盧 露,馬金玲,牛曉君,*,張冬青,鄭小賢,林 璋

銅綠微囊藻溶藻菌EA-1的分離鑒定及溶藻特性

盧 露1,馬金玲1,牛曉君1,2*,張冬青2,鄭小賢1,林 璋1

(1.華南理工大學(xué)環(huán)境與能源學(xué)院,廣東 廣州 510006；2.廣東石油化工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,廣東省石油化工污染過(guò)程與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 茂名 525000)

從廣州流花湖分離獲得一株溶藻菌株EA-1,16S rDNA分析表明菌株EA-1 屬于腸桿菌屬 ().研究了腸桿菌EA-1對(duì)銅綠微囊藻的溶藻效果和溶藻機(jī)制.結(jié)果表明,對(duì)數(shù)期EA-1具有最佳溶藻效果,投加比例為10%,初始葉綠素a 含量為1.43mg/L時(shí),EA-1能實(shí)現(xiàn)3d內(nèi)完全除藻,葉綠素a 含量為2.39mg/L時(shí),共培養(yǎng)6d后,抑制率為84.1%±1.3%.EA-1通過(guò)分泌胞外溶藻物質(zhì)間接溶藻,生理生化響應(yīng)表明,EA-1無(wú)菌濾液脅迫下,藻細(xì)胞膜脂過(guò)氧化損傷嚴(yán)重,超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性先急劇上升后下降.三維熒光光譜(EEM)表明溶藻產(chǎn)物為類腐殖酸,類富里酸和類蛋白類物質(zhì).掃描電子顯微鏡(SEM)顯示藻細(xì)胞出現(xiàn)褶皺,內(nèi)陷和萎縮現(xiàn)象.透射電子顯微鏡(TEM)顯示藻細(xì)胞破壞過(guò)程為:首先,膠質(zhì)層與細(xì)胞壁分離,光合片層變得松散和不規(guī)則,內(nèi)含物被部分降解.隨后,光合片層被徹底破壞,DNA核物質(zhì)和多聚磷酸鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)顆粒被降解,藻細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)被完全破壞,藻細(xì)胞死亡.

腸桿菌；銅綠微囊藻；溶藻特性；生理響應(yīng)；細(xì)胞形態(tài)；細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

近年來(lái),人為富營(yíng)養(yǎng)化加劇和全球氣候變暖導(dǎo)致有害藍(lán)藻水華在世界各地頻繁爆發(fā),如何解決藍(lán)藻水華已成為全球性環(huán)境問(wèn)題之一[1].許多措施,包括化學(xué)、物理和生物法,已被應(yīng)用于藍(lán)藻水華防治.常用物理法包括:機(jī)械打撈、超聲、紫外線照射、等離子體放電、黏土礦物吸附等.常用化學(xué)方法包括:氯化法(如:次氯酸鈉、氯氣)、金屬法(如:硫酸銅、高錳酸鉀、高鐵酸鉀)、氧化劑(如:臭氧、過(guò)氧化氫)、除草劑(如:杜倫)、天然化合物衍生化學(xué)品(如:乙基2 -乙酰乙酸甲酯)和其他化學(xué)物質(zhì)等[2].物理和化學(xué)法對(duì)有害藻類具有很強(qiáng)的殺滅作用,然而,因?yàn)楦叱杀尽㈦y以大規(guī)模應(yīng)用、二次污染引入、非目標(biāo)生物毒性等缺陷,這些方法的應(yīng)用受到了限制.尤其值得關(guān)注的是,化學(xué)氧化過(guò)程會(huì)造成藻細(xì)胞損傷裂解,導(dǎo)致細(xì)胞代謝產(chǎn)物藻毒素等大量釋放出來(lái),使水體毒性增加[3].微生物制劑由于其巨大的溶藻潛力和生態(tài)友好性,已成為近年來(lái)水體富營(yíng)養(yǎng)化治理最具前景的手段[4].過(guò)去的幾十年,眾多溶藻細(xì)菌被從水華末期水體、活性污泥、土壤、植物等介質(zhì)中分離和鑒定,并表現(xiàn)出高效溶藻活性.溶藻細(xì)菌中革蘭氏陰性菌比例高達(dá)95%,由細(xì)胞吞噬菌/黃桿菌/擬桿菌(CFB)和g-變形桿菌構(gòu)成,分別占比50%和45%.CFB集團(tuán)主要包括:噬細(xì)胞菌屬()、黃桿菌屬()和芽胞桿菌屬(),g-變形桿菌主要包括:假單胞菌屬()、交替假單胞菌屬()和假交替單胞菌屬().其余5%則由厚壁菌門(mén)()和放線菌()的革蘭氏陽(yáng)性菌構(gòu)成[5].然而,關(guān)于腸桿菌溶藻能力和溶藻機(jī)制的研究報(bào)道還很匱乏[6].

銅綠微囊藻是最常見(jiàn)也最具破壞力的優(yōu)勢(shì)水華藻種,其產(chǎn)生的微囊藻毒素具備強(qiáng)烈的肝毒性,對(duì)環(huán)境和人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[7].目前,實(shí)驗(yàn)室規(guī)模研究多采用初始藻密度介于104～106cells/mL的藻液,對(duì)初始藻密度更高的藻的溶藻效果研究比較少.此外,絕大多數(shù)已報(bào)道的溶藻細(xì)菌需要5～12d的溶藻時(shí)間以達(dá)到90%的去除率,例如,銅綠微囊藻初始葉綠素a含量為0.4, 0.5, 0.7mg/L時(shí),KY-34[8],HG-16[9]andAF-1[10]分別需要8d,7d和6d以達(dá)到90%的溶藻率.過(guò)長(zhǎng)的溶藻時(shí)間加劇了溶藻菌對(duì)實(shí)際藻華水體中藻的根除難度[11].因此,探索更高效的溶藻劑以及減短溶藻時(shí)間至關(guān)重要.

本研究的主要目的是探索菌株EA-1對(duì)銅綠微囊藻的溶藻效果和潛在機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 藻種來(lái)源與培養(yǎng)方法

銅綠微囊藻(FACHB-905)購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù).藻種采用 BG11 培養(yǎng)基于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)條件設(shè)置為:溫度(25 ± 1)°C,光照強(qiáng)度 2000lx,光暗周期12h:12h[10].

1.2 溶藻菌株來(lái)源、鑒定與培養(yǎng)

選取中國(guó)廣州流花湖公園富營(yíng)養(yǎng)化湖(23°8'14“N,113°14'47”E)為采樣點(diǎn),采集湖泊表層水樣和湖泊附近區(qū)域土壤樣品,于實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行菌株分離工作,經(jīng)篩選純化,從土壤樣品中分離得到溶藻菌株EA-1.

使用DNA提取試劑盒(Sangon Biotech Co., Ltd.)提取菌株培養(yǎng)物DNA,使用通用引物:27F(5'- AGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGT- TACCTTGTTACGACTT -3')在DNA熱循環(huán)儀(Eppendorf, Germany)中擴(kuò)增細(xì)菌16s rDNA.使用Takara DNA純化試劑盒(TaKaRa, Dalian, China) 對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化,通過(guò)DNA測(cè)序儀(Applied Biosystems, US)進(jìn)行測(cè)序.將16S rRNA序列與從NCBI-BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的核苷酸序列進(jìn)行同源性比較.利用MEGA7.0軟件,采用鄰接(Neighbor- Joining)分析法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[12].

菌株活化和發(fā)酵均采用改良察式培養(yǎng)基(M-CDB),成分(g/L):10蔗糖,1KNO3,0.5K2HPO4, 0.5MgSO4?7H2O,0.5NaCl,0.02FeSO4[13].將種子培養(yǎng)物以2%劑量接種到M-CDB培養(yǎng)基中,于30℃、180r/min條件下振蕩培養(yǎng)制備發(fā)酵液.

1.3 菌株EA-1溶藻特性研究

1.3.1 EA-1不同生長(zhǎng)階段對(duì)溶藻活性影響 將10mL對(duì)數(shù)期(培養(yǎng)10h),穩(wěn)定期(培養(yǎng)24h),衰亡期(培養(yǎng)34h)的EA-1菌液添加到90mL對(duì)數(shù)期銅綠微囊藻培養(yǎng)物中,藻液初始葉綠素a含量為1.73mg/L.對(duì)照組不加菌液而加等體積M-CDB培養(yǎng)基.

1.3.2 EA-1菌液不同投加量對(duì)溶藻活性影響 將對(duì)數(shù)期EA-1菌液,以5%,10%和15%()比例,添加至85mL對(duì)數(shù)期銅綠微囊藻培養(yǎng)物中,藻初始葉綠素a含量為1.63mg/L,不足部分用M-CDB培養(yǎng)基補(bǔ)足,總體積固定為100mL.對(duì)照組不加菌液而加等體積M-CDB培養(yǎng)基.

1.3.3 初始葉綠素a含量對(duì)溶藻活性影響 將10mL對(duì)數(shù)期EA-1菌液,以10%()比例,投加至90mL初始葉綠素a含量分別為0.69mg/L(細(xì)胞密度=5.5′106cells/mL),1.43mg/L(細(xì)胞密度=1.1′107cells/mL), 2.39mg/L(細(xì)胞密度=1.9′107cells/mL)的銅綠微囊藻培養(yǎng)物中.對(duì)照組不加菌液而加等體積M-CDB培養(yǎng)基.

1.4 溶藻模式探究

首先,將10mL EA-1菌液于4℃、6000r/min條件下離心以獲得細(xì)菌菌體和上清液,隨后,將收集的菌體沉淀用PBS緩沖溶液(0.1mol/L, pH=7.4)洗滌3次,并用10mL去離子水重懸.上清液通過(guò)0.22μm孔徑的PES膜濾(直徑45mm;Millipore,USA)以獲得無(wú)菌濾液.將10mL菌液、去離子水細(xì)胞重懸液、無(wú)菌濾液,以10%()比例投加至90mL對(duì)數(shù)期銅綠微囊藻培養(yǎng)物中,藻初始葉綠素a含量為1.48mg/L.對(duì)照組不加菌液而加等體積M-CDB培養(yǎng)基.

1.5 分析方法

1.5.1 藻細(xì)胞計(jì)數(shù)、葉綠素a測(cè)定與抑制率 將濃藻液進(jìn)行梯度稀釋,得到OD680=0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0和1.2的藻液并通過(guò)200目篩網(wǎng),隨后,將樣品稀釋100倍后通過(guò)流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù).葉綠素a測(cè)定采用90%丙酮萃取法[14].

Chl-a含量計(jì)算公式如下:

式中: Chl-a單位為mg/L; OD為不同波長(zhǎng)下吸光度;為樣品量;1為上清液定容體積;為比色皿光程(cm)

抑制率計(jì)算公式如下:

式中:e為抑制率;c為對(duì)照組Chl-a含量;t為實(shí)驗(yàn)組Chl-a含量

1.5.2 丙二醛(MDA)含量和抗氧化酶活性測(cè)定 將對(duì)數(shù)期EA-1無(wú)菌濾液,以5%,10%和15% ()比例,添加至85mL對(duì)數(shù)期銅綠微囊藻培養(yǎng)物中,對(duì)照組不加菌液而加等體積M-CDB培養(yǎng)基.每隔24h取樣20mL,連續(xù)取樣6d.粗酶液制備:將20mL樣品離心收集藻細(xì)胞,浸入2mL預(yù)冷的PBS緩沖液(0.1mol/L, pH 7.4)中,冰水浴條件下超聲破碎10min(100W;超聲時(shí)間為5s;間隔時(shí)間為5s),離心所得上清液即粗酶液儲(chǔ)存在-20°C,進(jìn)行酶活性測(cè)定[15].丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性采用相應(yīng)試劑盒測(cè)定(南京建城生物工程研究所,中國(guó)).

1.5.3 胞外溶解性有機(jī)物(EDOM)組成測(cè)定 將對(duì)數(shù)期EA-1無(wú)菌濾液,以5%,10%和15% ()比例,添加至85mL對(duì)數(shù)期銅綠微囊藻培養(yǎng)物中,對(duì)照組不加菌液而加等體積M-CDB培養(yǎng)基.共培養(yǎng)2d,4d,6d后,混勻,離心,取上清液過(guò)0.45 μm濾膜得到胞外溶解性有機(jī)物溶液,使用熒光分光光度計(jì)(F-7000, Hitachi, Japan)進(jìn)行檢測(cè).激發(fā)波長(zhǎng)()掃描范圍為220～480nm,發(fā)射波長(zhǎng)(m)掃描范圍為230～600nm,步長(zhǎng)為5nm,掃描速度為12000nm/min[16].

1.5.4 藻細(xì)胞表面形態(tài)觀察 將對(duì)數(shù)期EA-1無(wú)菌濾液,以10%()比例,添加至90mL對(duì)數(shù)期銅綠微囊藻培養(yǎng)物中,對(duì)照組不加菌液而加等體積M-CDB培養(yǎng)基.共培養(yǎng)3d后,用掃描電鏡(SEM)對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞進(jìn)行觀察.樣品處理過(guò)程如下:4℃、6000r/min條件下離心10min收集藻細(xì)胞,4℃下用2.5%()戊二醛溶液固定24h, PBS緩沖液(0.1mol/L, pH = 7.4)洗滌藻細(xì)胞3次.隨后,將樣品通過(guò)一系列35%～100%的乙醇溶液進(jìn)行梯度脫水處理,每種濃度處理15min,乙酸異戊酯用于浸入藻細(xì)胞至少30min[17].冷凍干燥后在真空條件下噴金以增強(qiáng)電導(dǎo)率,用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(Carl Zeiss Microscopy, Germany)觀察.

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均設(shè)置3組平行,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示.SPSS軟件(版本25.0)用于分析數(shù)據(jù),采用單因素方差分析和鄧肯多范圍檢驗(yàn)(DMRT)法對(duì)不同處理組之間的顯著性差異進(jìn)行分析,顯著性水平設(shè)置為<0.05.不同大寫(xiě)字母(A、B、C、D)表示各組組間存在顯著性差異,不同小寫(xiě)字母(a、b、c、d、e、f)表示各組在不同處理時(shí)間下存在顯著性差異.使用Origin 9.1軟件繪圖,圖中誤差棒代表三次實(shí)驗(yàn)之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差.

2 結(jié)果與討論

2.1 溶藻菌株鑒定

圖1為菌株EA-1掃描電鏡,菌體呈短桿狀,單個(gè)細(xì)胞大小約為0.2～0.3μm寬,0.5～2μm長(zhǎng).圖2為菌株EA-1系統(tǒng)發(fā)育樹(shù), EA-1的16S rDNA序列與strain 070(GenBank:CP050073.1)相似度最高,達(dá)到95%,因此,初步鑒定菌株EA-1屬于腸桿菌屬(sp.),將其命名為sp. EA-1,該菌株16S rDNA序列已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),登錄號(hào)為JX983654.

圖1 溶藻菌EA-1掃描電鏡

圖2 溶藻菌EA-1系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

圖3 不同生長(zhǎng)階段EA-1菌液對(duì)溶藻活性影響

不同大寫(xiě)字母表示各組組間葉綠素a含量存在顯著性差異,不同小寫(xiě)字母表示各組在不同處理時(shí)間下葉綠素a含量存在顯著差異,相同字母表示無(wú)顯著差異

圖4 EA-1菌液不同投加量對(duì)溶藻活性影響

不同大寫(xiě)字母表示各組組間葉綠素a含量存在顯著性差異,不同小寫(xiě)字母表示各組在不同處理時(shí)間下葉綠素a含量存在顯著性差異,相同字母表示無(wú)顯著差異

2.2.1 EA-1不同生長(zhǎng)階段對(duì)溶藻活性影響 不同生長(zhǎng)階段EA-1菌液對(duì)銅綠微囊藻溶藻活性如圖3所示.隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),對(duì)照組中葉綠素a含量上升至3.69mg/L(=6d).對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期EA-1菌液處理組均對(duì)銅綠微囊藻表現(xiàn)出顯著抑制效果,共培養(yǎng)6d后,不同處理組之間葉綠素a含量表現(xiàn)出顯著性差異,其中,對(duì)數(shù)期EA-1菌液表現(xiàn)出最高溶藻活性,共培養(yǎng)4d后,葉綠素a含量降低至0.18mg/L,抑制率為93.7%.穩(wěn)定期和衰亡期EA-1菌液在共培養(yǎng)6d后,葉綠素a含量分別降低至0.57,0.85mg/L.基于以上結(jié)果,采用對(duì)數(shù)期EA-1菌液(振蕩培養(yǎng)10h)進(jìn)行后續(xù)溶藻實(shí)驗(yàn).

2.2.2 EA-1菌液不同投加量對(duì)溶藻活性影響 隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),對(duì)照組中葉綠素a含量穩(wěn)定增加,第6d上升至4.03mg/L.5% 投加量處理組,在共培養(yǎng)6d后,葉綠素a含量降低至0.86mg/L.10% 和15%投加量處理組則表現(xiàn)出顯著溶藻活性,共培養(yǎng)3d后,葉綠素a含量迅速降低至0.28和0.19mg/L,基本實(shí)現(xiàn)完全溶藻,共培養(yǎng)6d后,葉綠素a含量降低至0.09, 0.05mg/L.當(dāng)EA-1菌液投加量從10% 提高到15%時(shí),溶藻活性提升不明顯,且從共培養(yǎng)2d后開(kāi)始,10%和15%處理組中葉綠素a含量未表現(xiàn)出顯著性差異,說(shuō)明初始葉綠素a含量為1.63mg/L時(shí),10% 投加量足以實(shí)現(xiàn)銅綠微囊藻的完全裂解.基于以上結(jié)果,采用10% 投加量進(jìn)行后續(xù)溶藻實(shí)驗(yàn).

圖5 初始葉綠素a含量對(duì)溶藻活性影響

2.2.3 初始葉綠素a含量對(duì)溶藻活性影響如圖5所示,當(dāng)OD680=0.2,初始Chl-a=0.69mg/L,細(xì)胞密度=5.5′106cells/mL時(shí),溶藻效果顯著,共培養(yǎng)3d后,葉綠素a含量迅速降低至0.07mg/L,抑制率達(dá)到97.2%,實(shí)現(xiàn)完全溶藻.當(dāng)OD680=0.4,初始Chl-a=1.43mg/L,細(xì)胞密度=1.1′107cells/mL時(shí),共培養(yǎng)3d后,葉綠素a含量迅速降低至0.14mg/L,抑制率為94.2%,同樣實(shí)現(xiàn)3d內(nèi)完全溶藻.當(dāng)OD680=0.6,初始Chl-a=2.39mg/ L,細(xì)胞密度=1.9′107cells/mL時(shí),抑制率隨著溶藻時(shí)間延長(zhǎng)逐步上升,共培養(yǎng)6d后,葉綠素a含量降低至0.74mg/L,抑制率為84.1%.以上結(jié)果表明,當(dāng)葉綠素a含量低于1.43mg/L時(shí),10%()EA-1菌液投加量可實(shí)現(xiàn)3d內(nèi)完全溶藻,說(shuō)明EA-1 對(duì)銅綠微囊藻具有良好的溶藻能力.

2.3 溶藻模式

共培養(yǎng)6d后,對(duì)照組、原菌液、無(wú)菌濾液和重懸菌體處理組的葉綠素a含量和抑制率如圖6所示.各組組間葉綠素a含量存在顯著性差異,對(duì)照組中,葉綠素a含量從1.48mg/L上升至3.68mg/L,原菌液和無(wú)菌濾液處理組中,葉綠素a含量分別降低至0.10mg/L和0.51mg/L,溶藻率分別為97.0%和86.1%.去離子水菌體重懸液處理組表現(xiàn)出最差溶藻效果,溶藻率僅為24.7%(=6d).以上結(jié)果表明,EA-1主要通過(guò)分泌胞外溶藻物質(zhì)間接破壞銅綠微囊.

圖6 EA-1對(duì)銅綠微囊藻溶藻模式

不同大寫(xiě)字母表示各組組間葉綠素a含量存在顯著性差異

2.4 藻細(xì)胞丙二醛含量和抗氧化酶活性變化

2.4.1 丙二醛(MDA)含量 脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA可反應(yīng)機(jī)體內(nèi)膜脂過(guò)氧化程度,是評(píng)估氧化損傷嚴(yán)重程度的重要指標(biāo),能夠間接地反應(yīng)機(jī)體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[18].如圖7A所示,對(duì)照組中,MDA含量保持在較低且相對(duì)穩(wěn)定水平,整體在0.06～ 0.14nmol/mg蛋白質(zhì)范圍內(nèi)波動(dòng),說(shuō)明其膜脂過(guò)氧化保持在較低水平.不同投加量處理組中,MDA含量在處理過(guò)程中始終存在顯著性差異,5%實(shí)驗(yàn)組中, MDA含量總體呈上升趨勢(shì),第6d上升至0.47nmol/ mg蛋白質(zhì),10%和15%實(shí)驗(yàn)組中,MDA含量急劇上升,共培養(yǎng)5d后達(dá)到最高值,分別為0.83和0.95nmol/mg蛋白質(zhì),為對(duì)照組的8.8和10.1倍.以上結(jié)果表明,銅綠微囊藻細(xì)胞在外來(lái)EA-1無(wú)菌濾液壓力下受到不同程度的氧化攻擊,且投加量越高,膜脂過(guò)氧化損傷程度越嚴(yán)重.

2.4.2 超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性 當(dāng)細(xì)胞遭遇不利環(huán)境時(shí),會(huì)產(chǎn)生大量活性氧(ROS),ROS的過(guò)量積累會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)降解,蛋白質(zhì)變性和DNA異構(gòu),引起嚴(yán)重的氧化損傷并導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡[19].SOD,CAT和APX抗氧化酶共同構(gòu)成了藻細(xì)胞氧化應(yīng)激系統(tǒng)的第一道防線,其中,SOD催化超氧陰離子(O2-)快速歧化為過(guò)氧化氫(H2O2),隨后,CAT和APX則會(huì)立即將H2O2降解為水,使細(xì)胞內(nèi)ROS維持在較低水平[20].如圖7B所示,對(duì)照組中,SOD活性保持在較低且相對(duì)穩(wěn)定水平,整體在20.9至28.2U/mg蛋白質(zhì)范圍內(nèi)波動(dòng).5%,10%和15%實(shí)驗(yàn)組在共培養(yǎng)初期SOD活性均顯著上升,表明銅綠微囊藻細(xì)胞激發(fā)了自我防御系統(tǒng).5%處理組SOD活性在第4d上升至最大值,為58.4U/mg蛋白質(zhì),10%和15%處理組SOD活性在第3d上升至最大值,達(dá)到83.0和93.3U/mg蛋白質(zhì),為對(duì)照組的2.95和3.31倍.隨后,10%和15%處理組SOD活性迅速下降,共培養(yǎng)6d后,SOD活性降低至29.4和21.8U/mg蛋白質(zhì).如圖7C所示,對(duì)照組中CAT含量在10.6～ 16.0U/mg蛋白質(zhì)范圍內(nèi)波動(dòng). 5%,10%和15%實(shí)驗(yàn)組中,CAT活性呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì),5%實(shí)驗(yàn)組在第4d上升至最大值,為27.1U/ mg蛋白質(zhì),10%和15%實(shí)驗(yàn)組在第3d上升至最大值,達(dá)到43.2和48.3U/mg蛋白質(zhì),為對(duì)照組的3.3和3.7倍.共培養(yǎng)6d后,CAT活性降低至最低值,分別為15.9、28.2、23.5U/mg蛋白質(zhì).如圖7D所示,APX活性變化趨勢(shì)與SOD,CAT相似,對(duì)照組中,APX活性在0.22～0.35U/mg蛋白質(zhì)范圍內(nèi)波動(dòng).5%,10%和15%實(shí)驗(yàn)組中,APX活性在共培養(yǎng)3d后上升至最高值,分別為0.84,1.33和1.52U/mg蛋白質(zhì),共培養(yǎng)6d后,降低至最低值,分別為0.41、0.77和0.89U/mg蛋白質(zhì).以上結(jié)果表明,溶藻菌EA-1分泌的胞外溶藻物質(zhì)對(duì)藻細(xì)胞造成了氧化脅迫,藻細(xì)胞則迅速啟動(dòng)氧化應(yīng)激系統(tǒng)以抵抗EA-1引起的細(xì)胞損傷,使得實(shí)驗(yàn)組中SOD,CAT和APX抗氧化酶活性急劇增加;隨著共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),SOD、CAT和APX抗氧化酶不足以清除過(guò)量產(chǎn)生的ROS,導(dǎo)致藻細(xì)胞受到不可逆的氧化損傷,防御系統(tǒng)嚴(yán)重崩潰,酶活性喪失,從而促使藻細(xì)胞死亡.

不同大寫(xiě)字母表示各組組間MDA含量和抗氧化酶活性存在顯著性差異,不同小寫(xiě)字母表示各組在不同處理時(shí)間下MDA含量和抗氧化酶活性存在顯著性差異,相同字母表示無(wú)顯著差異

2.5 溶藻產(chǎn)物胞外溶解性有機(jī)物(EDOM)組成變化

溶藻過(guò)程中銅綠微囊藻胞外有機(jī)物組成變化如圖8所示.一般認(rèn)為,銅綠微囊藻有機(jī)物中含有蛋白質(zhì)、氨基酸和腐殖酸類等物質(zhì)[13].對(duì)照組光譜中檢測(cè)到激發(fā)和發(fā)射(x/m)中心位置為280/335nm的類色氨酸熒光峰(FL-a),此類物質(zhì)為溶解性的微生物代謝產(chǎn)物,例如含氮物質(zhì)和芳香族氨基酸,可能是藻細(xì)胞的代謝產(chǎn)物[21].與對(duì)照組相比,5%實(shí)驗(yàn)組,除檢測(cè)到FL-a外,還檢測(cè)到x/m中心為260/440nm的類富里酸熒光峰(FL-b)和x/m為340/440nm的類腐殖酸熒光峰(FL-c),類富里酸和類腐殖酸物質(zhì)是微生物對(duì)大分子有機(jī)物或藻細(xì)胞的降解產(chǎn)物,且這類物質(zhì)不能被溶藻菌作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收[22].10%和15%高濃度處理組,除檢測(cè)到FL-a、FL-b和FL-c外,還出現(xiàn)了x/m為230/330nm的類蛋白熒光峰(FL-d)[13].且隨著EA-1投加量增高,溶藻產(chǎn)物DOM中類富里酸(FL-b),類腐殖酸(FL-c)和類蛋白物質(zhì)(FL-d)熒光峰強(qiáng)度呈增強(qiáng)趨勢(shì).以上結(jié)果表明,EA-1破壞了銅綠微囊藻細(xì)胞并釋放了藻細(xì)胞胞內(nèi)有機(jī)物,藻類溶解產(chǎn)物主要為類富里酸、類腐殖質(zhì)和類蛋白等物質(zhì),且投加量越高,藻細(xì)胞破壞和降解程度越嚴(yán)重.

圖8 銅綠微囊藻胞外溶解性有機(jī)物(DOM)組成變化

2.6 銅綠微囊藻細(xì)胞形態(tài)變化

經(jīng)腸桿菌EA-1處理后,銅綠微囊藻905細(xì)胞表面形態(tài)變化如圖9所示.對(duì)照組中,銅綠微囊藻細(xì)胞呈球形或近球形,表面飽滿且光滑,呈現(xiàn)健康的細(xì)胞形態(tài)特征,無(wú)菌濾液處理組中,藻細(xì)胞表面出現(xiàn)明顯的褶皺,內(nèi)陷和萎縮現(xiàn)象.以上結(jié)果表明,EA-1無(wú)菌濾液脅迫下,銅綠微囊藻細(xì)胞受到嚴(yán)重破壞.

圖9 銅綠微囊藻細(xì)胞形態(tài)變化

圖A-C為對(duì)照組藻細(xì)胞;圖D-F為實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞

2.7 銅綠微囊藻超微結(jié)構(gòu)變化

經(jīng)EA-1無(wú)菌濾液處理后,銅綠微囊藻905超微結(jié)構(gòu)變化如圖10所示.對(duì)照組中,藻細(xì)胞呈現(xiàn)出完整且健康的結(jié)構(gòu)特征,膠質(zhì)層和細(xì)胞壁緊密貼合,膜狀光合片層和類囊體結(jié)構(gòu)完好,多聚磷酸鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)顆粒分布在細(xì)胞質(zhì)中.暴露于EA-1無(wú)菌濾液3d后,藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化,膠質(zhì)層與細(xì)胞壁分離,膜狀光合片層變得松散和不規(guī)則,內(nèi)部結(jié)構(gòu)開(kāi)始被破壞,內(nèi)含物被部分降解.隨后,藻細(xì)胞破壞程度進(jìn)一步加劇,光合片層結(jié)構(gòu)基本消失,DNA核物質(zhì)和多聚磷酸鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)顆粒被降解,藻細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)被完全破壞,藻細(xì)胞死亡.

圖10 銅綠微囊藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

圖A-D為對(duì)照組藻細(xì)胞;圖E-L為實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞

3 結(jié)論

3.1 從廣州流花湖(重度富營(yíng)養(yǎng)化湖)區(qū)域土壤中分離獲得一株對(duì)銅綠微囊藻具有溶藻效果的溶藻菌株EA-1,16S rDNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明菌株EA-1屬于腸桿菌屬 (),該菌株16S rDNA序列保存于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),登錄號(hào)為JX983654.

3.2 對(duì)數(shù)期EA-1菌液表現(xiàn)出最佳溶藻活性,共培養(yǎng)4d后抑制率為93.7%.初始葉綠素a含量為1.63mg/L時(shí),10%()投加量表現(xiàn)出顯著溶藻活性,15% ()投加量對(duì)溶藻活性提升不顯著.初始葉綠素a含量為1.43mg/L,細(xì)胞密度=1.1′107cells/mL時(shí),10%投加量可實(shí)現(xiàn)3d完全溶藻,初始葉綠素a含量為2.39mg/L,細(xì)胞密度=1.9×107cells/mL時(shí),6d抑制率為84.1%.

3.3 溶藻菌EA-1 主要通過(guò)分泌胞外溶藻物質(zhì)間接溶藻.EA-1無(wú)菌濾液脅迫下,銅綠微囊藻細(xì)胞MDA含量急劇上升,表明藻細(xì)胞遭受嚴(yán)重脂質(zhì)過(guò)氧化損傷.SOD、CAT、POD和APX活性呈現(xiàn)先顯著上升后下降趨勢(shì),活性上升歸因于銅綠微囊藻細(xì)胞自我防御系統(tǒng)被快速觸發(fā)并不斷增強(qiáng),以抵御氧化壓力,避免氧化損傷.活性下降歸因于SOD、CAT、POD和APX酶不足以清除過(guò)量ROS抵消氧化壓力,銅綠微囊藻細(xì)胞防御系統(tǒng)被破壞,酶活性損傷,藻細(xì)胞死亡.

3.4 不同處理組溶藻產(chǎn)物三維熒光光譜研究表明,溶藻產(chǎn)物DOM以類腐殖酸,類富里酸和類蛋白物質(zhì)為主.

3.5 EA-1無(wú)菌濾液脅迫下,銅綠微囊藻細(xì)胞受到嚴(yán)重破壞.破壞過(guò)程為:首先,膠質(zhì)層與細(xì)胞壁分離,膜狀光合片層變得松散和不規(guī)則,內(nèi)含物被部分降解,隨后,光合片層結(jié)構(gòu)被徹底破壞,DNA核物質(zhì)和多聚磷酸鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)顆粒被降解,最后,藻細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)被完全破壞,藻細(xì)胞死亡.

[1] 洪桂云,馬少雄,王 佳,等.高效銅綠微囊藻溶藻菌WJ6的分離鑒定及溶藻特性[J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2018,38(11):4269-4275.

Hong G Y, Ma S X, Wang J, et al. Isolation and identification of an efficient algicidal bacteria strain and algicidal characteristics on Microcystis aeruginosa [J]. China Environmental Science, 2018,38(11): 4269-4275.

[2] Hudnell H K. Cyanobacterial harmful algal blooms: State of the science and research needs [M]. 2008.

[3] Paerl H W, Xu H, Mccarthy M J, et al. Controlling harmful cyanobacterial blooms in a hyper-eutrophic lake (Lake Taihu, China): The need for a dual nutrient (N & P) management strategy [J]. Water Research, 2011,45(5):1973-1983.

[4] El-Shehawy R, Gorokhova E, Ferndndez-Pinas F, et al. Global warming and hepatotoxin production by cyanobacteria: What can we learn from experiments? [J]. Water Research, 2012,46(5):1420-1429.

[5] Meyer N, Bigalke A, Kaulfu A, et al. Strategies and ecological roles of algicidal bacteria [J]. FEMS Microbiology Reviews, 2017,41(6):880- 899.

[6] Sun R, Sun P, Zhang J, et al. Microorganisms-based methods for harmful algal blooms control: A review [J]. Bioresource Technology, 2018,248:12-20.

[7] Liao C L, Liu X B, Liu R F, et al.Two novel algicidal isolates kill Chlorella pyrenoidosa by inhibiting their host antioxidase activities [J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2015,177(2):567-576.

[8] Kong Y, Zou P, Yang Q, et al. Physiological responses ofunder the stress of antialgal Actinomycetes [J]. Journal of Hazardous Materials, 2013,262:274-280.

[9] Yu Y, Zeng Y D, Li J, et al. An algicidal Streptomyces amritsarensis strain against Microcystis aeruginosa strongly inhibits microcystin synthesis simultaneously [J]. Science of the Total Environment, 2019, 650:34-43.

[10] Xuan H L, Dai X Z, Li J, et al.A Bacillus sp. strain with antagonistic activity against Fusarium graminearum kills Microcystis aeruginosa selectively [J]. Science of the Total Environment, 2017,583:214-221.

[11] Ndlela L L, Oberholster P J , Wyk J V , et al., Bacteria as biological control agents of freshwater cyanobacteria: is it feasible beyond the laboratory? [J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2018, 102(23):9911-9923.

[12] Benga L, Benten W, Engelhardt E, et al. 16S ribosomal DNA sequence-based identification of bacteria in laboratory rodents: a practical approach in laboratory animal bacteriology diagnostics [J]. Laboratory Animals, 2014,48(4):305-312.

[13] 孔 赟.溶藻菌分離鑒定、溶藻特性及作用機(jī)理研究 [D]. 杭州:浙江大學(xué), 2013.

Kong Y. Study on isolation and identification of algicidal bacteria, algicidal characteristics and algicidal mechanism [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2013.

[14] Zeng G M, Zhou J, Huang T, et al. Extraction of Chlorophyll-a from eutrophic water by repeated freezing and thawing-extraction method [J]. Asian Journal of Chemistry, 2014,26(8):2289-2292.

[15] 周 素.銅綠假單胞菌的溶藻特性及殘余藻毒素的降解性能研究 [D]. 廣州:華南理工大學(xué), 2016.

Zhou S. Study on algicidal characteristics ofand the degradation performance of residual algae toxins [D]. Guangzhou: South China University of Technology, 2016.

[16] Song Q, Niu X J, Zhang D Q, et al. The behaviors of Microcystis aeruginosa and microcystins during the Fe(2+)/persulfate (PS) preoxidation-coagulation and flocs storage period [J]. Environmental Research, 2020,186:109549.

[17] 馬宏瑞,章 欣,王曉蓉,等.芽孢桿菌Z5溶銅綠微囊藻特性研究 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2011,31(5):828-833.

Ma H R, Zhang X, Wang X, et al. Characteristics study of lysis ofby Bacillus. Z5 [J]. China Environmental Science, 2011,31(5):828-833.

[18] 張嗣萍.一株廣譜性溶藻細(xì)菌的篩選鑒定、溶藻特性及溶藻機(jī)理的研究[D]. 重慶,西南大學(xué), 2018.

Zhang S P. Screening and identification of a broad-spectrum algicidal bacteria, study on its characteristics and mechanism [D]. Chongqing, Southwest University, 2018.

[19] Kaur S, Srivastava A, Kumar S, et al. Biochemical and proteomic analysis reveals oxidative stress tolerance strategies of Scenedesmus abundans against allelochemicals released by Microcystis aeruginosa [J]. Algal Research, 2019,41:101525.

[20] 王金霞.溶藻細(xì)菌S7溶藻特性、機(jī)理及影響因素的研究 [D]. 重慶, 重慶大學(xué), 2012.

Wang J X. Study on algicidal characteristics, mechanism and influencing factors of algicidal bacteria S7 [D]. Chongqing: Chongqing University, 2012.

[21] 于 燕.多功能溶藻鏈霉菌的分離及其對(duì)銅綠微囊藻溶藻特性的研究 [D]. 重慶:西南大學(xué), 2019.

Yu Y. Isolation of multifunctionaland study on its algicidal characteristics of[D]. Chongqing: Southwest University, 2019.

[22] 樊乾龍.溶解銅綠微囊藻的細(xì)菌篩選及溶藻效果的研究 [D]. 北京:北京林業(yè)大學(xué), 2016.

Fan Q L. Screening of bacteria for dissolving Microcystis aeruginosa and study on its algicidal effect [D]. Beijing: Beijing Forestry University, 2016.

Isolation and identification of an algicidal bacteria strain of EA-1and algicidal characteristics on.

LU Lu1, MA Jin-ling1, NIU Xiao-jun1,2*, ZHANG Dong-qing2, ZHENG Xiao-xian1, LIN Zhang1

(1.School of Environment and Energy, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China；2.Guangdong Key Laboratory of Pollution Process and Control in Petrochemical Industry, School of Environmental Science and Engineering, Guangdong University of Petroleum and Chemical Technology, Maoming 525000, China)., 2021,41(11)：5372～5381

An algicidal bacterium EA-1was isolated from Liuhua Lake in Guangzhou. The 16S rDNA analysis showed that the strain EA-1belongs to the genussp. The algicidal efficiency and mechanism ofsp. EA-1onwas studied. The logarithmic phase EA-1exhibited the best algicidal effect. A 10% inoculation of EA-1could achieve a complete lysis againstwithin 3days with the initial Chl-a content of 1.43mg/L. An inhibition rate of 84.1%±1.3% (=6d) was attained when the initial Chl-a content reached 2.39mg/L. EA-1lysed algae by secreting extracellular algicidal substances. The physiological and biochemical responses indicated that algae suffered serious lipid peroxidation, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and ascorbate peroxidase (APX) activities increased dramatically first and decreased subsequently under the oxidative stress of EA-1sterile filtrate. Three-dimensional fluorescence spectroscopy (EEM) analysis showed that the algae lysates were humic acid-like, fulvic acid-like and protein-like substances. Scanning electron microscopy (SEM) showed that the surface of algae cells appeared wrinkled, invaded and atrophied. Transmission electron microscopy (TEM) showed that the destruction process of algae was as followed: first, the colloidal layer was separated from the cell wall, the photosynthetic lamellae became loose and irregular, the contents were partially degraded. Subsequently, the photosynthetic lamellae were completely destroyed, the DNA nuclear material and nutrient particles such as polyphosphate were degraded, the internal structure of algae cells was completely destroyed and the algae cells died.

；；algicidal characteristics；physiological response；cell morphology；cell ultrastructure

X172

A

1000-6923(2021)11-5372-10

盧 露(1996-),女,湖北十堰人,華南理工大學(xué)碩士研究生,研究方向?yàn)槿茉逦⑸锛翱卦寮夹g(shù)研究.

2021-04-01

廣東省自然科學(xué)基金(2017A030313239)

* 責(zé)任作者, 教授,xjniu@scut.edu.com