張庭廷,胡春霞,陳 波

稻草秸稈發(fā)酵液對(duì)銅綠微囊藻生化參數(shù)影響

張庭廷1,2*,胡春霞1,陳 波2

(1.紹興文理學(xué)院元培學(xué)院,浙江 紹興 312000；2.安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,安徽 蕪湖 241000)

針對(duì)銅綠微囊藻在稻草秸稈(水稻分蘗枝)發(fā)酵液脅迫下的酶學(xué)特征及抗氧化能力、藻毒素和多糖含量等生化指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)分析,旨在為利用稻草秸稈抑藻提供進(jìn)一步理論依據(jù). 結(jié)果表明:銅綠微囊藻在水稻分蘗枝發(fā)酵液脅迫下,其表征藻細(xì)胞代謝水平的酯酶活性顯著降低,實(shí)驗(yàn)第5d,最高濃度組(0.65%)99.9% 的藻細(xì)胞內(nèi)酯酶活性均被抑制,超氧化物歧化酶(SOD)與谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活力分別下降至同期對(duì)照組的11.03% 和8.47%;丙二醛(MDA)含量則與發(fā)酵液濃度以及作用時(shí)間呈顯著正相關(guān),pearson分析表明,所有濃度組和作用時(shí)間內(nèi)值均大于0.9,而值均小于0.01,表明水稻分蘗枝發(fā)酵液可顯著降低藻細(xì)胞的抗氧化水平;但高濃度水稻分蘗枝發(fā)酵液沒有引起微囊藻毒素(MCs)升高,甚至顯著降低MCs和多糖的含量,與對(duì)照組相比,<0.01.因此,水稻分蘗枝發(fā)酵液可通過(guò)影響銅綠微囊藻的代謝過(guò)程,降低藻細(xì)胞抗氧化以及抵御對(duì)環(huán)境脅迫的能力,從而達(dá)到有效抑藻的目的.

水稻分蘗枝；銅綠微囊藻；抑藻機(jī)制；生化參數(shù)

稻草秸稈的抑藻特性已有不少報(bào)道[1-3].單純稻草浸提液抑藻效果并不顯著,一定條件下對(duì)稻草進(jìn)行發(fā)酵可達(dá)到較好抑藻作用[2-3],這與稻草發(fā)酵過(guò)程中能產(chǎn)生更多或新的抑藻物質(zhì)有關(guān)[3-4].本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)用純?nèi)ルx子水浸泡稻草秸稈其浸提液幾乎無(wú)明顯抑藻作用,經(jīng)過(guò)反復(fù)研究發(fā)現(xiàn)稻草秸稈發(fā)酵時(shí)添加適量纖維素酶以及乳酸菌后發(fā)酵液的抑藻效果有顯著改善,而水稻分蘗枝發(fā)酵液又遠(yuǎn)比普通稻草秸稈發(fā)酵液抑藻效能高[5].說(shuō)明不同稻草秸稈以及處理方式不同其抑藻效果差別顯著.關(guān)于稻草秸稈抑藻機(jī)理全面深入研究的報(bào)道目前還比較有限,部分機(jī)制研究大多集中對(duì)藻細(xì)胞光合系統(tǒng)的影響[3-4]以及稻草秸稈中化感物質(zhì)酚酸的抗氧化活性[4].

而在所有化感物質(zhì)抑藻機(jī)理的報(bào)道中,除了對(duì)藻細(xì)胞光合作用、抗氧化特性研究外,藻細(xì)胞的代謝特征、相關(guān)基因表達(dá)水平、微囊藻細(xì)胞內(nèi)外藻毒素與多糖含量變化等也越來(lái)越受到關(guān)注[6-8].通過(guò)研究赤潮異彎藻()在三角褐指藻()濾液的脅迫下其形態(tài)、生理和生長(zhǎng)的影響,發(fā)現(xiàn)赤潮異彎藻酯酶活性是受到化感物質(zhì)作用后最敏感的指標(biāo)[9];本課題組前期曾從谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活力與比活力以及同工酶表達(dá)譜、丙二醛(MDA)含量等研究闡明了化感物質(zhì)亞油酸脅迫對(duì)銅綠微囊藻抗氧化能力的顯著影響[10-11];而藍(lán)藻胞內(nèi)外藻毒素和多糖含量變化被認(rèn)為是藍(lán)藻抵御環(huán)境脅迫能力的有效指標(biāo)[12-13],研究發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻在相應(yīng)化感物質(zhì)存在時(shí),藻細(xì)胞毒素與多糖合成增多,其中一部分釋放到胞外,一部分則粘附在細(xì)胞表面以助藍(lán)藻形成優(yōu)勢(shì)種群及其自我保護(hù)[14-15].

為更深入探討稻草秸稈發(fā)酵液的抑藻機(jī)制,尤其是在環(huán)境脅迫下,藍(lán)藻的代謝酶活力、微囊藻毒素產(chǎn)生與釋放特性等,故本文在前期研究報(bào)道[5]基礎(chǔ)上著重探討了水稻分蘗枝發(fā)酵液對(duì)銅綠微囊藻各有關(guān)生理生化參數(shù)的影響,為水稻分蘗枝在水華治理中的實(shí)際應(yīng)用提供有價(jià)值的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

水稻分蘗枝()采自蕪湖火龍崗鎮(zhèn)農(nóng)田;水稻分蘗枝發(fā)酵液制備參見文獻(xiàn)[5],將收集到的水稻分蘗枝風(fēng)干,剪成2cm小段,粉碎過(guò)篩(40目). 稱秸稈粉末30g放入500mL錐形瓶,高壓蒸汽滅菌2min;按照料水比(1:10)加入超純水;添加適量纖維素酶和乳酸菌[5];混合后置35℃厭氧發(fā)酵30d,發(fā)酵液經(jīng)定性濾紙抽濾再經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾,定容至300mL,4℃保存.

碘化丙啶(PI)染液儲(chǔ)備液:稱取0.005g PI,溶于10mL雙蒸水(ddH2O)制成濃度為0.5g/L的儲(chǔ)備液,4℃保存?zhèn)溆?工作液:取0.7mL儲(chǔ)備液加入1.8mL ddH2O配成工作液. 二乙酸熒光素(FDA)染液儲(chǔ)備液:稱取0.1g FDA溶于10mL丙酮,制成10mg/mL的儲(chǔ)備液,-20℃保存?zhèn)溆?工作液:取50uL儲(chǔ)備液加入950uL丙酮,制成0.5mg/mL的工作液.

其他化學(xué)試劑:無(wú)水乙醇、丙酮、PI(94%)、FDA(97%)均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技有限公司;微囊藻毒素酶聯(lián)免疫分析試劑盒及多糖酶聯(lián)免疫分析試劑盒均購(gòu)自上海心語(yǔ)生物有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藻種培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)前,對(duì)藻種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),使藻細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期.向若干滅菌的1000mL錐形瓶中加入100mL BG-11培養(yǎng)基,接入100mL藻液,充分搖勻后放入光照培養(yǎng)箱培養(yǎng);培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度4000lx,光暗比12h:12h,溫度(25±1)℃;之后每天加入100mL培養(yǎng)基,培養(yǎng)7d,每天搖動(dòng)錐形瓶3～4次.

1.2.2 水稻分蘗枝發(fā)酵液對(duì)銅綠微囊藻的量效關(guān)系 在前期研究的基礎(chǔ)上取對(duì)數(shù)期銅綠微囊藻25mL加入到滅菌的50mL錐形瓶中,設(shè)置0.25%、0.35%、0.45%、0.55%和0.65%(/)5個(gè)水稻分蘗枝發(fā)酵液濃度組,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(CK1)以及僅含有纖維素酶與乳酸菌的對(duì)照組(CK2),各組藻密度均為1.3′106cells/mL,每組3個(gè)重復(fù),于1.2.1培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng),于實(shí)驗(yàn)第1,3,5d取樣計(jì)數(shù)(實(shí)驗(yàn)當(dāng)天為第0d).

1.2.3 水稻分蘗枝發(fā)酵液對(duì)銅綠微囊藻的生理生化參數(shù)影響研究 將對(duì)數(shù)期銅綠微囊藻用BG-11培養(yǎng)基稀釋到1.3′106cells/mL,向滅菌的250mL錐形瓶中接入200mL藻液,加入發(fā)酵液,設(shè)置0、0.25%、0.35%、0.45%、0.55%和0.65%(/)6個(gè)濃度組,每組3個(gè)重復(fù),置于光照培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)條件與藻種相同.于實(shí)驗(yàn)第1,3,5d分別從錐形瓶中各取藻液測(cè)定相關(guān)參數(shù).

(1) 水稻分蘗枝發(fā)酵液對(duì)銅綠微囊藻酯酶活性的影響 藻細(xì)胞酯酶活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[17],于實(shí)驗(yàn)第1,3,5d分別從錐形瓶中各取藻液1mL,藻液經(jīng)300目絹篩過(guò)濾后移入樣品管中,加入20μL FDA工作液,25℃染色15min.用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)的異硫氰酸熒光素(fitc)通道檢測(cè)10000個(gè)藻細(xì)胞葉綠素?zé)晒庑盘?hào),激發(fā)波長(zhǎng)488nm,進(jìn)樣流速12μL/min.用Flowjo軟件計(jì)算所檢測(cè)到的信號(hào)值,記為平均熒光強(qiáng)度,劃分為抑制群和激發(fā)群,根據(jù)公式統(tǒng)計(jì)占樣品細(xì)胞的百分比:抑制群(或激發(fā)群)占比=抑制群(或激發(fā)群)細(xì)胞數(shù)/樣品細(xì)胞數(shù).

(2) 水稻分蘗枝發(fā)酵液對(duì)銅綠微囊藻抗氧化作用相關(guān)參數(shù)的影響 分別于實(shí)驗(yàn)第1,3,5d分別從錐形瓶中取藻液,4000r/min離心15min,去上清液,向藻泥中加入1mL PBS,并將混合物在-20℃放置過(guò)夜.通過(guò)反復(fù)冷凍和解凍將細(xì)胞壁破碎兩次,并在4℃以12000r/min離心5min,收集上清液,參照黃愛纓等[18]方法測(cè)定GSH-Px活力、參照Stewert等[19]方法測(cè)定SOD活力,參照Cavas等方法[20]測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA含量.

(3) 水稻分蘗枝發(fā)酵液對(duì)銅綠微囊藻胞內(nèi)外藻毒素(MCs)以及多糖含量的影響于實(shí)驗(yàn)第5d,取20mL銅綠微囊藻藻液離心(4000r/min)15min,上清液轉(zhuǎn)移至EP管中,放入-20℃冰箱中冷凍保存,用于銅綠微囊藻胞外MCs及多糖含量的測(cè)定.沉淀部分用1mL PBS(pH=7.4)緩沖液轉(zhuǎn)移至EP管中,放入-80℃冷凍冰箱中反復(fù)凍融3次,再次離心(4000r/min) 15min,取上清置于EP管中,放入-20℃冰箱中冷凍保存,用于銅綠微囊藻胞內(nèi)MCs及多糖含量的測(cè)定;MCs的含量采用MCs酶聯(lián)免疫分析試劑盒測(cè)定;多糖含量采用多糖酶聯(lián)免疫分析試劑盒測(cè)定.

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,SPSS 22.0軟件對(duì)各組間差異進(jìn)行單因素方差分析,用最小顯著性差異法(LSD)進(jìn)行組間多重比較,<0.05表示有顯著性差異,<0.01表示有極顯著性差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻分蘗枝發(fā)酵液對(duì)銅綠微囊藻的量效關(guān)系

圖1 水稻分蘗枝發(fā)酵液對(duì)銅綠微囊藻密度的影響

*與同期對(duì)照組ck1比較,<0.05;**與同期對(duì)照組ck1比較,<0.01

由圖1可知,水稻分蘗枝發(fā)酵液對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用具有劑量效應(yīng)及時(shí)間效應(yīng),即隨著發(fā)酵液劑量的增加及時(shí)間的延長(zhǎng),其抑制作用越顯著,作用第1d,只有3個(gè)較高劑量組與CK1相比具有顯著性抑制,<0.05,但到第3d,各濃度組與同期CK1相比均具有極顯著性抑制作用;CK2組除了第1d藻密度稍高于CK1,其余時(shí)間段均低于同期CK1,但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明微量纖維素酶以及乳酸菌并不影響銅綠微囊藻生長(zhǎng),對(duì)于纖維素酶而言,雖然銅綠微囊藻細(xì)胞壁內(nèi)層含纖維素,但外層主要為果膠質(zhì),發(fā)揮作用有限;而乳酸菌屬異養(yǎng)厭氧型生物, 生存環(huán)境中要有可利用的有機(jī)物,且要無(wú)氧環(huán)境,因此在抑藻實(shí)驗(yàn)中并不能發(fā)揮抑藻效應(yīng).但在稻草秸稈發(fā)酵過(guò)程中,添加纖維素酶可加快秸稈纖維素的降解,乳酸菌則可將其降解產(chǎn)物發(fā)酵成乳酸,由此可顯著提高發(fā)酵液的抑藻效能[5].

2.2 發(fā)酵液對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞酯酶活性的影響

當(dāng)本身不發(fā)光的FDA進(jìn)入細(xì)胞后,與細(xì)胞內(nèi)酯酶相結(jié)合,經(jīng)激發(fā)產(chǎn)生綠色熒光被FCM檢測(cè)器接收.綠色熒光強(qiáng)度同酯酶活性成正比,細(xì)胞受損越嚴(yán)重細(xì)胞內(nèi)酯酶活性越低,與FDA結(jié)合能力越弱,激發(fā)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度就越低.本文測(cè)定了不同濃度發(fā)酵液在不同作用時(shí)間節(jié)點(diǎn)對(duì)銅綠微囊藻藻細(xì)胞內(nèi)酯酶活性的影響,根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果將細(xì)胞劃分為抑制群和激發(fā)群兩類,并統(tǒng)計(jì)各自占檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)的占比,結(jié)果如圖2所示.從圖中可看出不同濃度發(fā)酵液、不同作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞酯酶活性影響具有不同特征.對(duì)照組第1d有18.7%細(xì)胞分布于抑制區(qū),第3d和第5d各有12.7% 和15.5%分布于抑制區(qū),但三者之間無(wú)顯著性差異(>0.05),說(shuō)明這是藻細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中自然衰老死亡造成的.而實(shí)驗(yàn)組,在第1d隨著發(fā)酵液添加量的增加細(xì)胞逐漸向抑制群轉(zhuǎn)移,低濃度組(0.25%)的抑制群占比33.2%,最高濃度組(0.65%)的抑制群占比達(dá)到76.7%,轉(zhuǎn)移量為43.5%,說(shuō)明大部分藻細(xì)胞內(nèi)酯酶活性受到抑制,各實(shí)驗(yàn)組與同期對(duì)照組相比均具有極顯著性差異(<0.01).第3d藻細(xì)胞酯酶活性受抑制程度進(jìn)一步加劇,0.35%組抑制群占比已超半數(shù)達(dá)到65.3%,最大濃度組達(dá)到90.6%,提示此時(shí)絕大多數(shù)藻細(xì)胞內(nèi)酯酶活性受到抑制,肉眼也可見藻液出現(xiàn)白色絮凝沉淀.到實(shí)驗(yàn)第5d,最低濃度組能夠與FDA結(jié)合并發(fā)出特定綠色熒光的激發(fā)群僅占10.5%,最高濃度組僅僅只有0.1%可以結(jié)合FDA,99.9%的藻細(xì)胞內(nèi)酯酶活性都已被抑制,藻細(xì)胞基本失綠失活,鏡檢只有極少藻細(xì)胞活體存在.

2.3 發(fā)酵液對(duì)銅綠微囊藻抗氧化作用相關(guān)參數(shù)的影響

2.3.1 對(duì)銅綠微囊藻SOD活力的影響 由圖3(a)可知,第1d各組SOD相對(duì)活力均有所升高,與對(duì)照組相比,<0.05,而在第3d,除了最高濃度組,其余各組均上升明顯,<0.01,到第5d,各濃度組均較第3d相對(duì)酶活力有所下降,濃度越高下降越明顯,最高濃度組只有同期對(duì)照組的11.03%.

2.3.2 對(duì)銅綠微囊藻GSH-Px活力的影響 由圖3(b)可知,除了最高濃度組(0.65%),其余各組第1d 和第3d GSH-Px相對(duì)活力均顯著升高,尤其是0.45%組,與對(duì)照組相比,<0.05或<0.01,而最高濃度組,在第1d就開始下降,與同期對(duì)照組相比,<0.05,到第5d,只有同期對(duì)照組的8.47%.

2.3.3 對(duì)銅綠微囊藻MDA含量的影響 由圖3(c)可知,各組MDA含量在第1、3、5d與發(fā)酵液濃度及作用時(shí)間呈顯著正相關(guān)(pearson分析,第1、3、5d 相關(guān)系數(shù)分別為0.923、0.934、0.958,值分別為0.009、0.006、0.003),表明膜脂質(zhì)過(guò)氧化導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)及其功能受損,細(xì)胞代謝失調(diào);同時(shí)第5d SOD以及GSH-Px相對(duì)活力顯著下降也使得膜過(guò)氧化作用增強(qiáng),致MDA含量升高.

*與同期對(duì)照組比較,<0.05,**與同期對(duì)照組比較,<0.01

2.4 發(fā)酵液對(duì)銅綠微囊藻胞內(nèi)外MCs含量的影響

表1為水稻分蘗枝發(fā)酵液作用于銅綠微囊藻第5d,單位體積藻液中藻細(xì)胞內(nèi)、外MCs含量的影響.除最小濃度實(shí)驗(yàn)組(0.25%)的胞內(nèi)MCs含量高于同期對(duì)照組外,其余各實(shí)驗(yàn)組單位體積MCs含量均小于對(duì)照組.這表明發(fā)酵液在抑制銅綠微囊藻生長(zhǎng)的同時(shí)也抑制了其胞內(nèi)MCs的合成,0.45%與0.55%濃度組與對(duì)照組相比,其降低幅度具有極顯著差異(<0.01).胞外MCs含量相對(duì)復(fù)雜,0.25%組的胞外MCs含量遠(yuǎn)低于其胞內(nèi)含量且低于同期對(duì)照組含量,這與MCs在細(xì)胞內(nèi)合成一般不會(huì)立即釋放到胞外的特性有關(guān),此與前人[21-23]研究結(jié)果相吻合;實(shí)驗(yàn)組各組之間具有顯著性差異(<0.05).而0.35%～0.55%組的胞外MCs含量均高于胞內(nèi),這一方面可能是藻細(xì)胞在受到外界脅迫時(shí)做出的自我防御機(jī)制造成,另一方面也是該濃度組細(xì)胞破裂促使藻毒素釋放;而最大濃度組(0.65%)胞外MCs含量不僅遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于同期對(duì)照組具有極顯著性差異(<0.01),同時(shí)也遠(yuǎn)低于其他各實(shí)驗(yàn)組,這與高濃度水稻分蘗枝發(fā)酵液抑藻作用強(qiáng),單位體積內(nèi)藻細(xì)胞數(shù)目少有關(guān),也提示高濃度浸提液更能抑制MCs合成并在一定程度上可能具有相對(duì)更強(qiáng)降解MCs的能力.

表1 水稻分蘗枝發(fā)酵液對(duì)銅綠微囊藻胞內(nèi)外MCs含量的影響

注:同一列相同小寫字母表示在0.05水平上無(wú)顯著差異,不同小寫字母表示在0.05水平上有顯著差異;*表示與同期對(duì)照組具有顯著差異(<0.05),**表示與同期對(duì)照組具有極顯著差異(<0.01).

圖4為發(fā)酵液作用于銅綠微囊藻第5d后對(duì)單位體積藻液中MCs總量的影響,可看出水稻分蘗枝發(fā)酵液對(duì)MCs總量的影響具

有波動(dòng)性,0.35%和0.55%組表現(xiàn)為上升,0.25%、0.45%和0.65%組表現(xiàn)為總量下降且0.45%和0.65%組與同期對(duì)照組具有極顯著性差異(<0.01).最大濃度實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)、外MCs以及總含量均低于同期對(duì)照組,說(shuō)明高濃度的水稻分蘗枝發(fā)酵液在一定程度上可能具有抑制MCs合成與釋放以及降解作用.

圖4 水稻分蘗枝發(fā)酵液對(duì)銅綠微囊藻MCs總量的影響

*與同期對(duì)照組比較,<0.05,**與同期對(duì)照組比較,<0.01

2.5 水稻分蘗枝發(fā)酵液對(duì)銅綠微囊藻胞內(nèi)外多糖含量的影響

表2為發(fā)酵液作用于銅綠微囊藻5d后,對(duì)單位體積藻液中藻細(xì)胞內(nèi)、外多糖含量的影響,可看出,各實(shí)驗(yàn)組胞外多糖含量均小于同期對(duì)照組,且具有極顯著差異(<0.01),同時(shí)除0.25%和0.35%組之間無(wú)顯著性差異外,其余各實(shí)驗(yàn)組間均具有顯著性差異(<0.05).胞內(nèi)多糖含量隨發(fā)酵液濃度變化規(guī)律與胞外多糖含量相似.而無(wú)論胞內(nèi)多糖還是胞外多糖含量,0.45%組均高于其它實(shí)驗(yàn)組,且與其它實(shí)驗(yàn)組之間具有顯著差異(<0.05),這可能是低濃度組(0.25%和0.35%)發(fā)酵液還未達(dá)到觸發(fā)藻細(xì)胞合成并分泌多糖的閾值,而高濃度組(0.55%和0.65%組)則由于藻細(xì)胞破壞以及強(qiáng)烈的抑藻效應(yīng)也同時(shí)抑制了多糖的合成.

表2 水稻分蘗枝發(fā)酵液對(duì)銅綠微囊藻胞內(nèi)外多糖含量的影響

注:同一列相同小寫字母表示在0.05水平上無(wú)顯著差異,不同小寫字母表示在0.05水平上有顯著差異;*表示與同期對(duì)照組具有顯著差異(<0.05),**表示與同期對(duì)照組具有極顯著差異(<0.01).

如圖5所示,可以看出只有0.45% 實(shí)驗(yàn)組的多糖總量高于同期對(duì)照組,<0.01;其余均低于對(duì)照組的多糖總量.實(shí)驗(yàn)組相較于對(duì)照組均具有極顯著性差異(<0.01).多糖含量增加說(shuō)明發(fā)酵液作用于銅綠微囊藻時(shí),刺激了藻細(xì)胞合成和分泌多糖以發(fā)揮其對(duì)外界不良環(huán)境脅迫的抵御功能.而高濃度的發(fā)酵液作用于藻細(xì)胞后多糖含量下降,說(shuō)明該發(fā)酵液抑制了藻細(xì)胞合成分泌多糖的功能,破壞了藻細(xì)胞抵御不良脅迫的能力,最終導(dǎo)致藻細(xì)胞功能缺失死亡.

圖5 發(fā)酵液對(duì)銅綠微囊藻多糖總含量的影響

**與同期對(duì)照組比較,<0.01

3 討論

3.1 利用水稻分蘗枝發(fā)酵液抑藻前景可期

我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó),擁有豐富的稻草秸稈資源,不同稻草秸稈抑藻效果不同[2-3],本文首次研究發(fā)現(xiàn)水稻分蘗枝抑藻效果明顯優(yōu)于普通稻草,同時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)水稻分蘗枝發(fā)酵方式不同其抑藻差異極為顯著,通過(guò)添加纖維素酶以及乳酸菌的發(fā)酵液抑藻效果最佳[5].通過(guò)石油醚、氯仿以及乙酸乙酯對(duì)該發(fā)酵液中的化感物質(zhì)進(jìn)行萃取并經(jīng)過(guò)GC-MS 分析發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中物質(zhì)主要有癸醚、四氫薰衣草醇、馬來(lái)酸二乙基己酯、硬脂酸、花生酸、L-乳酸等,其中L-乳酸含量達(dá)到7.41%.這些物質(zhì)已經(jīng)被研究證明均有不同程度抑藻效應(yīng)[21-23].在實(shí)際應(yīng)用中,有一個(gè)需要考慮的重要問(wèn)題是該發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是否有加重水體富營(yíng)養(yǎng)的可能？從本文研究結(jié)果可看出發(fā)酵液沒有促進(jìn)藻的生長(zhǎng)而是比較強(qiáng)烈的抑制效應(yīng).其原因是因?yàn)榈静葜饕煞质抢w維素,營(yíng)養(yǎng)成分很低,經(jīng)纖維素酶降解及乳酸菌發(fā)酵,其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)更低而能抑藻的活性物質(zhì)增多,所以抑藻作用顯著.我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó),水稻分蘗枝資源豐富且廢棄,通過(guò)適當(dāng)發(fā)酵增強(qiáng)其抑藻化感物質(zhì)的種類和數(shù)量提高其抑藻性能,相比物理、化學(xué)以及其它植物化感物質(zhì)抑藻方法而言不僅成本低廉,操作簡(jiǎn)便且環(huán)保高效,不失為一種有良好應(yīng)用前景的控藻方式.

3.2 水稻分蘗枝發(fā)酵液抑藻生化機(jī)制

在發(fā)酵液脅迫下,銅綠微囊藻生理生化改變的研究是為了探討發(fā)酵液抑藻機(jī)制,以便為發(fā)酵液作為生物抑藻劑的開發(fā)和應(yīng)用提供深層次的理論基礎(chǔ).

酯酶是一種水解酶,其活性大小可以反映細(xì)胞的代謝活動(dòng),FDA作為一種代謝熒光探針,在被藻細(xì)胞吸收和細(xì)胞內(nèi)酯酶轉(zhuǎn)化后其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的綠色熒光可被fitc通道檢測(cè)接收從而反映出酯酶活性,在環(huán)境監(jiān)測(cè)中可快速評(píng)估環(huán)境污染物對(duì)藻類的毒性影響[9],因此,酯酶活性檢測(cè)常作為流式細(xì)胞儀檢測(cè)中敏感的毒理學(xué)指標(biāo)[17].研究發(fā)現(xiàn)水稻分蘗枝發(fā)酵液隨著其濃度加大,作用時(shí)間延長(zhǎng),表征細(xì)胞代謝水平的酯酶活性顯著降低,表明當(dāng)藻細(xì)胞受到超過(guò)其可調(diào)控的化感物質(zhì)脅迫時(shí)藻細(xì)胞膜破壞,細(xì)胞新陳代謝水平迅速下降,這與前人研究結(jié)果一致[12,14].

抗氧化酶SOD及GSH-Px具有將細(xì)胞形成的有毒過(guò)氧化物分子轉(zhuǎn)換為毒害較低或無(wú)害物質(zhì). SOD是細(xì)胞產(chǎn)生的超氧自由基清除因子,通過(guò)反應(yīng)可把有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫,而GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要過(guò)氧化物分解酶,可將過(guò)氧化氫還原為水,兩種酶相互配合,可有效切斷脂質(zhì)過(guò)氧化鏈鎖反應(yīng),減少自由基產(chǎn)生并消除自由基,起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用.本研究表明,當(dāng)水稻分蘗枝發(fā)酵液作用于銅綠微囊藻的第1d和第3d時(shí),除了最高濃度組外,其余各組兩酶活性都顯著升高,只有最高劑量組可能因?yàn)樵寮?xì)胞破壞嚴(yán)重,細(xì)胞合成氧化酶的能力大幅下降.本課題組在前期研究中也發(fā)現(xiàn)浮游藻類在逆境中如在亞油酸脅迫下,藻細(xì)胞SOD與GSH-Px 活性均在一定時(shí)間內(nèi)應(yīng)激性升高[10-11],與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似,但當(dāng)逆境使得細(xì)胞活性氧積累超過(guò)了氧化酶所能消除的能力時(shí),就會(huì)引起過(guò)氧化物積累,膜脂質(zhì)過(guò)氧化加劇,造成細(xì)胞膜損傷引起細(xì)胞破裂崩解.這也可以較好地解釋實(shí)驗(yàn)組MDA含量與發(fā)酵液濃度以及作用時(shí)間呈正相關(guān)的原因.

藻細(xì)胞富有的能量有兩種用途:一是用于自身生長(zhǎng)繁殖和代謝,二是用于抵御外界不良環(huán)境脅迫.微囊藻毒素和多糖的合成與釋放屬于第二種情況[24-26].微囊藻毒素和多糖合成量的增加是微囊藻細(xì)胞對(duì)環(huán)境不良脅迫的一種自我保護(hù)措施.有報(bào)道稱,一定濃度的微囊藻毒素會(huì)激活藻細(xì)胞多糖合成基因,從而使多糖含量也隨著藻毒素的增加而增加[13],多糖合成的增加,利于微囊藻聚集成群以抵御環(huán)境的脅迫[24].但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,單位體積藻液中MCs或多糖含量?jī)H在浸提液為中等濃度組有所增加,而在低濃度以及最大濃度發(fā)酵液添加量下均表現(xiàn)出下降情況,說(shuō)明化感物質(zhì)濃度影響到MCs和多糖含量,發(fā)酵液濃度太低或許不足以激發(fā)其多糖或藻毒素相關(guān)基因的表達(dá),而發(fā)酵液濃度過(guò)高則因?yàn)橐种屏嗽宓纳L(zhǎng)繁殖以及各種代謝活動(dòng),使得藻毒素和多糖合成的相關(guān)基因表達(dá)受阻,這與前人的有關(guān)研究結(jié)果相似[27-28].尋找既能良好抑藻,又不至于升高水體藻毒素的抑藻劑正是目前生態(tài)工作者追求的目標(biāo).因此,水稻分蘗枝發(fā)酵液抑藻的這種性能可為開發(fā)高效低毒的生物抑藻劑提供理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

4 結(jié)論

4.1 水稻分蘗枝發(fā)酵液抑藻機(jī)理之一是可顯著降低表征藻細(xì)胞代謝水平的酯酶活性,實(shí)驗(yàn)第5d, 0.65%濃度組99.9%藻細(xì)胞內(nèi)酯酶活性被抑制,說(shuō)明藻細(xì)胞受到水稻分蘗枝發(fā)酵液脅迫時(shí)其新陳代謝水平迅速下降.

4.2 水稻分蘗枝發(fā)酵液各濃度組均可顯著降低藻細(xì)胞SOD與GSH-Px水平,引起MDA積累,造成細(xì)胞膜損傷甚至破裂崩解.

4.3 0.65%濃度水稻分蘗枝發(fā)酵液不會(huì)引起MCs升高,甚至顯著降低MCs和多糖的含量.

總之,水稻分蘗枝發(fā)酵液可通過(guò)影響銅綠微囊藻的代謝過(guò)程,降低藻細(xì)胞抗氧化及抵御對(duì)環(huán)境脅迫的能力,從而達(dá)到有效抑藻的目的.

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Effects of rice straw fermentation liquid on the biochemical parameters of

ZHANG Ting-ting1,2*, HU Chun-xia1, CHEN Bo2

(1.Yuanpei College of Shaoxing University, Shaoxing 312000, China；2.College of Life Sciences, Anhui Normal University, Wuhu 241000, China)., 2021,41(11)：5345～5352

The enzymatic characteristics, antioxidant capacity, microcystins and polysaccharide contents ofwere investigated under the stress of rice straw (rice tillering branch) fermentation liquid, so as to provide a further theoretical basis for using rice straw to inhibit algae. The results showed that the esterase activity ofunder the stress of rice tiller branch fermentation liquid significantly reduced, which characterizes the level of algal cell metabolism. On the 5th day, 99.9% of theintracellular esterase activity was inhibited in the highest concentration group (0.65%), the SOD and GSH-Px activities of the cells were only 11.03% and 8.47% of the control group in the same period. The MDA content was significantly positively correlated with the concentration of the fermentation liquid and the action time, pearson analysis showed that thevalues were greater than 0.9 for all concentration groups, while thevalues were less than 0.01, indicating that the rice tiller fermentation liquid can significantly reduce the antioxidant level of; but the high-concentration rice tiller fermentation liquid did not cause the increase of MCs, and even significantly reduce the content of MCs and polysaccharides, compared with the control group,<0.01. Therefore, the fermentation liquid of rice tillering branches can affect the metabolic process of, and reduce the ability of the cells to resist oxidation and environmental stress, thereby it can achieve the purpose of effectively inhibiting

rice tillering branches；；algae inhibition mechanism；biochemical parameters

X52

A

1000-6923(2021)11-5345-08

張庭廷(1955-),女,安徽東至人,博士,教授,主要研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)以及化學(xué)生態(tài)學(xué).發(fā)表論文80余篇.

2021-04-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31170443)

* 責(zé)任作者, 教授, cyhztt@ahnu.edu.cn