楊 睿,袁林江*,王 剛,袁林杰,有小龍,牛晚霞,于麗萍

活性污泥中一氧化氮還原酶的提取和測定優(yōu)化

楊 睿1,2,3,袁林江1,2,3*,王 剛1,2,3,袁林杰1,2,3,有小龍1,2,3,牛晚霞1,2,3,于麗萍1,2,3

(1.西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院,西安 陜西 710055；2.陜西省環(huán)境工程重點實驗室,西安 陜西 710055；3西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點實驗室,西安 陜西 710055)

通過正交實驗,研究了超聲破碎法和低溫高壓破碎法提取一氧化氮還原酶(nitric oxide reductase,nor)的活性,分析了超聲強度和次數(shù),破碎壓力和次數(shù),裂解液的添加量等因素對于胞內(nèi)可溶性蛋白和核酸(DNA)的釋放與提取nor活性的影響.根據(jù)活性污泥中酶的催化特性以及其他實驗條件,完善了nor催化活性的測定方法.結(jié)果表明超聲法提取nor的參數(shù)應(yīng)設(shè)定為,超聲次數(shù)為100次,超聲強度為500W,裂解液的添加量為0.1mL.低溫高壓破碎法提取nor的參數(shù)應(yīng)設(shè)定為破碎次數(shù)為4次,破碎壓力為50MPa,裂解液的添加量為0.1mL.低溫高壓破碎法下的胞內(nèi)可溶性蛋白和DNA的釋放量與nor的最大催化活性要高于超聲破碎法.此外,在nor催化活性的測定方法中,nor活性測定終點時間應(yīng)為15min.

氧化亞氮；污泥膨脹；一氧化氮還原酶；提取；測定

溫室氣體氧化亞氮排放問題[1-3]和污泥膨脹問題[4-5]是污水處理廠一直面臨且急需解決的兩個關(guān)鍵問題.解決問題的關(guān)鍵是判別問題的種類以及何種因素引起該問題.

污水處理廠中氧化亞氮產(chǎn)生途徑有三種,分別為羥胺的不完全氧化、異養(yǎng)反硝化過程和硝化菌的反硝化過程.不同的運行條件或運行模式下,這三種途徑對于總氧化亞氮排放的貢獻是不同的.如何快速識別何種途徑是氧化亞氮產(chǎn)生的主要途徑仍是一個有待解決的問題.活性污泥中一氧化氮還原酶(nor)活性的測定方法的構(gòu)建和完善將會解決這一問題.羥胺的不完全氧化是指,羥胺(氨氧化過程的中間產(chǎn)物)可以自發(fā)或在細胞色素P460與其他化學(xué)物質(zhì)(如二氧化錳、亞鐵離子等)的催化作用下生成氧化亞氮的生物和化學(xué)反應(yīng)過程[6-7].由此可見,羥胺的不完全氧化過程中產(chǎn)生的氧化亞氮與nor的活性并無關(guān)系.而異養(yǎng)反硝化過程和硝化菌的反硝化過程則是指,氮氧化物在反硝化酶的催化作用生成氧化亞氮或氮氣的過程.在鏈式反應(yīng)中,與氧化亞氮產(chǎn)生直接相關(guān)的過程則是一氧化氮在nor的催化作用下生成氧化亞氮的過程.在這兩種反硝化過程中,用于還原一氧化氮的電子來源有著明顯的區(qū)別.硝化菌的反硝化過程的電子來源為氨氮的氧化過程,異養(yǎng)反硝化過程的電子來源為有機物的氧化過程.通過分析逸散的氧化亞氮與nor活性的關(guān)系,可以區(qū)分羥胺的不完全氧化過程和其他兩個過程.通過分析nor活性與有機物的關(guān)系,則可以區(qū)分硝化菌的反硝化過程和異養(yǎng)反硝化過程.

污泥膨脹是活性污泥法污水處理廠一直以來都需要克服的一個難題.關(guān)于污泥膨脹的原因存在眾多觀點,其中氮氧化物假說[8-9]認為是由于污泥產(chǎn)生一氧化氮所致.一氧化氮影響了菌膠團中細菌內(nèi)部的好氧細胞色素,從而抑制好氧的條件下細菌對底物的利用.與之相對,絲狀菌只能將硝態(tài)氮還原為亞硝態(tài)氮,并不存在完全反硝化過程.故而,絲狀菌的細胞內(nèi)部并不會累積中間產(chǎn)物,從而具有較大的競爭優(yōu)勢.nor的催化底物為一氧化氮,其與亞硝酸鹽還原酶的催化活性是活性污泥中一氧化氮產(chǎn)生的“閥門”,直接決定了細菌內(nèi)部是否會累積一氧化氮.由于胞內(nèi)及胞外的一氧化氮的測定難度較大,很難判定是否是由于一氧化氮的累積造成的污泥膨脹.而對相關(guān)酶活性的測定,尤其是nor活性的測定,就成為判定一氧化氮累積的關(guān)鍵.

nor是一種位于革蘭氏陰性菌細胞膜上的酶蛋白,其生理功能是催化一氧化氮還原成氧化亞氮[10].目前,盡管已有[11-12]、[13-14]和[15]等純菌中nor的提取和活性測定的報道,但尚無污水生物處理活性污泥中細菌中提取方法的相關(guān)報道.由于活性污泥與純菌有著明顯的區(qū)別,其所用的方法可能并不適用于活性污泥.故而,在運用于活性污泥前,應(yīng)對原有技術(shù)進行優(yōu)化和完善.

本研究采用超聲破碎法、低溫高壓破碎法的方法,從超聲強度、超聲頻率、裂解液的使用、破碎壓力和酶活性測定的時間等方面,旨在探索研究出一種簡單快捷的污水生物處理活性污泥中nor提取與測定方法,為解決污水處理廠中所存在的氧化亞氮的逸散問題和污泥膨脹問題提供技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 材料來源

活性污泥取自實驗室規(guī)模的以模擬生活污水為進水的A/O SBR.反應(yīng)器的總有效容積為6L,其中反應(yīng)容積為5L.用于啟動反應(yīng)器的活性污泥來自西安第四污水處理廠.反應(yīng)器運行的周期時間為8h,其中進水期為10min、缺氧期為120min、好氧期為240min、沉淀期為40min、出水期為10min和閑置期為60min.模擬的生活污水以葡萄糖和乙酸鈉為碳源,以氯化銨為氮源,COD約為400mg/L,氨氮約為60mg/L,具體的配方如表1所示.反應(yīng)器的溫度維持在(25±3)℃;污泥濃度維持在(3000±500)mg/L,曝氣強度維持在1.0L/min.在反應(yīng)器的氨氮去除效率和COD去除率穩(wěn)定后,取用于分離nor的活性污泥.為了提取到高的活性nor,污泥取樣時間選擇在缺氧攪拌30min后.

表1 模擬生活污水配方

1.2 nor的提取

第一步,分離污泥中的雜質(zhì).取泥水混合液20mL,以4000r/min離心10min使泥水分離.傾倒上清液,并將沉淀用緩沖溶液(200mmol/L Tris-Hcl, pH值8.0)定容至20mL.利用振蕩器將定容后的溶液重新混勻,再以4000r/min離心10min分離泥樣.以此方法利用緩沖溶液沖洗沉淀物,反復(fù)3次.沖洗后,利用緩沖溶液(50mmol/L Tris-Hcl,150mmol/L KCL )重新將沉淀物定容并混勻至20mL(使污泥濃度維持在3000±500mg/L).第二步,破碎細胞,溶解細胞膜,并釋放酶蛋白.破碎細胞,破碎后的樣品在4℃,5000離心10min,分離雜質(zhì).取10mL上清液至離心管中,加入適量苯乙醇和十二烷基-beta-D-麥芽糖苷.在冰浴中,樣品與裂解液反應(yīng)15min.第三步,分離樣品中的雜質(zhì),提高酶樣品的純度.在4℃,40000離心90min,分離雜質(zhì)和酶樣.所得上清液用于測定nor活性.如果樣品沒有立即使用,測試的酶樣品被儲存在-80℃.

1.3 細胞破碎方法

1.3.1 超聲破碎法 用BILON92-II超聲波細胞粉碎機(上海比朗儀器有限公司)0℃的冰-水混合水浴中破碎細胞,調(diào)節(jié)輸出功率分別為300W、400W、500、600W,工作3s,間歇3s,破碎次數(shù)分別為30次、60次、90次、100次,裂解液(0.02%苯乙醇,1%十二烷基-beta-D-麥芽糖苷)0mL、0.1mL、0.5mL、1mL.實驗采用正交實驗,具體正交實驗設(shè)計如表2所示.

表2 超聲破碎法正交實驗設(shè)計

1.3.2 低溫高壓破碎法 用低溫高壓細胞破碎儀于在4℃下破碎細胞,破碎壓力分別為50MPa、100MPa、150MPa、200MPa,破碎次數(shù)分別為1次、2次、3次、4次,裂解液(0.02% 苯乙醇,1%十二烷基-beta-D-麥芽糖苷)0mL、0.1mL、0.5mL、1mL.實驗采用正交實驗,具體的正交實驗設(shè)計如表3所示.

1.3.3 nor活性測定 (1)酶活力測定原理:根據(jù)nor的特性和一些論文的報道,本實驗以抗壞血酸鈉作為電子供體,以吩嗪硫酸甲酯作為電子傳遞介體,以一氧化氮為電子受體.nor的活性以氧化亞氮的增加量來計算酶活性.

表3 低溫高壓破碎法正交實驗設(shè)計

(2)酶活性單位定義:在28℃,pH值8.0條件下,每毫升酶蛋白所具有的酶活力(U/mL),其中,一個酶活力單位為每分鐘產(chǎn)生1μmol氧化亞氮的酶量(U).按式(1)計算nor的活性(U/mL)

(N-N)/(-) (1)

式中:為nor活性,U/mL;N為加入待測樣的反應(yīng)裝置內(nèi)氧化亞氮的量,μmol;N為空白對照組的反應(yīng)裝置內(nèi)氧化亞氮的量,μmol;為反應(yīng)時間,min;為待測酶樣體積,mL.

(3)酶活力測定步驟:nor的酶活性是在13mL的厭氧的瓶口用橡膠隔片密封的瓶子中測定.酶活反應(yīng)液的體積為3mL,包含100μmol抗壞血酸鈉、300μmol乙酸鈉和0.5μmol吩嗪硫酸甲酯.第一步,將酶樣品,反應(yīng)液和底物充分混合.向測試瓶中加入酶活反應(yīng)液,待測試的酶的樣品(1mL)和25μmol 一氧化氮.第二步,酶樣品與底物進行反應(yīng).將測試瓶放入搖床中劇烈震動一段時間.第三步,中斷酶樣品與底物的反應(yīng),測定產(chǎn)物的增加量并依據(jù)式(1)計算nor活性.利用注射器在反應(yīng)瓶中提取1mL氣體樣品,用氬氣稀釋后,利用氣相色譜法測定樣品中氧化亞氮的含量.比較加入酶樣和空白樣品中的氧化亞氮的量,來計算酶的活性.

1.4 測定方法

酶液中總蛋白質(zhì)含量測定:考馬斯亮藍法[16];酶液中總核酸(DNA)含量測定:二苯胺法[17];酶活性測定:氣相色譜法[11-15,18-19].

1.5 酶活性測定方法的優(yōu)化

反應(yīng)終止時間的確定,測定提取的酶動力學(xué)參數(shù),選擇催化反應(yīng)減緩的時間為活性的測定的終點時間.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法的破壁效果

nor為革蘭氏陰性菌的膜內(nèi)蛋白,能否將菌體細胞完全破碎、細胞膜是否被破壞、胞內(nèi)可溶性蛋白是否能完全釋放是該酶提取的首要因素.本研究分析了不同破碎條件下胞內(nèi)酶蛋白和核酸(DNA)釋放量,以及不同因素對于胞內(nèi)可溶性蛋白和DNA的釋放的影響.從圖1可知,實驗批次為16和32的實驗破碎效果最好.換句話講,當超聲破碎法的操作參數(shù)設(shè)定為超聲次數(shù)為100次,超聲強度為600W,不添加裂解液時,破碎效果最好的;當?shù)蜏馗邏浩扑榉ǖ牟僮鲄?shù)設(shè)定為破碎壓力為200MPa,破碎次數(shù)為4次,不添加裂解液時,破碎效果最好的.對比兩者可知,無論是胞內(nèi)可溶性蛋白的釋放量,還是DNA的釋放量,低溫高壓破碎法的效果要優(yōu)于超聲破碎法.這個現(xiàn)象的原因是與低溫高壓破碎法相比,超聲破碎法對于一些酵母菌和革蘭氏陽性菌的破碎效果較差,這使得一部分胞內(nèi)蛋白和核酸沒有得到充分的釋放[20].

圖1 破碎條件對破碎效果的影響

箭頭上的數(shù)值代表超聲強度或破碎壓力,圖柱上的數(shù)值代表超聲次數(shù)或破碎次數(shù),下同

從圖2A和圖2C可知,當超聲次數(shù)在30～100次時,蛋白質(zhì)(=4.44>0.1=3.29)和DNA(=4.61>0.1= 3.29)的釋放量均隨著破碎次數(shù)的增加而增加.當超聲強度在300～600W時,蛋白質(zhì)的釋放量隨著超聲強度的增加而增加(=50.76>0.1=3.29),DNA的釋放量隨著超聲強度的增加呈現(xiàn)先下降后增長的趨勢(=75.36>0.1=3.29).當裂解液的添加量在0～1mL時,蛋白質(zhì)(=0.32<0.1=3.29)和DNA(=2.0<0.1= 3.29)的釋放量變化并不大.從圖2B和圖2D可知,當破碎次數(shù)在1～4次之間時,蛋白質(zhì)(=99.70>0.1= 3.29)和DNA(=28.54>0.1=3.29)的釋放量均隨著破碎次數(shù)的增加而增加.當破碎壓力在50～200MPa時,蛋白質(zhì)(=23.45>0.1=3.29)和DNA(=4.44>0.1= 3.29)的釋放量隨著破碎壓力的增加而增加.當裂解液的添加量在0～1mL時,蛋白質(zhì)(=0.22<0.1=3.29)和DNA(=0.06<0.1=3.29)的釋放量變化并不大.隨著超聲法的超聲強度和次數(shù)的提高或低溫高壓破碎法的破碎壓力和次數(shù)的提高,胞內(nèi)可溶性蛋白和DNA的釋放量越高[20],而裂解液的添加對于蛋白質(zhì)和DNA的釋放量的影響較小的原因是裂解液的功能是溶解細胞膜(十二烷基-beta-D-麥芽糖苷)和保護酶蛋白的結(jié)構(gòu)(苯乙醇),其對細胞壁的破碎影響較小.

圖2 細胞破碎的正交試驗效應(yīng)曲線

2.2 酶活測定方法優(yōu)化結(jié)果

從圖3可知,在反應(yīng)開始到15min,酶的催化特性呈現(xiàn)出一級反應(yīng).由于取樣的復(fù)雜性,在這一時間段并不適合作為活性測定的反應(yīng)終點.當反應(yīng)時間延長至15min后,氧化亞氮的濃度變化變緩,催化反應(yīng)變慢.取樣時間對于酶活的測定的干擾最少.因此,選擇酶活性測定終點時間應(yīng)大于等于15min.

圖3 nor的酶動力曲線

2.3 不同破碎條件下,破碎方式和參數(shù)對于測定nor酶活性的影響

破碎條件不僅會影響破壁效果和胞內(nèi)可溶性蛋白釋放量,也會影響酶蛋白的本身的特性.本研究分析了不同破碎條件下nor的催化活性,以及不同因素對nor的催化活性的影響.

從圖4A中可見,當超聲次數(shù)為90次,超聲功率為600W,裂解液的添加量為0.1mL(實驗批次為15)時,nor的催化活性最高.從圖4B中可見,當破碎次數(shù)為2次,破碎壓力為50MPa,裂解液的添加量為0.1mL (實驗批次為18)時,nor的催化活性最高.對比兩者可知,低溫高壓破碎法下的nor的最大催化活性要高于超聲破碎法.這個現(xiàn)象的原因是與低溫高壓破碎法相比,超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團和局部高溫會使一部分酶失活[21].

結(jié)合圖5A和表4可知,超聲次數(shù)對nor的催化活性的影響并不顯著.隨著超聲強度增加,nor的催化活性活呈現(xiàn)先增長,后下降的趨勢,并在超聲強度為500W,達到最大值.這個現(xiàn)象的原因是超聲功率的增大不僅會增加胞內(nèi)酶的釋放,也會破壞部分酶蛋白的結(jié)構(gòu).隨著裂解液的添加量的增加,nor的催化活性活呈現(xiàn)先增長,后下降的趨勢,并在裂解液的添加量為0.1mL,達到最大值.這個現(xiàn)象的原因是過量的表面活性劑的添加(十二烷基-beta-D-麥芽糖苷),會破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)[22].結(jié)合圖5B和表5可知,低溫高壓法的破碎次數(shù)對nor的催化活性的影響并不顯著.隨著破碎壓力增加,nor的催化活性活呈現(xiàn)先下降,后上升的趨勢,并在破碎壓力為50MPa,達到最大值.這個現(xiàn)象的原因是破碎壓力的增大不僅會增加胞內(nèi)酶的釋放,也會破壞部分酶蛋白的結(jié)構(gòu).隨著裂解液的添加量的增加,nor的催化活性活呈現(xiàn)先增長,后下降的趨勢,并在裂解液的添加量為0.1mL,達到最大值.

表4 超聲破碎法方差分析

表5 低溫高壓破碎法方差分析

從表6的因素優(yōu)先水平分析可知,超聲強度的影響要大于超聲次數(shù)的影響,超聲次數(shù)的影響要大于裂解液的添加量.結(jié)合表4可知,與超聲次數(shù)和裂解液的添加量相比較,超聲強度的選取是保證nor活性的關(guān)鍵因素.此外,從表6可知,超聲次數(shù)的最優(yōu)條件為30次,超聲強度的最優(yōu)條件為500W,以及裂解液的添加量的最優(yōu)條件為0.1mL.從表7的因素優(yōu)先水平分析可知,低溫高壓法的破碎壓力的影響要大于裂解液的添加量的影響,裂解液的添加量的影響要大于破碎次數(shù). 結(jié)合表5可知,與破碎次數(shù)相比較,破碎壓力和裂解的添加量的選取是保證nor活性的關(guān)鍵因素.此外,從表7可知,破碎壓力的最優(yōu)條件為50Mpa,破碎次數(shù)的最優(yōu)條件為2次,以及裂解液的添加量的最優(yōu)條件為0.1mL.

表6 超聲法優(yōu)先水平

表7 低溫高壓破碎法優(yōu)先水平

通過對比胞內(nèi)可溶性蛋白和DNA的釋放量和酶活性可知,盡管隨著超聲法的超聲強度和次數(shù)的提高或低溫高壓破碎法的破碎壓力和次數(shù)的提高,胞內(nèi)可溶性蛋白和DNA的釋放量越高,但酶活性并沒有提高,這說明隨著兩種破碎方法的破碎強度和破碎次數(shù)的提高,破碎過程會對酶的本身產(chǎn)生一定的影響,從而影響了酶的活性.故而,影響酶活性的關(guān)鍵因素應(yīng)選擇選擇適合保持nor的催化活性的因素.

綜合考慮胞內(nèi)可溶性蛋白和DNA的釋放量和酶活性,超聲破碎法提取nor的參數(shù)應(yīng)設(shè)定為超聲次數(shù)為100次,超聲強度為500W,裂解液的添加量為0.1mL.低溫高壓破碎法提取nor的參數(shù)應(yīng)設(shè)定為破碎次數(shù)為4次,破碎壓力為50Mpa,裂解液的添加量為0.1mL.

3 結(jié)論

3.1 盡管隨著超聲法的超聲強度和次數(shù)的提高或低溫高壓破碎法的破碎壓力和次數(shù)的提高,胞內(nèi)可溶性蛋白和DNA的釋放量越高,但酶活性并沒有提高,這說明隨著兩種破碎方法的破碎強度和破碎次數(shù)的提高,破碎過程會對酶的催化活性產(chǎn)生一定的負面影響.

3.2 對超聲破碎法而言,超聲強度是提取nor的關(guān)鍵控制參數(shù);對低溫高壓破碎法而言,破碎壓力和裂解液的添加量是提取nor的關(guān)鍵控制參數(shù).

3.3 對于活性污泥而言,超聲破碎法的最佳的參數(shù)應(yīng)設(shè)定為超聲次數(shù)為100次,超聲強度為500W,裂解液的添加量為0.1mL;低溫高壓破碎法的最佳的參數(shù)應(yīng)設(shè)定為破碎次數(shù)為4次,破碎壓力為50Mpa,裂解液的添加量為0.1mL.

3.4 低溫高壓破碎法下的胞內(nèi)可溶性蛋白和DNA的釋放量與nor的最大催化活性要高于超聲破碎法.

nor活性測定終點時間應(yīng)為15min.

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Optimizations of extraction and activity determination methods of nitric oxide reductase in activated sludge.

YANG Rui1,2,3, YUAN Lin-jiang1,2,3*, WANG Gang1,2,3, YUAN Lin-jie1,2,3, YOU Xiao-long1,2,3, NIU Wan-xia1,2,3, YU Li-ping1,2,3

(1.School of Environment and Municipal Engineering, Xi'an University of Architecture and Technology, Xi￠an 710055, China；2.Key Laboratory of Environmental Engineering of Shaanxi Province, Xi￠an 710055, China；3.Key Laboratory of Northwest Water Resources and Environmental Ecology Ministry of Education, Xi￠an 710055, China)., 2021,41(11)：5169～5176

Orthogonal experiments were carried out to study the effects of different fragmentation methods (e.g. fragmentation by ultrasonic, fragmentation by low temperature and high-pressure) on the catalytic activity of nitric oxide reductase (nor). The release of intracellular soluble protein, nucleic acid (DNA) and the catalytic activity of nor were analyzed under different ultrasonic intensity and frequency, breaking pressure and frequency, and the amount of lysate addition. According to the catalytic characteristics of enzymes in activated sludge under different experimental conditions, the method for measuring the catalytic activity of nor was improved. According to the results, the parameters of nor extraction by ultrasonic fragmentation were suggested to set at 100times (ultrasonic times), 500W (ultrasonic intensity), and 0.1mL (amount of lysate addition). The parameters of nor extraction by low temperature and high-pressure fragmentation were suggested to set at 4times (breaking times), 50Mpa (breaking pressure), and 0.1mL (amount of lysate addition). The release of intracellular soluble protein, DNA and the maximum catalytic activity of nor by low temperature and high-pressure fragmentation were higher than that by ultrasonic fragmentation. Last but not least, the end time for activity determination of nor was suggested at 15min.

nitrous oxide；sludge bulking；nitric oxide reductase；extraction；activity determination

X703

A

1000-6923(2021)11-5169-08

楊 睿(1994-),男,山西臨汾人,博士,主要從事水污染控制與資源化等研究.

2021-03-11

國家自然科學(xué)基金資助項目(51878538)

* 責(zé)任作者, 教授, yuanlinjiang@xauat.edu.cn