席曉萌，姜云鴿，王 琳，黃相中，田 凱

(1.云南民族大學(xué) 理論與計(jì)算化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國(guó)家民族事務(wù)委員會(huì)-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

糖尿病是一種全球性的常見(jiàn)的慢性疾病，是由遺傳、肥胖、免疫功能紊亂及感染等因素造成的，該病會(huì)使患者的胰島功能減退甚至喪失生物功能，從而導(dǎo)致糖、蛋白質(zhì)、電解質(zhì)代謝紊亂，進(jìn)而引發(fā)高血糖癥[1-2].患者如果長(zhǎng)期不能控制自己的血糖達(dá)到正常水平，就會(huì)引發(fā)全身性的糖尿病并發(fā)癥，諸如糖尿病腎病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、動(dòng)脈粥樣硬化等[3-4].現(xiàn)階段，糖尿病已成為危害人類健康的重要疾病之一，防治糖尿病及其并發(fā)癥是一項(xiàng)關(guān)乎全人類健康的艱巨工程.糖尿病患者一經(jīng)發(fā)病，往往很難治愈，只能終生服用各類降糖類藥物或者注射胰島素.

在上世紀(jì)八十年代，臨床研究發(fā)現(xiàn)了α-葡萄糖苷酶抑制劑，并且將其研制成為了一種新型口服降糖類藥物，該藥在治療過(guò)程中特別是對(duì)餐后血糖的控制上有著較大的優(yōu)勢(shì)：食物當(dāng)中含有大量的碳水化合物，經(jīng)過(guò)口腔唾液和胰淀粉酶的消化作用后會(huì)變成含有少量葡萄糖分子的低聚糖，而α-葡萄糖苷酶則會(huì)在這些低聚糖的非還原末端產(chǎn)生作用，進(jìn)而釋放葡萄糖，通過(guò)小腸粘膜細(xì)胞吸收后進(jìn)入到血液循環(huán)當(dāng)中，導(dǎo)致血糖升高[5].而α-葡萄糖苷酶抑制劑可以降低機(jī)體對(duì)葡萄糖的吸收，同時(shí)也能抑制機(jī)體內(nèi)碳水化合物的代謝，并將原有的葡萄糖分子進(jìn)行分解，成為小分子葡萄糖.所以，這類抑制劑能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)機(jī)體血糖良好的控制，尤其是在調(diào)控2型糖尿病時(shí)更加有效，特別適合中老年糖尿病患者的使用.這類藥物主要包括阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖等[6-7].

黃酮類化合物泛指通過(guò)一個(gè)三碳原子實(shí)現(xiàn)2個(gè)酚羥基的苯環(huán)(A環(huán)，B環(huán))的聯(lián)結(jié)，由此所形成的若干種化合物，其基本母核為2-苯基色原酮.黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中常連接有酚羥基、甲氧基、甲基、異戊烯基等官能團(tuán).此外，它還常與糖結(jié)合成苷[8].黃酮類化合物廣泛存在于天然的植物和中草藥中，正是依賴于這些中草藥，使黃酮類化合物的獲取變得相對(duì)容易，給研究開(kāi)展提供了便利.表1展示的是一些黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)式：

表1 常見(jiàn)的黃酮類化合物結(jié)構(gòu)式

研究表明，黃酮類化合物的生理活性與藥理活性都相對(duì)較多，在抗炎癥、抗氧化、抗糖尿病并發(fā)癥以及抗癌癥等方面都能夠產(chǎn)生一定的療效[9-11].黃酮類化合物擁有毒性低的特點(diǎn)，在一些食物或者化妝品中都有添加.近幾年來(lái)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)葛根異黃酮類化合物具有降血糖、降血脂及擴(kuò)張冠狀血管的作用[12]；梅桂雪等[13]研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物可以通過(guò)抑制 Maillard 反應(yīng)、增強(qiáng)機(jī)體對(duì)葡萄糖的攝取、抑制醛糖還原酶、促進(jìn)胰島素的分泌、作用于血管緊張素、抑制α-葡萄糖苷酶等，發(fā)揮防治糖尿病的作用；銀杏黃酮能使患有2型糖尿病的病人血小板中丙二醛的水平顯著降低，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)β細(xì)胞更為有效的保護(hù)，同時(shí)還能夠使細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的濃度相應(yīng)提升，通過(guò)其對(duì)蛋白激酶Ⅱ的依賴性，實(shí)現(xiàn)對(duì)胰島素分泌的調(diào)控[14].現(xiàn)階段，新型的、高效的、低毒的抗糖尿病藥物是藥物研發(fā)的主流，依據(jù)黃酮類化合物的多種優(yōu)勢(shì)，可以將其作為研制新型α-葡萄糖苷酶抑制劑類抗糖尿病藥物的活性組分.

分子對(duì)接(molecular docking)是指從藥物小分子以及蛋白大分子各自的三維結(jié)構(gòu)入手，檢驗(yàn)兩者能不能結(jié)合，同時(shí)預(yù)測(cè)結(jié)合模式和親合力的一種理論模擬方法.尋找藥物分子與受體蛋白之間合理的結(jié)合模式，是分子對(duì)接的根本[15].當(dāng)前，計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)(computer aided drug design，CADD)成為藥物研發(fā)中比較靠譜的新方法，而分子對(duì)接技術(shù)作為CADD的重要方法之一，由于相對(duì)廉價(jià)及效果突出，成為了尋找和檢索先導(dǎo)化合物的重要手段[16].α-葡萄糖苷酶是糖苷水解酶大家族中的一大類酶，主要功能為水解葡萄糖苷鍵，釋放出葡萄糖作為產(chǎn)物，是生物體糖代謝途徑中不可或缺的一類酶.α-葡萄糖苷酶來(lái)源廣泛，幾乎存在于所有以碳水化合物為能源的且具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物體內(nèi)，因此可以作為分子對(duì)接中的受體蛋白使用.常用的分子對(duì)接軟件有Dock、AutoDock和Discovery Studio等，本文將使用Discovery Studio 2.5軟件中的半柔性對(duì)接(Libdock)模塊來(lái)進(jìn)行分子對(duì)接分析[17-18]，用以揭示受體蛋白(α-葡萄糖苷酶)和藥物(黃酮類化合物)之間的相互作用關(guān)系，為研制新型α-葡萄糖苷酶抑制劑類抗糖尿病藥物提供理論計(jì)算基礎(chǔ).

1 計(jì)算詳情

1.1 配體小分子的準(zhǔn)備

本文所使用的44個(gè)黃酮類化合物均由云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國(guó)家民族事務(wù)委員會(huì)-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供.將上述小分子分別用DS軟件畫(huà)出，保存為sdf格式文件，并放在同一文件夾下.為了實(shí)現(xiàn)批量的在DS軟件中進(jìn)行分子對(duì)接分析，將上述文件夾中的44個(gè)sdf文件整合成一個(gè)復(fù)合的文件，DS軟件可以一次性地對(duì)所有配體小分子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行讀取.

1.2 受體蛋白的準(zhǔn)備

通過(guò)RCSB PDB(http://www1.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)按照關(guān)鍵詞“α-glucosidase”進(jìn)行搜索，獲取相應(yīng)的PDB格式的蛋白.本文使用的是PDB編號(hào)為3TOP的蛋白作為受體蛋白進(jìn)行分子對(duì)接研究.

1) 將下載好的蛋白通過(guò)DS 2.5軟件打開(kāi)，進(jìn)行去水、加氫、補(bǔ)充非完整氨基酸殘基等操作；

2) 將蛋白顯示方式更改為絲帶狀顯示，以方便后續(xù)觀察；

3) 將蛋白定義為受體分子，并選擇自動(dòng)查找可能的有效結(jié)合位點(diǎn)，這樣有助于獲取活性較高的位點(diǎn)；

4) 給結(jié)合位點(diǎn)定義球型區(qū)域，每個(gè)位點(diǎn)要單獨(dú)定義，區(qū)域在完全包裹位點(diǎn)的前提下盡可能小，以此來(lái)提高對(duì)接效率和精度.

1.3 分子對(duì)接仿真運(yùn)行

將處理后的受體蛋白通過(guò)DS軟件中Protocols面板中Dock Ligand (Libdcok)方法與小分子復(fù)合文件進(jìn)行分子對(duì)接分析.部分對(duì)接示意圖如圖1所示.

圖1 44個(gè)黃酮類小分子與3TOP蛋白8號(hào)位點(diǎn)分子對(duì)接示意圖

2 結(jié)果與分析

自動(dòng)獲取的活性位點(diǎn)是按照活性大小從高往低排列的，該計(jì)算中受體蛋白一共獲取了33個(gè)位點(diǎn)，選取其中前8個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行分析，以LibDock Score打分為標(biāo)準(zhǔn)，分?jǐn)?shù)排在第1位的就是軟件認(rèn)為最好的結(jié)合方式.文中選取了8個(gè)位點(diǎn)對(duì)接結(jié)果中排名前10的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行分析，前10個(gè)對(duì)接結(jié)果如表2所示.

由表2可以看出，HT15配體與受體蛋白3TOP對(duì)接分?jǐn)?shù)最高，說(shuō)明HT15分子與蛋白結(jié)合程度最為緊密；之后的HT18、HT7一直到HT21配體對(duì)接分?jǐn)?shù)都達(dá)到了130以上，說(shuō)明這些配體與受體蛋白也具有強(qiáng)的相互作用.推測(cè)以上配體可能是抑制α-葡萄糖苷酶的有效成分.為了方便觀察與分析配體與受體之間的相互作用，將上述對(duì)接排名前四的結(jié)果生成三維圖和二維圖.

表2 對(duì)接結(jié)果分?jǐn)?shù)表(排名前10)

續(xù)表2

圖2和圖3展示的是HT15分子與3TOP蛋白對(duì)接結(jié)果三維和二維圖，由上圖可知，配體和受體之間存在強(qiáng)的相互作用，主要作用類型包括氫鍵、π鍵、π-π共軛效應(yīng)和疏水作用等，例如：HT15與蛋白3TOP的殘基ASN 1583、CYS 1249、GLU 1258、SER1261、HIS 1584形成了5個(gè)氫鍵，具有很強(qiáng)的氫鍵作用；TRY1253與配體的芳香環(huán)形成了穩(wěn)定的π-π疏水堆積作用；ARG 1250和LEU1262的陽(yáng)離子與苯環(huán)的π電子之間存在p-π共軛效應(yīng)；ASP1593與ARG1591也有相似的作用，其陰離子與配體的苯環(huán)形成了共軛效應(yīng)；此外，HT15與一些疏水氨基酸如ASN1585、GLN1592、LEU1248、ILE1259、GLU1265存在很強(qiáng)的疏水作用，推測(cè)ARG1591在HT15與3TOP相互作用中起到了關(guān)鍵作用.以上結(jié)果說(shuō)明HT15分子與3TOP受體蛋白之間存在強(qiáng)的抑制作用.

圖2 HT15分子與3TOP蛋白8號(hào)位點(diǎn)對(duì)接三維圖

圖3 HT15分子與3TOP蛋白8號(hào)位點(diǎn)對(duì)接二維圖

圖4和圖5展示的是HT18分子與3TOP蛋白對(duì)接結(jié)果的三維和二維圖，由上圖可知，配體和受體之間存在強(qiáng)的相互作用，主要作用類型包括氫鍵、π-π共軛效應(yīng)和疏水作用等.例如：HT18與3TOP蛋白殘基ARG1504、ILE 1758形成了2個(gè)氫鍵，附近也存在一些較弱的碳?xì)滏I，如ASP1759；HIS1627與配體的芳香環(huán)形成穩(wěn)定的π-π疏水堆積作用，VAL1237和MET1238的陽(yáng)離子與苯環(huán)的π電子之間存在p-π共軛效應(yīng)；此外，HT18與一些疏水氨基酸如HIS1624、TYR1761、PHE1751、ASP1753、THR1760、SER1757、TYR1494、GLN1498、TRP1519、ARG1518、THR1628存在很強(qiáng)的疏水作用.以上結(jié)果說(shuō)明HT18分子與3TOP受體蛋白之間存在強(qiáng)的抑制作用.

圖4 HT18分子與3TOP蛋白6號(hào)位點(diǎn)對(duì)接三維圖

圖6和圖7展示的是HT7分子與3TOP蛋白對(duì)接結(jié)果的三維和二維圖，由上圖可知，配體和受體之間存在強(qiáng)的相互作用，主要作用類型包括氫鍵、π鍵和疏水作用等.例如：HT7與3TOP蛋白殘基SER1261、CYS 1249、ASN1583形成了3個(gè)氫鍵，具有很強(qiáng)的氫鍵作用；LEU1262、ARG1250和ARG1591的陽(yáng)離子與苯環(huán)的π電子之間存在p-π共軛效應(yīng)；ASP1593與ARG1591也有相似的作用，其陰離子與配體的苯環(huán)形成了共軛效應(yīng)；此外,HT7與一些疏水氨基酸如GLU1258、GLU1265、TYR1253、GLN1592、ASN1585、HIS1584、LEU1248存在很強(qiáng)的疏水作用，推測(cè)ARG1591在HT7與3TOP相互作用中起到了關(guān)鍵作用.以上結(jié)果說(shuō)明HT7分子與3TOP受體蛋白之間存在強(qiáng)的抑制作用.

圖6 HT7分子與3TOP蛋白8號(hào)位點(diǎn)對(duì)接三維圖

圖7 HT7分子與3TOP蛋白8號(hào)位點(diǎn)對(duì)接二維圖

圖8和圖9展示的是HT17分子與3TOP蛋白對(duì)接結(jié)果的三維和二維圖，由上圖可知，配體和受體之間存在強(qiáng)的相互作用，主要作用類型包括氫鍵、π鍵和疏水作用等.例如：HT17與3TOP蛋白殘基ARG 1410、ARG1333、GLU1397形成了4個(gè)氫鍵，具有很強(qiáng)的氫鍵作用，值得注意的是，GLU1397不僅提供氫鍵的受體，本身形成氫鍵也提供了質(zhì)子，附近也存在一些較弱的碳?xì)滏I，如GLU 1400、PHE 1289；LEU1412、LEU1401和PRO1405的陽(yáng)離子與苯環(huán)的π電子之間存在p-π共軛效應(yīng)；GLU1400與ARG1410也有相似的作用，其陰離子與配體的苯環(huán)形成了共軛效應(yīng)；PRO1329與配體形成了穩(wěn)定的p-π疏水堆積作用；此外，HT17與一些疏水氨基酸如PRO1299、SER1411、GLN1406、ASN1404、ALA1330、TYR1282、THR1290、LEU1291存在很強(qiáng)的疏水作用，推測(cè)ARG1410和GLU1397在HT17與3TOP相互作用中起到了關(guān)鍵作用.以上結(jié)果說(shuō)明HT17分子與3TOP受體蛋白之間存在強(qiáng)的抑制作用.

圖8 HT17分子與3TOP蛋白3號(hào)位點(diǎn)對(duì)接三維圖

圖9 HT17分子與3TOP蛋白3號(hào)位點(diǎn)對(duì)接二維圖

3 結(jié)語(yǔ)

一個(gè)新藥的問(wèn)世，是一個(gè)十分漫長(zhǎng)的過(guò)程.在藥物的篩選過(guò)程中，如果每一個(gè)新化合物都進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn)研究，那將浪費(fèi)很多人力、物力、財(cái)力，且根本無(wú)法跟上新化合物發(fā)現(xiàn)的節(jié)奏.計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)開(kāi)拓了新的藥物研究領(lǐng)域和方法，從分子水平研究藥物與受體相互作用.利用計(jì)算機(jī)虛擬藥物篩選技術(shù)篩選化合物作用靶點(diǎn)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供強(qiáng)有力的理論支撐，使得實(shí)驗(yàn)研究具有較強(qiáng)的導(dǎo)向性.

文中主要采用分子對(duì)接的方法，研究了實(shí)驗(yàn)室獲得的幾十種黃酮類化合物與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合模式和作用機(jī)制，明確了可能的結(jié)合位點(diǎn)，旨在從分子水平上闡明藥物分子與蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)系.本文基于受體蛋白分子3TOP的晶體結(jié)構(gòu)，通過(guò)一系列模擬計(jì)算，推測(cè)出ARG1591、ARG1410和GLU1397可能為受體的活性位點(diǎn)殘基；得到了排名前十的對(duì)接結(jié)果，進(jìn)一步篩選出9個(gè)可以起到較強(qiáng)抑制作用的黃酮類化合物：HT15、HT18、HT7、HT17、HT23、HT2、HT16、HT43、HT21，它們是通過(guò)不同的位點(diǎn)發(fā)揮藥效；選擇上述前4結(jié)果生成相互作用模式圖并加以分析，證實(shí)了上述黃酮類化合物作為α-葡萄糖苷酶抑制劑的可行性，說(shuō)明了本研究應(yīng)用上述介紹的分子優(yōu)化對(duì)接方法來(lái)進(jìn)行相關(guān)計(jì)算是可靠的，能夠?yàn)樾滦挺?葡萄糖苷酶抑制劑藥物的研究提供一定的理論計(jì)算依據(jù).