范治云，劉 瑞，趙 巖，肖 英，祝清芬

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院·國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101）

碘克沙醇注射液屬X線對(duì)比劑，目前國內(nèi)外幾個(gè)廠家執(zhí)行的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（YBH03522014，YBH01492018，YBH06512010，JX20190104）均有差異，如揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司、南京正大天晴制藥有限公司、江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司、GE Healthcare Ireland Limited的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）分別為0.05 EU／100 mg、0.672 EU／mL、0.16 EU／mL、0.0025／0.0021 EU／mg（270／320 mg／mL），方法分別為凝膠法、動(dòng)態(tài)顯色法、濁度法、顯色基質(zhì)法，給該品種的監(jiān)督檢驗(yàn)和質(zhì)量控制帶來不便。本研究中擬統(tǒng)一碘克沙醇注射液細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查限值和檢查方法，并分別用凝膠法和動(dòng)態(tài)濁度法進(jìn)行檢查方法適用性研究，為該品種更有效的質(zhì)量控制及國家標(biāo)準(zhǔn)修訂提出建議?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

PKF96－4K－2296型細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)儀（美國ACC公司）。

1.2 試藥

碘克沙醇注射液（廠家A，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)為1908206，規(guī)格為50 mL∶13.5 g，批號(hào)為19112161和19111861，規(guī)格為50 mL∶16 g；廠家B，南京正大天晴制藥有限公司，批號(hào)分別為2002261，1910241，2002271；廠家C，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)分別為191202DJ，190921DJ，191204DJ；廠家D，GE Healthcare Ireland Limited，批號(hào)分別為14749091，14891355，14895222，后3個(gè)廠家的規(guī)格均為100 mL∶32 g）。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET用水，批號(hào)為160006－201805，內(nèi)毒素含量≤0.003 EU／mL），細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)為150601－201784，效價(jià)為每支80 EU），均購自中國食品藥品檢定研究院。鱟試劑（TAL，湛江博康海洋生物有限公司，批號(hào)為1906062。湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)為1904103、規(guī)格為每支0.1 mL、靈敏度為0.06 EU／mL，批號(hào)為2001161、規(guī)格為每支0.1 mL、靈敏度為0.015 EU／mL）。動(dòng)態(tài)比濁法鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)為1908210，可測(cè)內(nèi)毒素范圍為0.01～10 EU／mL，規(guī)格為每支1.25 mL）。

2 方法與結(jié)果［1］

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）確定

L＝K／M，式中，K為人每千克體質(zhì)量每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，M為人用每千克體質(zhì)量每小時(shí)最大劑量。按碘克沙醇注射液藥品說明書最大劑量為150 mL（48 g碘），注射劑的K為5 EU／（kg·h），成人按60 kg計(jì)，計(jì)算M得2.5 mL／（kg·h），即碘800 mg／（kg·h），L值為0.00625 EU／mg?，F(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)是企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)上升到國家標(biāo)準(zhǔn)，而企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)出于內(nèi)控需要和安全考慮而制定的限值更嚴(yán)格。故根據(jù)現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)，并遵照標(biāo)準(zhǔn)從嚴(yán)的原則，將L確定為4個(gè)廠家標(biāo)準(zhǔn)中最嚴(yán)格的0.0005 EU／mg。

2.2 凝膠法干擾試驗(yàn)

2.2.1 樣品干擾預(yù)試驗(yàn)

目前在售鱟試劑靈敏度（λ）為0.5～0.015 EU／mL，參考文獻(xiàn)［2］，本品內(nèi)毒素有干擾情況，4個(gè)廠家各抽取1批，用BET用水將樣品稀釋成120，60，30 mg／mL的系列樣品溶液（對(duì)應(yīng)的鱟試劑λ分別為0.060，0.030，0.015 EU／mL），分別用2個(gè)廠家的鱟試劑考察上述系列濃度稀釋液的干擾情況，每個(gè)濃度做2管，同時(shí)做陰性對(duì)照（NC）和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，結(jié)果4個(gè)廠家的樣品在30 mg／mL質(zhì)量濃度下對(duì)試驗(yàn)均無干擾。詳見表1。

2.2.2 樣品干擾試驗(yàn)

用BET用水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品制成2.0λ，1.0λ，0.5λ，0.25λ，即0.125，0.060，0.030，0.015 EU／mL的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液；并制備含有上述4種濃度細(xì)菌內(nèi)毒素的質(zhì)量濃度為30 mg／mL的樣品稀釋液，分別用2.2.1項(xiàng)下2個(gè)廠家的鱟試劑考察4個(gè)廠家12批樣品在30 mg／mL的干擾情況，每個(gè)濃度平行4管，同時(shí)做陰性對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。結(jié)果反應(yīng)終點(diǎn)幾何平均值為0.5λ～2.0λ，表明樣品在30 mg／mL質(zhì)量濃度下可消除對(duì)試驗(yàn)的干擾因素。詳見表2。

表2 碘克沙醇注射液凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of bacterial endotoxin interference test of Iodixanol Injection by the gel method

2.2.3 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

采用λ為0.015 EU／mL的鱟試劑，對(duì)4個(gè)廠家的12批樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果均小于0.0005 EU／mg。

2.3 動(dòng)態(tài)濁度法干擾試驗(yàn)

2.3.1 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和可靠性分析

用BET用水將細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，使最終細(xì)菌內(nèi)毒素濃度分別為1.25，0.25，0.05，0.01 EU／mL，各取0.1 mL，分別加到預(yù)先加有0.1 mL鱟試劑的反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，以細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)儀檢測(cè)，每個(gè)濃度平行3管，結(jié)果見表3。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為lg T＝－0.31 lg C＋2.89，r＝－0.996（｜r｜應(yīng)大于0.980），平行管之間的RSD均小于10%，NC反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間，故細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。

表3 動(dòng)態(tài)濁度法細(xì)菌內(nèi)毒素平均反應(yīng)時(shí)間（n＝3）Tab.3 The mean reaction time of bacterial endotoxin by KTA（n＝3）

2.3.2 干擾試驗(yàn)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)毒素濃度的設(shè)置，選擇0.25 EU／mL作為靠近曲線中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度（λm），4個(gè)廠家各取1批樣品，用BET用水稀釋成60，30，20，15，10 mg／mL的系列樣品溶液（A液），同時(shí)制備含上述樣品濃度并含內(nèi)毒素濃度為λm（0.25 EU／mL）的溶液（B液），分別取上述各溶液0.1 mL，加到預(yù)先加有0.1 mL鱟試劑的反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻并測(cè)定，每個(gè)濃度平行2管。測(cè)定結(jié)束后，儀器按標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程自動(dòng)計(jì)算出樣品溶液和含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素λm的樣品溶液的內(nèi)毒素含量，以及該試驗(yàn)條件下的回收率（R）。結(jié)果表明，20 mg／mL質(zhì)量濃度及以下回收率在50%～200%。詳見表4。

表4 動(dòng)態(tài)濁度法干擾試驗(yàn)結(jié)果（n＝2）Tab.4 Results of the interference test by KTA（n＝2）

2.3.3 動(dòng)態(tài)濁度法樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

取4個(gè)廠家共12批樣品，同法制備20 mg／mL濃度的稀釋液（A液）和含相同樣品濃度及標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素λm（0.25 EU／mL）的溶液（B液），每個(gè)濃度平行2管，測(cè)定［2］。結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為lg T＝－0.30lg C＋2.90（r＝－0.995），B液的回收率均在50%～200%，樣品結(jié)果均符合規(guī)定。詳見表5。

表5 動(dòng)態(tài)濁度法樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果（n＝2）Tab.5 Results of the bacterial endotoxin test of samples by KTA（n＝2）

3 討論

目前，碘克沙醇注射液生產(chǎn)廠家執(zhí)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)各不相同。本研究結(jié)果表明，采用凝膠法和動(dòng)態(tài)濁度法對(duì)4個(gè)廠家的樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗(yàn)，并按限值0.0005 EU／mg對(duì)12批樣品分別進(jìn)行檢查，結(jié)果均符合藥典規(guī)定。說明本品可采用統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量控制。

本研究結(jié)果顯示，不干擾濃度，即最小有效稀釋質(zhì)量濃度凝膠法為30 mg／mL，動(dòng)態(tài)濁度法為20 mg／mL。結(jié)果的細(xì)微差異可能與2種方法的觀察判斷標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)，前者以倒轉(zhuǎn)180°管內(nèi)形成凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；后者是檢測(cè)反應(yīng)混合物的濁度達(dá)到某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需反應(yīng)時(shí)間。此種現(xiàn)象常見于樣品有干擾的情況［3－6］。凝膠法操作簡單，觀察結(jié)果直觀，對(duì)儀器要求度低；動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)靈敏度高，需要特定儀器和更高靈敏度的鱟試劑［7－11］。2種方法均適用于碘克沙醇注射液細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查。

綜上所述，2種方法均適用于碘克沙醇注射液細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查。但凝膠法必須用λ為0.015 EU／mL的鱟試劑進(jìn)行檢查，故建議該品種細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查限值設(shè)為0.0005 EU／mg，統(tǒng)一采用動(dòng)態(tài)濁度法。