馮 媛，鄭玉光，劉 巖，張清清，2△

（1.河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北 石家莊 050200； 2.河北省中藥炮制技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050200；3.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北 石家莊 050200；4.天津天士力中藥資源科技發(fā)展有限公司，天津 300000）

關(guān)黃柏為蕓香科植物黃檗Phellodendron amurenseRupr.的干燥樹(shù)皮，有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡功效，主要用于治療黃疸瀉痢、腸痔、口瘡、熱淋澀痛、遺精、目熱赤痛等病癥［1］。其活性成分主要包括生物堿、內(nèi)酯、酚酸、苯丙素等［2－3］，具有抗炎、抗菌、抗癌、抗氧化、降血糖、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等藥理活性［4－6］。關(guān)黃柏中以生物堿類成分最具代表性，結(jié)構(gòu)類型多樣，且具有較好的藥理活性，一直以來(lái)備受關(guān)注［7］。相較于正交試驗(yàn)法，響應(yīng)面法試驗(yàn)周期更短，求得的回歸方程準(zhǔn)確度更高，并可研究幾種因素間的交互作用［8－12］。本研究中以小檗堿、巴馬汀等5個(gè)代表性生物堿成分的總含量為指標(biāo)，基于響應(yīng)面法優(yōu)化關(guān)黃柏藥材中生物堿的提取工藝，為關(guān)黃柏藥材的質(zhì)量控制及開(kāi)發(fā)利用提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；QUINTIX125D－1CN型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，精度為十萬(wàn)分之一）；Eppendorf Centrifuge 5418型離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf AG公司）；Milli－Q型超純水儀（美國(guó)Milipore公司）；KQ－300DE型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市舒美超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

關(guān)黃柏飲片（河北省安國(guó)市祁澳中藥飲片有限公司、批號(hào)為1908917171，河北省安國(guó)市深豪藥業(yè)有限公司、批號(hào)為190602151，河北省安國(guó)市金康迪中藥材飲片有限公司、批號(hào)為1804001C），經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院鄭玉光教授鑒定為正品；木蘭花堿對(duì)照品（批號(hào)為19082004，含量為99.84%），鹽酸藥根堿對(duì)照品（批號(hào)為19072609，含量為98.62%），小檗紅堿對(duì)照品（批號(hào)為19050701，含量為98.71%），小檗堿對(duì)照品（批號(hào)為17110105，含量為98.95%），巴馬汀對(duì)照品（批號(hào)為18022604，含量為99.01%），均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；乙腈為色譜純，甲醇為色譜純和分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 生物堿成分含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）－0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min時(shí)10%A→12%A，20～27 min時(shí)12%A→22%A，27～36 min時(shí)22%A→26%A，36～65 min時(shí)26%A→40%A，65～68 min時(shí)40%A→75%A，68～70 min時(shí)75%A→10%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；流速：1 mL／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.1.2 溶液制備

取木蘭花堿、鹽酸藥根堿、小檗紅堿、小檗堿、巴馬汀對(duì)照品各適量，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，加入70%甲醇定容，制成單標(biāo)母液，分別稀釋，配制成分別含木蘭花堿0.0049 mg／mL、鹽酸藥根堿0.0006 mg／mL、小檗紅堿0.0002 mg／mL、巴馬汀0.0062 mg／mL、小檗堿0.0187 mg／mL的混合對(duì)照品溶液。取關(guān)黃柏藥材粉末0.5 g，精密稱定，浸泡30 min后置100 mL具塞三角瓶中，加入30 mL甲醇，25℃下超聲（功率250 W，頻率40 kHz）提取40 min，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，混勻，取續(xù)濾液，13000 r／min離心5 min，取上清液，置5 mL EP管中，稀釋10倍，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取上述混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各適量，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見(jiàn)圖1。結(jié)果，理論板數(shù)按木蘭花堿峰計(jì)算應(yīng)不低于3000；分離度均大于1.5，基線分離良好。

圖1 高效液相色譜圖1.magnoflorine 2.jatrorrhizine hydrochloride 3.berberrubine 4.palmatine 5.berberine A.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取2.1.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1，3，5，10，15，20μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以各對(duì)照品質(zhì)量濃度（mg／mL，X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程和線性范圍，詳見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n＝6）Tab.1 Results of the linear relation test（n＝6）

精密度試驗(yàn)：1）日內(nèi)精密度，精密量取混合對(duì)照品溶液適量，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果木蘭花堿、鹽酸藥根堿、小檗紅堿、巴馬汀、小檗堿的RSD分別為0.15%，0.51%，0.46%，0.13%，0.17%（n＝6），表明儀器的日內(nèi)精密度良好。2）日間精密度，精密量取混合對(duì)照品溶液適量，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定3 d，每日1次，記錄峰面積。結(jié)果木蘭花堿、鹽酸藥根堿、小檗紅堿、巴馬汀、小檗堿的RSD分別為0.13%，1.51%，0.11%，1.42%，1.87%（n＝3），表明儀器的日間精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批關(guān)黃柏藥材粉末，精密稱定，按2.1.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積及計(jì)算含量。結(jié)果木蘭花堿、鹽酸藥根堿、小檗紅堿、巴馬汀、小檗堿含量的RSD分別為0.78%，1.54%，1.15%，1.87%，1.83%（n＝6），表明該方法重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一關(guān)黃柏供試品溶液，分別在室溫下放置0，3，5，8，13，20，24 h時(shí)按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果木蘭花堿、鹽酸藥根堿、小檗紅堿、巴馬汀、小檗堿的RSD分別為1.77%，1.94%，1.78%，1.72%，1.12%（n＝7），表明供試品溶液室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的關(guān)黃柏藥材粉末共6份，各0.25 g，精密稱定，分別加入相應(yīng)對(duì)照品溶液按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，木蘭花堿、鹽酸藥根堿、小檗紅堿、巴馬汀、小檗堿的加樣回收率分別為102.33%，104.53%，102.76%，100.34%，102.62%（n＝6），RSD分別為1.10%，0.27%，1.10%，0.78%，0.99%（n＝6）。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 甲醇體積分?jǐn)?shù)

取關(guān)黃柏藥材樣品粉末0.5 g，精密稱定，平行6份，液料比為60 mL／g，分別加入體積分?jǐn)?shù)為10%，30%，50%，70%，90%、100%的甲醇，25℃超聲提取40 min，13000 r／min離心5 min，取上清液，置5 mL EP管中，稀釋10倍，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，進(jìn)行液相分析，得5個(gè)生物堿總含量，其含量與甲醇體積分?jǐn)?shù)的變化關(guān)系見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)，生物堿總含量隨甲醇體積分?jǐn)?shù)的升高而增加，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，生物堿總含量最大。故選取甲醇體積分?jǐn)?shù)50%，70%，90%3個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.2 液料比

取關(guān)黃柏藥材樣品粉末0.5 g，精密稱定，平行處理6份，甲醇體積分?jǐn)?shù)為70%，在不同液料比（20，40，60，80，100，120 mL／g）下，25℃超聲提取40 min，稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，13000 r／min離心5 min，取上清液，置5 mL EP管中，稀釋10倍，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液進(jìn)行液相分析，得5個(gè)生物堿的總含量，其含量與液料比的變化關(guān)系見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)，隨著液料比的增加，生物堿總含量先增加后減少，液料比在30 mL／g時(shí)，生物堿的總含量達(dá)到最大。故選取液料比40，60，80 mL／g 3個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.3 提取時(shí)間的影響

取關(guān)藥材樣品粉末0.5 g，精密稱定，平行處理5份，液料比為60 mL／g，加入70%甲醇，分別超聲處理15 min、30 min、40 min、50 min、1 h（25℃）。生物堿總含量與料液比的變化關(guān)系見(jiàn)圖2。可見(jiàn)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，生物堿總含量先增加后減少，當(dāng)提取時(shí)間為40 min時(shí)，生物堿總含量最大。故選取提取時(shí)間30，40，50 min 3個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 單因素試驗(yàn)結(jié)果A.Methanol volume fraction B.Liquid－material ratio C.Extration timeFig.2 Results of the single factor test

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

以5個(gè)生物堿總含量（Y）為響應(yīng)值，提取溶劑體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲時(shí)間（B）、液料比（C）3個(gè)因素為自變量，且每個(gè)自變量選取低、中、高3個(gè)水平，對(duì)關(guān)黃柏生物堿超聲提取工藝進(jìn)行三因素三水平研究，使用Design－Expert 8.0.6軟件，采用Box－Behnken原理進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)，因素水平見(jiàn)表2，Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 因素水平表Tab.2 The factor levels

2.3.2 方差分析與顯著性檢驗(yàn)

運(yùn)用Design－Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合分析，得二次多項(xiàng)回歸方程Y＝3.03－0.041A＋0.024 B＋0.015 C－2.5×10－3AB＋1×10－2AC＋0.05 BC－0.22 A2－0.10 B2－0.13 C2（R2＝0.8789），說(shuō)明該模型擬合度較好，試驗(yàn)誤差較?。?3］。進(jìn)一步對(duì)方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，模型P＝0.0163＜0.05，說(shuō)明本回歸模型自變量與因變量的回歸關(guān)系顯著，失擬項(xiàng)P＝0.46＞0.05，說(shuō)明二次多項(xiàng)回歸方程擬合程度良好，本試驗(yàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［14］。各因素對(duì)關(guān)黃柏生物堿提取率的影響大小為A＞B＞C，二次項(xiàng)A2，B2，C2對(duì)響應(yīng)值的影響顯著，說(shuō)明各因素與響應(yīng)值之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。交互項(xiàng)對(duì)生物堿總含量影響的強(qiáng)弱為BC＞AC＞AB，說(shuō)明超聲時(shí)間和液料比對(duì)響應(yīng)值的影響較明顯。

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 Results of ANOVA

2.3.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)響應(yīng)面圖（見(jiàn)圖3）評(píng)價(jià)試驗(yàn)因素之間的交互強(qiáng)度，優(yōu)選出最佳提取工藝。由圖3可知，因素A的曲面較陡峭，說(shuō)明甲醇體積分?jǐn)?shù)相對(duì)于其他2個(gè)因素對(duì)生物堿成分提取效率的影響較大。BC交互作用較強(qiáng)，說(shuō)明提取時(shí)間與液料比的交互作用對(duì)生物堿總含量的影響顯著，AB和AC交互作用較弱，說(shuō)明甲醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間、液料比與提取時(shí)間的交互作用對(duì)生物堿總含量的影響較小。

圖3 各因素與生物堿總提取量的響應(yīng)面圖A.Ultrasonic time and methanol volume fraction B.Liquid－material ratio and methanol volume fraction C.Liquid－material ratio and ultrasonic timeFig.3 Response surface diagram of each factor and total extraction amount of alkaloids

2.4 最優(yōu)工藝與驗(yàn)證試驗(yàn)

優(yōu)選出的最佳提取工藝為：提取時(shí)間為41.35 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)為68.17%，液料比為61.64 mL／g。結(jié)合實(shí)際，同時(shí)為方便操作，最終確定最優(yōu)提取工藝為取0.5 g的關(guān)黃柏藥材樣品粉末，加入68%甲醇，超聲提取41 min，液料比為62 mL／g。分別選取3批關(guān)黃柏藥材飲片，在上述最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果生物堿成分總含量分別為3.030，2.979，3.007 mg／g，平均3.005 mg／g（RSD＝0.85%），與模型預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.59%，表明建立的模擬回歸方程擬合度較好，優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定、可靠。

3 討論

關(guān)黃柏藥材中生物堿提取方法主要包括傳統(tǒng)的水煎煮法、酸水法、石灰水法、乙醇回流法等［15－16］，提取時(shí)間較長(zhǎng)、能耗大，一些熱敏性的有效成分易被破壞，且提取效率較低。相對(duì)于傳統(tǒng)的提取方法，超聲提取法、酶輔助提取法可彌補(bǔ)上述缺點(diǎn)［17］，但提取成本較高。綜合考慮，本研究中采取超聲法提取關(guān)黃柏藥材中的生物堿成分。

前期通過(guò)預(yù)試驗(yàn)對(duì)不同超聲次數(shù)（1，2，3次）、不同浸泡時(shí)間（15 min、30 min、1 h、2 h、4h、12 h）及不同種類提取溶劑［包括甲醇、鹽酸－甲醇（1∶100，V／V）、乙酸－甲醇（1∶100，V／V）、鹽酸－乙醇（1∶100，V／V）、乙醇］進(jìn)行考察，結(jié)果表明，生物堿總含量在超聲1次、提取溶劑為甲醇時(shí)最高。浸泡時(shí)間為4 h時(shí)生物堿總含量最高，其次為浸泡30 min，為提高提取效率，綜合考慮，最終選擇甲醇為提取溶劑，浸泡30 min，超聲1次。此外，巴馬汀和小檗堿均屬原小檗堿型生物堿，化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，高效液相色譜圖中保留時(shí)間十分接近，且巴馬汀在關(guān)黃柏和川黃柏藥材中的含量差異十分顯著。

2020年版《中國(guó)藥典》以鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀的含量作為關(guān)黃柏藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)［1］，在目前已有的關(guān)黃柏最佳提取工藝研究中，多數(shù)僅以小檗堿成分作為考察指標(biāo)［17］。為更全面、準(zhǔn)確地評(píng)判關(guān)黃柏藥材的質(zhì)量，本試驗(yàn)中選取了含量較高、藥理作用研究較充分的木蘭花堿、鹽酸藥根堿、小檗紅堿、巴馬汀和小檗堿的總含量，作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。該方法相較于目前已有的僅以小檗堿作為對(duì)照品考察關(guān)黃柏提取工藝的研究更嚴(yán)謹(jǐn)、科學(xué)。目前有關(guān)關(guān)黃柏藥材最佳提取工藝的研究中，大多都采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法。而響應(yīng)面法可連續(xù)對(duì)試驗(yàn)各個(gè)水平進(jìn)行分析，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，找出與原預(yù)設(shè)水平相比最優(yōu)的組合條件［18－19］，與正交試驗(yàn)相比，試驗(yàn)結(jié)果的精度和真實(shí)度更高、直觀性更強(qiáng)［20－21］。但也有其局限性，如響應(yīng)面試驗(yàn)前的單因素最佳水平選取錯(cuò)誤，會(huì)使響應(yīng)面試驗(yàn)無(wú)法得到預(yù)期結(jié)果［22］。本試驗(yàn)中通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)合Box－Behnken響應(yīng)面法，優(yōu)化得到關(guān)黃柏藥材中生物堿的最佳提取工藝，操作簡(jiǎn)便、效率高、穩(wěn)定可靠。