(hù)作用[27]。

合成肽疫苗具有較高的特異性、較好的免疫原性和保護(hù)性。通過研究不同抗原肽的保護(hù)作用，并選擇不同抗原肽嵌合腸道病毒VLP 制備疫苗的方法可能是制備多價HFMD疫苗的新思路。

綜上，EV-A 71 是最具致病性的腸道病毒之一，雖然我國研發(fā)的EV-A71滅活疫苗已批準(zhǔn)上市，但該疫苗仍需進(jìn)行進(jìn)一步的遠(yuǎn)期評估。同時也要繼續(xù)深入研究減毒活疫苗，病毒樣顆粒疫苗、重組VP1蛋白疫苗、合成多肽疫苗等新型疫苗，需在保證疫苗安全性的前提下，進(jìn)一步提高其保護(hù)效力及生產(chǎn)能力。同時，除EV-A 71 以外，CV-A 16 和近年來新興的腸道病毒如CV-A6、CV-A8和CV-A10等也與HFMD的暴發(fā)有關(guān)[28-30]。因此研制預(yù)防多種腸道病毒感染的聯(lián)合疫苗將是預(yù)防HFMD疫苗的重要研究方向。