李昊 耿紅江 管清磊 王其宏

摘要：眾所周知，基因毒性雜質(zhì)具有突變性和致癌性，會對DNA造成極大的損傷，進(jìn)而嚴(yán)重危害人類的生命健康。此外，自“纈沙坦事件”后，N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)成為了業(yè)界內(nèi)的研究熱點(diǎn)。本文介紹了在藥品領(lǐng)域的N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)分析方法研究進(jìn)展，主要包括前處理方法和定量方法，旨在為廣大研究者針對藥品基質(zhì)中N-亞硝胺類化合物的分析方法選擇、開發(fā)和驗(yàn)證提供思路。

關(guān)鍵詞：基因毒性雜質(zhì);N-亞硝胺;分析方法;研究進(jìn)展

【中圖分類號】R97 ? ? ? ? ? ? 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A ? ? ? ? ? ? 【文章編號】2107-2306（2021）0910--02

1.研究背景

基因毒性雜質(zhì)也被稱作遺傳毒性雜質(zhì)，是指能夠直接或間接損傷細(xì)胞DNA，并導(dǎo)致基因突變和可能引發(fā)癌變的化合物。N-亞硝胺是指亞硝基的氮原子與氨基中的氮原子相連，并在氨基上發(fā)生取代反應(yīng)而生成的一類化合物。此類化合物已被多項報道證明具有強(qiáng)突變性、強(qiáng)致癌性和高毒性，必須嚴(yán)格控制。

N-亞硝胺類化合物的結(jié)構(gòu)通式為R2（R1）N-N=O，主要結(jié)構(gòu)類型有7種：N-亞硝基二甲胺（NDMA）、N-亞硝基二乙胺（NDEA）、N- 亞硝基二丙胺（NDPA）、N-亞硝基二丁胺（NDBA）、N-亞硝基二異丙胺（NDIPA）、N-亞硝基乙基異丙胺（NEIPA）和N-硝基-N-甲基-4-氨基丁酸（NMBA）。N-亞硝胺類化合物具有多種生成方式，主要包括仲胺類化合物與亞硝酸之間的相互作用，叔胺類化合物與一氯胺之間的親核取代反應(yīng)，溶劑N，N-二甲基甲酰胺（DMF）的氧化，橡膠硫化劑與空氣中氮氧化合物相互作用和藥物在存儲或運(yùn)輸過程中不穩(wěn)定基團(tuán)（如二甲氨基）的降解。

自2018 年7 月華海藥業(yè)在纈沙坦原料藥中檢測出微量的NDMA，并觸發(fā)了歐盟審查和導(dǎo)致大量原料藥在國內(nèi)外被召回后，N-亞硝胺類雜質(zhì)就在藥學(xué)領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注。近三年內(nèi)，越來越多的藥物中被檢測出此類雜質(zhì)：2018年10月，EMA報道：印度的兩家藥企Hetero Labs和Aurobindo Pharma 生產(chǎn)的部分沙坦類藥物中也含有NDEA和NMBA，因此，EMA 將審查范圍擴(kuò)大至所有沙坦類藥物。后來，在其他類藥物中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了N-亞硝胺類雜質(zhì)：2019 年9 月到2020年4月，F(xiàn)DA 報道先后在雷尼替丁和二甲雙胍 中檢測出NDMA。2020年4月，F(xiàn)DA 發(fā)布公告：召回美國市場上雷尼替丁產(chǎn)品，該公告中提到某些產(chǎn)品中的NDMA 含量會隨著時間推移而有所增加，進(jìn)而可能導(dǎo)致雜質(zhì)含量高于可接受水平。同月，Amneal Pharmaceuticals 的3批尼扎替丁口服液中NDMA含量超過可接受水平，因此公司將該3批產(chǎn)品召回。截至目前，EMA 已將N-亞硝胺類雜質(zhì)的審查品種擴(kuò)大至7 種，也就是上述提到的7種。按照目前的發(fā)展趨勢，未來可能還會有更多的藥物被檢出此類雜質(zhì)，因此藥品行業(yè)各方必須給予高度重視。

2.分析方法

N-亞硝胺類雜質(zhì)廣泛存在于熏烤和腌制食品、化妝品、污水及煙草中，因此在這些領(lǐng)域的研究比較成熟，但是在藥品領(lǐng)域關(guān)于此類雜質(zhì)的研究報道卻比較少[1]。盡管在上世紀(jì)70年代針對藥品中的N-亞硝胺類化合物的研究就已經(jīng)開展，然而之后的三十多年則進(jìn)展緩慢[2]。直至2018年“纈沙坦事件”后，隨著各國藥監(jiān)部門對N-亞硝胺類雜質(zhì)越來越重視，對于此類雜質(zhì)的多種分析方法也被陸續(xù)發(fā)布。分析方法包括兩部分：前處理方法和定量方法。前處理方法包括用溶劑直接溶解、過濾、離心、萃取等;定量方法常見的有氣相色譜法（GC）、液相色譜法（HPLC）以及色譜-質(zhì)譜（MS）連用法，如GC-MS、GC-MS/MS、LC-MS、LC-MS/MS，此外還有熱能分析法（TEA）、紫外光譜法（UV）等。

2.1 氣相色譜法（GC）

N-亞硝胺類化合物大多揮發(fā)性較好，極性較大，因此GC法通常作為檢測此類化合物的首選方法，也是最早被發(fā)現(xiàn)的方法[3]。GC 的進(jìn)樣方式包括直接進(jìn)樣和頂空進(jìn)樣（HS）：前者更適合高沸點(diǎn)和熱穩(wěn)定性強(qiáng)的物質(zhì)，但基質(zhì)污染較大，前處理過程往往較復(fù)雜;后者的前處理過程較簡單，基質(zhì)污染少，但是對于不易揮發(fā)、高沸點(diǎn)和熱穩(wěn)定性強(qiáng)的物質(zhì)不太適用。分析N-亞硝胺類化合物，直接進(jìn)樣常用溶劑為低沸點(diǎn)溶劑，如二氯甲烷（DCM）、乙腈（ACN）、甲醇（MeOH）;而頂空進(jìn)樣常用溶劑為高沸點(diǎn)溶劑，如N-甲基吡咯烷酮（NMP）、二甲基亞砜（DMSO）。

早在40年前，有研究者就用GC-TEA法對含氨基拉明、二硫磷和土霉素的藥物進(jìn)行N-亞硝胺類化合物的檢測[3] 。結(jié)果表明，在幾乎所有藥物中均檢測到NDMA，最低檢測限可達(dá)1μg·kg-1。咸瑞卿等[4]建立了一種用GC-TEA檢測纈沙坦原料藥及制劑中NDMA含量的方法，結(jié)果證明，該方法專屬性強(qiáng)，線性范圍寬至10～1000ng·mL-1，檢測限低至3ng·mL-1，回收率為94%～100%。GC-TEA法作為最早被報道的方法，雖然分析N-亞硝胺類化合物專屬性較強(qiáng)，但TEA檢測器價格較昂貴，應(yīng)用范圍相對較窄，因此未能得到廣泛應(yīng)用。

2.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）

GC-MS法目前在測定N-亞硝胺類化合物方面得到了較為廣泛的應(yīng)用，該法利用了質(zhì)譜儀的準(zhǔn)確、快速、靈敏度和分辨率高等優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行定性和定量分析。GC-MS的離子源類型主要有電子轟擊離子源（EI）和化學(xué)電離源（CI）兩種，分析器主要是單四極桿（MS）和三重四極桿（MS/MS），一般情況下，三重四極桿可降低基質(zhì)干擾（共流出物的碎片或同位素峰）引起的假陽性的發(fā)生率，因此三重四極桿的靈敏度和準(zhǔn)確度更高。

李俊等人[5]報道了用GC-MS直接進(jìn)樣法測定坎地沙坦酯中微量NDMA和NDEA。他們在前處理時先用0.2mol.L-1氫氧化鈉溶液溶解樣品，然后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，盡管在樣品中檢出環(huán)己醇，但是對NDMA和NDEA的測試沒有干擾。結(jié)果表明，NDMA和NDEA定量限分別為0.06μg.g-1和0.03μg.g-1;NDMA和NDEA的平均回收率分別為88.7%和89.2%，證明該方法準(zhǔn)確度好，靈敏度高，簡便可靠，最重要的是前處理方式減小了基質(zhì)干擾。另外，姜俊等人[6]采用HS-GC-MS來減少基質(zhì)干擾：他們在測定厄貝沙坦中NDMA和NDEA時，以NMP溶解樣品后通過頂空進(jìn)樣方式進(jìn)行測試，此方法有效地避免了直接進(jìn)樣時高濃度基質(zhì)組分對色譜柱和氣化室的污染，也減少了基質(zhì)對待測物測定的干擾。測試結(jié)果表明，NDMA 和 NDEA 在 10～500ng /mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;NDMA和 NDEA的 定量限分別為5.18ng/ml和13.74ng/ml;NDMA回收率在103.5～104.6%，NDEA回收率在100.6～103.2%。說明該方法能夠有效地檢測厄貝沙坦原料藥中 NDMA 和 NDEA 的含量。

除了沙坦類藥物，有的研究者們同樣用GC-MS法在其余藥物中也檢出N-亞硝胺類雜質(zhì)。文松松等人[7]建立了GC-MS 法測定鹽酸二甲雙胍原料藥及制劑中痕量NDMA。他們直接以二氯甲烷作為提取溶劑，提取時間為30min。結(jié)果顯示，NDMA 的定量限為0.5ng/ml ;回收率為93.2%～97.9%;重復(fù)性低于7%。以上結(jié)果說明本方法靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確且重現(xiàn)性好。蔡英杰等人[8]采用GC-MS 法測定頭孢呋辛鈉中NDMA 和NDEA。他們以乙腈溶解、振蕩、離心后取上清液進(jìn)行測試。結(jié)果表明，NDMA 和NDEA 的定量限分別為0. 12μg/mL 和0. 04μg/mL;回收率為101. 7%～106. 3%。該方法操作簡單，能夠有效地檢測頭孢呋辛鈉中這兩種雜質(zhì)的含量。

2.3 液相色譜法（LC）

采用液相色譜法（LC）分析N-亞硝胺類雜質(zhì)，關(guān)于這方面的報道比較少，主要原因是LC法適用的雜質(zhì)限度通常在100ppm以上，但是各國藥品監(jiān)管部門普遍對N-亞硝胺類雜質(zhì)限度要求及其嚴(yán)格，目前EMA 和FDA 對N-亞硝胺類雜質(zhì)要求不得超過30ppb。因此，LC法的靈敏度不足限制了其在基因毒性雜質(zhì)領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用。各國藥品監(jiān)管部門中，只有法國國家藥品和保健品安全管理局發(fā)布了HPLC-UV法檢測纈沙坦原料藥及制劑中NDMA。

2.4 液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）

液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）具有高靈敏度、高分辨力、快速分析、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)，能夠滿足痕量毒性雜質(zhì)測試的要求。此方法已逐步取代LC法用于痕量雜質(zhì)的分析，在基因毒性雜質(zhì)領(lǐng)域（尤其是揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性較差的雜質(zhì)）應(yīng)用較廣泛。另外，LC-MS法相對GC-MS法靈敏度更高，離子源和分析器種類也更多。離子源最常用的是電噴霧電離源（ESI）和大氣壓化學(xué)電離源（APCI）;分析器除了單四極桿（MS）和三重四極桿（MS/MS）外，還包括飛行時間分析器（TOF）、軌道阱（Orbitrap）和離子阱（Iontrap）等。目前應(yīng)用最廣泛的分析方法是LC-MS/MS，尤其是對于限度較低（<1 ppm）的雜質(zhì)而言，此法是最合適的，因?yàn)長C-MS/MS 方法可降低基質(zhì)干擾造成的假陰性（離子抑制）或假陽性（共流出物或同位素干擾）發(fā)生可能性，可以滿足較嚴(yán)格的靈敏度、專屬性和準(zhǔn)確度要求。

研究者們在近三年內(nèi)陸續(xù)報道了用LC-MS法測定各種藥物中N-亞硝胺類雜質(zhì)。陳鴻玉等人[9]采用超高效液相色譜-大氣壓化學(xué)電離-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法（ UPLC-APCI-MS/MS） 測定鹽酸雷尼替丁膠囊中NDMA。他們用甲醇溶解樣品，而后經(jīng)振搖、離心和過濾，最后取上清液進(jìn)行測試。測試模式為正離子多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。結(jié)果表明，在1～500 ng·ml-1 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;回收率在99. 7%～103. 7% ;定量限為1ng·ml-1。因此該方法專屬性好、線性范圍寬且線性關(guān)系良好、準(zhǔn)確度和靈敏度都高、操作簡單，可以較好地滿足雷尼替丁膠囊中NDMA 的分析檢測。章為等人[10]同樣用UPLC-APCI-MS/MS 法測定二甲雙胍格列吡嗪片中NDMA含量。他們直接用水做提取劑，其他前處理過程與上述測定鹽酸雷尼替丁膠囊中NDMA時相同。測試模式同樣為正離子MRM模式。得到的結(jié)果：NDMA 在1.0699 ～106.99ng·ml-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;回收率在87.9% ～ 90.3%;定量限為0.89ng·ml-1。該方法操作簡便、靈敏度高、準(zhǔn)確度好，可用于二甲雙胍格列吡嗪片中NDMA 的測定。

雖然LC-MS法在分析N-亞硝胺類雜質(zhì)方面已得到廣泛應(yīng)用，但是大多數(shù)被報道的分析方法同時檢測的雜質(zhì)種類較少，通常少于3種。為解決此問題，袁松等人[11]建立了UPLC-MS/MS法測定奧美沙坦酯中7 種基因毒性雜質(zhì)：NDMA、 NDEA、NEIPA、NDIPA、NDBA、NMBA、NDPA。他們用甲醇直接溶解樣品并稀釋，定量測試方法采用APCI 離子源正離子掃描和MRM模式。結(jié)果顯示，各雜質(zhì)濃度在1～100 ng/mL 內(nèi)具有良好線性關(guān)系;樣品加標(biāo)回收率為87%～106%;定量限為0.06～0.65ng/mL。因此該方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于定量測定奧美沙坦酯原料藥中7 種N-亞硝胺類雜質(zhì)，有效地擴(kuò)充了同時檢測的雜質(zhì)種類。

LC-MS法在分析N-亞硝胺類雜質(zhì)方面通常采用四極桿分析器（MS），但是也有研究者開發(fā)出利用高分辨質(zhì)量分析器（TOF、Orbitrap）分析此類雜質(zhì)的方法：徐文峰等人[12]采用高效液相色譜- 四極桿飛行時間質(zhì)譜（LC-Q-TOF-MS）測定氯沙坦鉀及其復(fù)方制劑中NMBA。他們用加0.1% 甲酸水溶液作為提取劑，質(zhì)譜采用ESI和正離子掃描模式。結(jié)果：NMBA在5～100ng·ml-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;定量限為2.1 ng·ml-1;平均回收率為89.2%;重復(fù)性、溶液穩(wěn)定性均符合藥典要求。所以本方法可用于氯沙坦鉀及其復(fù)方制劑中NMBA 的定量測定。高分辨質(zhì)量分析器以其超高分辨力和靈敏度以及超快分析速度的優(yōu)點(diǎn)，今后也許會在分析N-亞硝胺類雜質(zhì)方面得到越來越多的應(yīng)用。

3.總結(jié)與展望

自從纈沙坦中被檢出NDMA 后，被檢出N-亞硝胺類化合物的藥物范圍不斷擴(kuò)大，從沙坦類到替丁類、二甲雙胍類……未來可能還會有更多的藥物被檢出此類雜質(zhì)。如此嚴(yán)峻的形勢下，各制藥企業(yè)、科研院所、檢測機(jī)構(gòu)以及藥品監(jiān)管部門對該類基因毒性雜質(zhì)的控制勢必會越來越重視，定會制定和發(fā)布更加科學(xué)合理的分析方法及控制策略。為了避免或盡量減少N-亞硝胺類雜質(zhì)對人類健康帶來的風(fēng)險，建立便捷、高效、準(zhǔn)確、靈敏的分析方法迫在眉睫。但目前在此類雜質(zhì)分析方法開發(fā)方面仍然存在兩大難點(diǎn)：一方面，如何選擇合適的前處理方法，既要盡可能減少N-亞硝胺類化合物的損失，又要盡可能減少基質(zhì)污染，從而保證測試的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度;另一方面，如何建立通用、簡便、靈敏度和準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好、成本低的定量方法，以保證該方法可適用于行業(yè)內(nèi)大多數(shù)單位。相信隨著研究者們的不斷努力探索，以上兩大難點(diǎn)會逐步得到破解。本文為藥品N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)的分析方法開發(fā)提供參考，以便更加嚴(yán)格控制此類雜質(zhì)限度，進(jìn)而保證藥品質(zhì)量安全。

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