李 蕾，劉小元，張 凱，韓祥禎，周琦琪，何惠宇

頜面部較大骨缺損是目前世界上較為普遍的臨床問題之一，大部分頜面部骨缺損修復在臨床上仍然需要骨移植或使用骨替代材料[1-2]。支架材料除了具有促進成骨能力外，還應有一定的降解性能，因此可降解支架是目前骨組織工程的研究熱點。絲素蛋白相關支架在骨缺損處的降解除了與機體的免疫有關外，還與支架所處骨缺損處的骨改建過程密不可分，骨再生過程中骨的形成和吸收保持一定的平衡，這一過程較為復雜，由多種通路、多種因子參與。巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)有利于破骨細胞的運動和擴散。骨吸收過程中鈣調磷酸酶/活化T細胞核因子(calcineurin/nuclear factor of activated T cells，CN/NFAT)通路也發(fā)揮重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)活化T細胞核因子1(nuclear factor of activated T cells1, NFATc1)在破骨細胞形成過程中有一定的調節(jié)作用[3]。而在骨改建的過程中，除了NFATc1，白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、M-CSF等因子也與破骨細胞相關。因此我們將膜片包裹的支架植入動物體內，觀察支架在體內以及其周圍組織的變化，并檢測與支架降解相關的因子，觀察兩種不同支架之間降解相關因子表達的不同，比較兩種支架的降解性能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

10 kg左右的4～6月齡阿勒泰大尾羊2只、(35.52±1.20)kg的12月齡阿勒泰大尾羊12只，雌雄不限。在新疆醫(yī)科大學動物中心(編號：IACUC20170706-04)圈養(yǎng)。實驗過程中參照相關動物倫理學標準的條例對實驗動物進行處置。

1.2 實驗材料

20 nm 羥基磷灰石(南京埃普瑞公司，中國)；碳酸鈉(分析純)、溴化鋰(分析純)、蠶繭、電子天平(Sartorius BSA124S)(新疆醫(yī)科第一附屬醫(yī)院提供)；三維打印成型機(新疆大學)，超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)；α-MEM培養(yǎng)液(Hyclone，美國)；速眠新、新速醒、戊巴比妥(天津化學試劑，中國)；舒泰?50(Virbac S.A，法國)；熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX96，美國)；SF/PVA/n-HA支架、PVA/n-HA支架(新疆大學、新疆醫(yī)科大學)。

1.3 實驗方法

1.3.1 3D打印 SF/PVA/n-HA和PVA/n-HA支架

參照本課題組前期試驗方法使用3D打印技術分別打印絲素蛋白/聚乙烯醇/納米羥基磷灰石(SF/PVA/n-HA)支架與聚乙烯醇/納米羥基磷灰石(PVA/n-HA)支架[4]。

1.3.2 羊骨髓間充質干細胞膜片的培養(yǎng) 4～6月齡阿勒泰大尾羊固定四肢后，肌內注射舒泰(10 mg/kg)和新速眠(0.1～0.2 mL/kg)麻醉。在髂骨平臺區(qū)抽取羊骨髓(圖1A)4～5 mL后轉至超凈工作臺過濾后加入5～6 mL培養(yǎng)基，轉入細胞瓶培養(yǎng)(圖1B)。待二代細胞量達到80%～90%時將細胞接種至60 mm2的細胞培養(yǎng)皿中。等皿底細胞量達到100%后，采用連續(xù)誘導法構建骨髓間充質干細胞(bore marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)膜片(圖1C)。

A：抽取羊BMSCs；B：羊BMSCs培養(yǎng)；C：羊 BMSCs膜片圖1 羊BMSCs膜片的培養(yǎng)Fig.1 Cultivation of sheep BMSCs patch

1.3.3 支架植入 用膜片分別包裹SF/PVA/n-HA支架和PVA/n-HA支架備用，然后選12月齡阿勒泰大尾羊制備下頜骨缺損模型。分別植入對應支架，實驗組為SF/PVA/n-HA支架復合細胞膜片，對照組為PVA/n-HA支架復合細胞膜片，空白組為明膠海綿復合細胞膜片(膜片組)。術前3%戊巴比妥鈉0.005～0.020 mg/kg，靜脈推注麻醉，口內外常規(guī)消毒。用牙科慢速手機制備骨缺損，同時生理鹽水間斷沖洗降溫。骨缺損大小為20 mm×5 mm×3 mm(圖2)[5-6]。最后植入細胞膜片包裹的支架，嚴密縫合。術后連續(xù)3 d肌內注射慶大霉素防止繼發(fā)感染。

A：制備骨缺損；B：植入細胞膜片復合SF/PVA/n-HA支架；C：植入細胞膜片復合PVA/n-HA支架圖2 下頜骨植入支架Fig.2 Stents implanted in mandible

分別于術后1、2、3個月處死相應的實驗羊，取羊下頜骨，在冰上去除下頜骨實驗部位周圍軟組織，最后將處理好的標本標記清楚后轉入-80 ℃冰箱冷凍保存。

1.4 支架植入后指標檢測

大體觀察：在處死實驗動物之前定期觀察羊的進食情況，早期創(chuàng)口處縫線是否脫落，支架在植入后是否脫落，創(chuàng)口處及植入部位骨組織愈合情況。

錐形束CT檢測：取樣本進行錐形束CT檢測，檢測條件為將保鮮膜包裹的樣本置于掃描臺上進行三維掃描，然后選取頰舌向最寬處進行分析。觀測3D打印組織工程骨在體內骨密度變化情況，比較體內降解支架回植前后降解情況。

HE染色分析：造模成功后術后1、2、3個月每月取對應4只實驗羊處死，分別取邊緣區(qū)、中央區(qū)的標本，先用40 g/L多聚甲醛固定液沖洗，然后將標本置于10%甲醛固定液中固定24 h。用15% EDTA脫鈣液脫鈣，待用大頭針能輕松刺進骨組織時說明脫鈣程度達標，然后將標本包埋切片，做HE染色。

Trizol法提取羊骨總RNA，用紫外分光光度計檢測總的RNA濃度和純度，若其濃度和純度均達標才能逆轉錄RNA為cDNA，最后用PCR試劑盒SYBR Green PCR Kit(500)檢測相關指標：IL-1、M-CSF、IL-6、NFATc1的表達量。引物由上海生工公司設計，具體引物序列見表1。相同基因重復測量3次取平均值。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence for RT-PCR

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 大體觀察

植入手術結束后，所有實驗羊均存活。術后3 d，實驗羊因切口位于口內，進食困難，盡量流食喂養(yǎng)，4 d后進食恢復正常，切口愈合良好，口內縫線部分脫落。術后1、2、3個月分別處死后，取出下頜骨可見支架植入部位肌肉黏膜覆蓋完全，無明顯瘢痕。剝離植入部位表面肌肉以及黏膜后，可見SF/PVA/n-HA支架復合膜片組植入部位在術后1～2個月軟組織逐漸長入支架，3個月時支架已完全被骨膜包裹，肉眼無法分辨，觸摸質地較硬。而PVA/n-HA支架復合膜片組植入部位在術后1～2個月軟組織部分長入，但長入程度明顯低于SF/PVA/n-HA支架。3個月時PVA/n-HA支架植入部位還可看見部分支架，觸摸時質地略軟，可見支架與周圍骨邊界明顯的分界線(圖3)。

2.2 組織學觀察

術后1個月，SF/PVA/n-HA支架復合膜片組與PVA/n-HA支架復合細胞膜片組可見疏松網狀結締組織包裹支架，散在分布成纖維細胞及炎癥細胞，支架材料開始降解，SF/PVA/n-HA支架復合膜片組支架材料降解更明顯；而膜片組可見大量疏松網狀結締組織，少量炎癥細胞，新生血管幾乎沒有。術后2個月，支架進一步降解，降解支架周圍可見纖維結締組織包繞，SF/PVA/n-HA支架復合膜片組及PVA/n-HA支架復合膜片組均可見炎癥細胞及纖維結締組織；膜片組與術后1個月相比無明顯變化，可見大量纖維結締組織，炎癥細胞少見。術后3個月，SF/PVA/n-HA支架復合膜片組支架材料幾乎完全降解，被新的纖維組織、骨組織取代，也可發(fā)現(xiàn)少許巨噬細胞，炎癥細胞較其他兩組最少；PVA/n-HA支架復合膜片組仍可見支架殘留物，膜片組可見少量新生血管，炎癥細胞減少(圖4)。

A：SF/PVA/n-HA支架復合膜片組術后3個月局部組織大體觀察；B:PVA/n-HA支架復合膜片組術后2個月局部組織大體觀察；箭頭指示植入支架位置圖3 大體觀察Fig.3 General observation

2.3 降解相關因子mRNA表達水平檢測

同一時間不同材料比較，SF/PVA/n-HA支架復合膜片組、PVA/n-HA支架復合膜片組分別與膜片組相比較P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義，SF/PVA/n-HA支架復合膜片組與PVA/n-HA支架復合膜片組相比，IL-1、IL-6、MCS-F、NFATc1四種因子表達趨勢相近(圖5)。在術后1、2個月，SF/PVA/n-HA支架復合膜片組四種因子的mRNA表達量均高于PVA/n-HA支架復合膜片組；術后3個月時，四種因子mRNA表達量SF/PVA/n-HA支架復合膜片組均低于PVA/n-HA支架組(P<0.05)。

黑色箭頭指向剩余支架材料區(qū)，綠色箭頭指向炎癥細胞區(qū)，藍色箭頭指向骨陷窩區(qū)域，白色箭頭指向巨噬細胞圖4 植入不同時間點HE染色觀察( ×10)Fig.4 Observation of HE staining after implanting at different time( ×10)

3 討 論

骨組織工程中支架結合細胞、生長因子植入骨缺損處，為大面積的骨缺損提供了可行的思路。近幾年人們將研究方向集中在支架的降解性能上，然而支架植入后其降解性能受支架自身的理化性能、植入部位的體內環(huán)境等影響較為復雜，具備降解性又能與體內環(huán)境相適應的支架是骨組織工程骨的必備條件。因此，通過動物實驗來評價支架降解率受到廣泛關注。

骨髓間充質干細胞可以提高材料的生物活性，并為骨形成提供合適的微環(huán)境[7]。支架上種子細胞密度是提高支架移植治療效果的重要因素之一，而與單細胞移植相比，移植層狀細胞膜片(cell sheet)可以促進相應功能的恢復和骨組織再生。細胞膜片技術(cell sheet technology， CST)也稱細胞片層技術，是種子細胞利用自身的細胞外基質(ECM)形成的數(shù)層致密細胞聚合體，也是目前骨組織工程的常用方法之一[8]。因此本實驗前期選用4～6月齡阿勒泰大尾羊培養(yǎng)羊BMSC膜片，以確保骨髓間充質干細胞的活性。用其包裹支架后再將支架植入12月齡阿勒泰大尾羊下頜骨內，12月齡的阿勒泰大尾羊已經達到成年狀態(tài)，生長發(fā)育穩(wěn)定，支架植入后骨改建相對平穩(wěn)。

**：P<0.05圖5 術后不同時期各組相關細胞因子表達的比較Fig.5 Comparison of the expression of related cytokine in each group during different periods after surgery

絲素蛋白的降解與流變學和力學性能有關[9]。將SF/PVA/n-HA支架植入阿勒泰大尾羊下頜骨后，羊在咀嚼食物時支架受力，力通過黏膜傳遞到支架，從而加速支架降解；植入部位位于下頜骨內，該部位血運豐富，有利于支架降解。

支架植入后會激活機體免疫系統(tǒng)，在后續(xù)的止血、組織愈合過程里，固有免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)相繼發(fā)揮作用[10]。因此，支架材料良好的生物相容性能避免不良的炎癥反應，便于支架成功植入。組織學觀察中，兩種支架均能引起組織異物反應，但SF/PVA/n-HA支架植入區(qū)術后1、2、3個月HE染色觀察發(fā)現(xiàn)炎癥逐漸減輕，表明SF/PVA/n-HA支架植入后異物反應隨著支架的降解，炎癥反應隨之減輕。同時SF/PVA/n-HA支架周圍新生血管較PVA/n-HA支架多，表明絲素蛋白可促進血管形成，這與Zhang等[11]研究相符。支架材料降解時，細胞作用不可忽視，巨噬細胞是其中重要的一員，它的吞噬作用和其釋放的細胞因子可以加速材料降解的速率[12]。SF/PVA/n-HA支架組織學觀察中發(fā)現(xiàn)支架降解過程中，有巨噬細胞的出現(xiàn)，我們可以大膽猜測巨噬細胞的出現(xiàn)與SF/PVA/n-HA支架的降解有密不可分的關系。

不同支架植入體內后，機體的固有免疫系統(tǒng)、適應性免疫系統(tǒng)相繼發(fā)揮作用[13-14]。中性粒細胞在此過程中清除死亡細胞并且分泌趨化因子招募巨噬細胞。有研究者發(fā)現(xiàn)絲素在降解過程與巨噬細胞密切相關[15]。在此過程中，巨噬細胞也會分泌IL-1、IL-6等促炎細胞因子，招募其他炎癥細胞和免疫細胞。除此之外，IL-6也可促進骨吸收，對破骨細胞的形成也有一定的促進作用[16]。而巨噬細胞產生的TNF-α和IL-6細胞因子除了抑制成骨細胞合成堿性磷酸酶，還能抑制細胞外骨基質的分泌和礦化[17]。因此在此次實驗中，我們選擇IL-1、IL-6這兩種因子作為支架植入之后評價支架降解的指標。從RT-PCR結果可以看出，在支架植入術后1、2、3個月內，SF/PVA/n-HA支架復合膜片組(有絲素支架組)IL-1、IL-6的相對表達量均高于PVA/n-HA支架復合膜片組(無絲素支架組)(P<0.05)，說明在前兩個月，有絲素支架在植入后，巨噬細胞發(fā)揮作用，促進支架降解，與此同時，分泌IL-1、IL-6細胞因子，因此IL-1、IL-6的相對表達量高于無絲素組，在術后3個月時，有絲素支架組支架的降解接近尾聲，巨噬細胞量減少，IL-1、IL-6相對表達量低于無絲素支架組(P<0.05)。而且有研究發(fā)現(xiàn)，在降解過程中產生SF顆粒在先天和適應性免疫系統(tǒng)的影響具有一定的抗腫瘤活性[18]，這可能是3個月末IL-1和IL-6表達降低的另一個可能原因。

骨再生與骨吸收是相互平衡的，支架一方面需要為成骨細胞的發(fā)育創(chuàng)造最佳條件，另一方面也需要確保破骨細胞能夠發(fā)揮其主要作用，為骨形成提供相應的空間。因此，研究破骨細胞相關因子在新型生物材料上的分泌情況和功能具有重要意義。巨噬細胞、成纖維細胞、成骨細胞均可產生M-CSF[19-20]。有研究發(fā)現(xiàn)M-CSF是促進破骨細胞進一步成熟化的關鍵因子[21]。NFATc1在骨吸收過程中調節(jié)與破骨細胞相關的基因表達。破骨細胞形成早期，RANKL與破骨細胞前體細胞上的RANK結合，將細胞內腫瘤壞死因子受體相關因子6 (tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)招募到RANK的細胞質結構域，從而刺激多種下游信號通路，包括核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB,NF-κB)、絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和核活化T細胞因子(NFAT)通路[22]。NFATc1與破骨細胞的分化增殖密切相關[23]。在PCR結果中我們發(fā)現(xiàn)前兩個月，有絲素支架組其M-CSF、NFATc1的mRNA相對表達量均高于無絲素支架組(P<0.05)，說明有絲素支架組的破骨細胞活動活躍，這與組織學觀察結果一致。在術后3個月，有絲素支架組M-CSF、NFATc1的mRNA相對表達量明顯降低，且低于無絲素支架組(P<0.05)，說明此時破骨細胞活躍度降低，骨吸收減弱，骨改建已經趨近尾聲。而無絲素支架組M-CSF、NFATc1的mRNA相對表達量高于有絲素組，說明骨吸收在術后3個月還在繼續(xù)。

4 結 論

具有良好的孔隙率和力學性能的SF/PVA/n-HA支架，植入體內后生物相容性好，引起的炎癥反應較少，且在體內環(huán)境的作用下支架逐漸降解，在支架降解過程中新骨形成。因此SF/PVA/n-HA支架可作為骨組織工程中的一種新型支架材料。在體內實驗過程中，支架受到炎癥反應和骨改建過程的雙重調控，發(fā)現(xiàn)SF/PVA/n-HA支架降解過程中M-CSF、IL-6等因子的相對表達量發(fā)生了變化。參加免疫反應的因子也參加了骨改建過程，這些因子之間的關系以及它們之間是否相互影響還需進一步研究。