佟凱軍，張 亮，湯坤龍，楊長海

當(dāng)前我國有15%左右的育齡夫婦面臨不孕不育癥的問題，而其中約一半因素由男性不育引起[1-2]。原發(fā)性無精子癥(idiopathic azoospermia，IA)是指男性精液中表現(xiàn)出不明原因的無精子，而細(xì)胞遺傳學(xué)和激素內(nèi)分泌檢查均正常[3-4]。IA是男性不育的最嚴(yán)重形式之一，發(fā)病率占男性不育的30%～40%[5]。盡管研究者在男性不育家族病例及動物模型中發(fā)現(xiàn)一些基因異常表達(dá)與IA密切相關(guān)，但I(xiàn)A的潛在機(jī)制仍不清楚。微小RNA(miRNA)是一類小的非編碼RNA分子，通常由19～23個核苷酸構(gòu)成，通過與目的基因信使RNA(mRNA)互補(bǔ)結(jié)合來降解或抑制目的基因翻譯[6]。miRNA在生理和病理過程中具有廣泛的功能，并已闡明其在調(diào)節(jié)精子發(fā)生方面亦發(fā)揮著重要作用[7]。一些miRNA可參與減數(shù)分裂中關(guān)鍵基因的沉默，當(dāng)這些miRNA表達(dá)發(fā)生改變時則導(dǎo)致男性不育[8]。ZHUANG等[9]通過芯片發(fā)現(xiàn)51個miRNA在IA病人睪丸組織中表達(dá)上調(diào)，而42個miRNA表達(dá)下調(diào)，其中miR-186表達(dá)上調(diào)超過4倍。目前，關(guān)于miR-186與IA的相關(guān)性研究尚未見報道。本研究收集IA病人140例和正常生育的男性140名的外周血標(biāo)本，旨在檢測miR-186在2組外周中的表達(dá)水平，分析其與無精子癥因子(AZF)微缺失的相關(guān)性，并評估其在IA診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 材料 人外周血DNA及RNA提取試劑購于日本Takara公司，PCR引物購于美國Thermo Scientific公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑購于德國Qiagen公司，實時熒光定量PCR試劑購于瑞士Roche公司，多重PCR試劑購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，瓊脂糖凝膠購于美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 臨床標(biāo)本 收集2015-2017年在中國人民解放軍第983醫(yī)院泌尿外科就診的IA病人(IA組)140例和正常生育的男性(對照組)140名的外周血標(biāo)本5 mL。IA病人診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)連續(xù)三次精液樣本中均未檢測到精子;(2)無內(nèi)分泌缺陷;(3)無生殖系統(tǒng)炎癥、損傷及梗阻;(4)無核型異常。正常生育的男性診斷標(biāo)準(zhǔn)：至少育有一孩，且未行人類輔助生殖技術(shù)(ARTs)。IA組病人年齡20～51歲；對照組年齡18～56歲。本研究已獲得所有參與者的書面知情同意，并已得到本單位醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 人外周血DNA和RNA的提取 根據(jù)DNA及RNA提取試劑說明書提取受試者外周血標(biāo)本中的DNA和RNA。采用NanoDrop2000C型超微分光光度計測定各樣本中DNA和RNA濃度，并用無RNA酶去離子水將各樣本RNA濃度調(diào)定為1 μg/μL，隨后放置-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 多重PCR試驗 采用多重PCR試驗檢測樣本中AZF微缺失。反應(yīng)體系：基因組 DNA 100 ng，10×緩沖液2.5 μL，上游和下游引物各1 μL，DNA 聚合酶 1 U，去離子補(bǔ)至25 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳在60 V恒壓下電泳20 min，隨后利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄試驗 取1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系：RNA 1 μL，逆轉(zhuǎn)錄試劑5 μL和無RNA酶去離子水4 μL，反應(yīng)總體積為10 μL。合成條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 30 min。隨后將cDNA用無RNA酶去離子水稀釋10倍后放置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 實時熒光定量PCR試驗 以cDNA為模版在ABI 7500型定量PCR儀上進(jìn)行實時熒光定量PCR。反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，熒光定量PCR試劑10 μL，上游和下游引物各0.5 μL，去離子水8 μL，反應(yīng)總體積為20 μL。反應(yīng)條件：98 ℃ 10 min，隨后98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。miR-186引物：5′-TGC TTG TAA CTT TCC AA-3′和5′-AGC TCA AAC TTC CCA A-3′；小核RNA U6引物：5′-CCA TGC TCT TCT ACT CCT-3′和5′-CAC TGA TGT CGG TTA GTT-3′。以U6為內(nèi)參，待PCR反應(yīng)結(jié)束后，采用2-ΔΔCt法[10]計算各樣本中miR-186的表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用t檢驗、χ2檢驗、Spearman相關(guān)分析和ROC分析。

2 結(jié)果

2.1 2組一般資料比較 2組年齡、體質(zhì)量指數(shù)、睪酮水平及吸煙情況差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。IA組中8例病人存在AZF微缺失，微缺失率為5.71 %(8/140)，而對照組未檢測出AZF微缺失(P<0.05 )(見表1)。

表1 2組一般資料比較

2.2 2組外周血中miR-186表達(dá)量比較 miR-186在對照組外周血中的表達(dá)量為0.28±0.21，而在IA組外周血中的表達(dá)量為0.75±0.42，2組間miR-186表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.84，P<0.01)。

2.3 IA組外周血中miR-186的表達(dá)與AZF微缺失相關(guān)性分析 根據(jù)IA組中病人AZF微缺失情況，將其分為AZF微缺失組(n=8)和非AZF微缺失組(n=132)。miR-186在AZF微缺失組中的表達(dá)量為0.76±0.24，而在非AZF微缺失組中的表達(dá)量為0.72±0.40，2組間miR-186表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.28，P>0.05)。Spearman相關(guān)分析顯示，外周血中miR-186的表達(dá)與AZF微缺失無相關(guān)性(P>0.05)。

2.4 外周血中miR-186表達(dá)對IA的診斷價值分析 采用ROC曲線評價外周血中miR-186表達(dá)對IA的診斷價值。miR-186的ROC曲線下面積為0.84(95%CI:0.794～0.886)。當(dāng)miR-186表達(dá)量為0.52時為最佳診斷分界點(diǎn)，敏感度為71.86 %，特異度為80.39 %(見圖1)。

3 討論

臨床大部分男性不育病人表現(xiàn)為無精子癥，包括IA和梗阻性無精子癥[3-4]。近幾十年來，盡管ARTs在治療IA方面取得了巨大的進(jìn)展，但ARTs過程中引起的遺傳異?？赡軐κ芫旬a(chǎn)生嚴(yán)重影響。因此，完全有必要闡明IA發(fā)生的遺傳機(jī)制，并開發(fā)IA表型篩選新的分子標(biāo)志物。miRNA是一類小的非編碼RNA分子，它通過堿基配對方式結(jié)合mRNA在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因沉默中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。一些miRNA在小鼠睪丸中特定或高表達(dá)，提示這些miRNA可能在精子發(fā)生中起重要作用[7]。例如，LIAN等[11]利用miRNA芯片發(fā)現(xiàn)IA病人睪丸組織中有154個miRNA呈差異性下調(diào)，而19個miRNA呈差異性上調(diào)，包括miR-302a、miR-491-3p、miR-520d-3p和miR-383等。WU等[12]通過全基因組miRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)miR-141、miR-429和miR-7-1-3p在IA病人精漿中的表達(dá)較正常男性顯著增加。TANG等[13]報道隱睪病人睪丸組織和正常睪丸組織之間呈差異表達(dá)的miRNA，其中297個下調(diào)和175個上調(diào)的miRNA。鑒于上述研究，我們推測miRNA在IA病人外周血中亦存在差異表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-186在IA病人外周血中呈高表達(dá)。

miR-186位于人染色體1p31.1區(qū)域，既然研究表明miR-186在腫瘤、慢性阻塞性肺疾病、關(guān)節(jié)炎、缺血性卒中及阿爾茨海默氏病中異常表達(dá)并發(fā)揮重要作用[14-15]。例如，miR-186在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)并促進(jìn)腫瘤生長[16]。miR-186在氧糖剝奪/再灌注模型中顯著上調(diào)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。目前關(guān)于miR-186在生殖方面的報道較少。CHEN等[18]發(fā)現(xiàn)91個miRNA在豬精子中表達(dá)上調(diào)，而108個miRNA表達(dá)下調(diào)，其中miR-10a-5p、miR-125b、let-7f和miR-186分別在精原細(xì)胞、粗線期精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞和精子中高表達(dá)。ZHUANG等[9]報道m(xù)iR-186在IA病人睪丸組織中表達(dá)較對照組顯著升高。鑒于上述二種不同的研究結(jié)果，本研究收集IA病人140例和正常生育的男性140名的外周血標(biāo)本，采用實時熒光定量PCR分析miR-186在2組外周血中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-186在IA組外周血中的表達(dá)量較對照組顯著升高。該結(jié)果與ZHUANG等[9]報道的一致，證實miR-186在IA病人外周血中呈高表達(dá)。

Y染色體上的遺傳構(gòu)成對男性性別決定和正常的精子發(fā)生十分關(guān)鍵。Y染色體q11.23區(qū)域因控制許多參與精子發(fā)生的基因，故該區(qū)域又稱為AZF。研究發(fā)現(xiàn)，AZF微缺失導(dǎo)致的精子發(fā)生障礙是IA的一個重要因素[19]。本研究通過多重PCR試驗發(fā)現(xiàn)，140例IA病人中8例存在AZF微缺失，微缺失率為5.71%(8/140)。該結(jié)果與文獻(xiàn)報道的結(jié)論基本一致，提示AZF微缺失是IA的一個重要因素[20]。為了分析miR-186的表達(dá)與AZF微缺失的關(guān)系。本研究將IA病人分為AZF微缺失組和非AZF微缺失組。實時熒光定量PCR顯示，miR-186在AZF微缺失組和非AZF微缺失組中的表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異，且Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)外周血中miR-186的表達(dá)與AZF微缺失無相關(guān)性。該結(jié)果表明miR-186表達(dá)與AZF微缺失無關(guān)，但考慮到本次AZF微缺失標(biāo)本偏少，故該結(jié)論仍有待進(jìn)一步的驗證。近年來，研究發(fā)現(xiàn)miRNA在多種疾病中具有一定的診斷價值，并可作為新的分子靶點(diǎn)[21]。DUAN等[22]發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的miR-210可作為隱睪診斷的新標(biāo)志物。TSATSANIS等[23]報道外周血中miR-155可作為男性不育診斷的一種潛在生物標(biāo)志物。本研究采用ROC曲線評價外周血中miR-186表達(dá)對IA的診斷價值，發(fā)現(xiàn)miR-186對IA具有較高的診斷價值，ROC曲線下面積為0.84，敏感度為71.86 %，特異度為80.39 %。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-186在IA病人外周血中呈高表達(dá)。外周血中miR-186的表達(dá)與AZF微缺失無相關(guān)性。外周血中高表達(dá)的miR-186對IA具有較高的診斷價值，表明miR-186可能作為一種新的IA診斷標(biāo)志物。