邱澤陽 季爽，2 陳麗紅，2

(1.大連醫(yī)科大學，遼寧 大連 116044； 2.大連醫(yī)科大學醫(yī)學科學研究院，遼寧 大連 116044)

心血管疾病是引起全球死亡和致殘的主要原因之一。越來越多的臨床和實驗證據(jù)表明生物鐘對維持正常的心臟功能至關(guān)重要。正常的白天與黑夜各12 h的晝夜節(jié)律紊亂可嚴重影響心血管系統(tǒng)的生理功能，其中最明顯的表現(xiàn)是血壓和心率的改變。同時，許多心血管疾病或事件(包括心肌梗死、心律失常、腦卒中、心力衰竭及心臟性猝死)的發(fā)生有明顯的晝夜節(jié)律特征，其發(fā)生率表現(xiàn)為每日清晨最高[1]。在心臟疾病中，心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)損傷的研究最為深入，研究認為IR損傷會引起大量心肌細胞死亡，是導(dǎo)致心室重塑和心功能不全的主要原因[2]。目前發(fā)現(xiàn)心肌細胞死亡的方式有多種，包括凋亡、壞死、自噬、鐵死亡和焦亡等[3]。近年，許多證據(jù)表明生物鐘可調(diào)控50%～80%的蛋白質(zhì)編碼基因的表達，其中包括許多調(diào)控細胞分裂、代謝和存活的關(guān)鍵基因，提示晝夜節(jié)律可能是參與調(diào)控細胞穩(wěn)態(tài)和生存的重要機制[4-5]?，F(xiàn)對晝夜節(jié)律生物鐘在心肌細胞死亡中的作用及分子機制研究進展做一綜述。

1 晝夜節(jié)律的調(diào)控

生物鐘是調(diào)節(jié)生物體行為和活動等基本功能的自主振蕩節(jié)律，通常表現(xiàn)為近似24 h為周期的晝夜節(jié)律。應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學分析小鼠12個組織器官(包括心臟)的基因表達情況，發(fā)現(xiàn)在所有編碼蛋白質(zhì)的基因中，有43%的基因在轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)晝夜節(jié)律，且大部分表現(xiàn)為器官獨有的節(jié)律特征。在哺乳動物中，生物鐘由中樞生物鐘和外周生物鐘組成。中樞生物鐘位于下丘腦前部視交叉上核的神經(jīng)元，是生物節(jié)律的控制中心；而外周生物鐘則位于外周器官和組織，可獨立發(fā)揮調(diào)控作用[4，6]。研究表明生物體的晝夜節(jié)律是由一系列核心生物鐘基因和鐘控基因組成的正反饋和負反饋回路調(diào)節(jié)的結(jié)果(圖1)。核心生物鐘基因主要包括Clock、Bmal1(也稱為Arntl)、Cry1/2、Per1/2、Rev-erb和Ror。其中Bmal1和Clock為正性調(diào)控基因，而Cry 和Per為負性調(diào)控基因。鐘控基因主要由Dbp(D-box binding protein)、Hlf(hepatic leukemia factor)、Tef(thyrotroph embryonic factor)及Dec1(Stra13或Sharp2)等組成[4，6]。首先，在細胞核內(nèi)BMAL1與CLOCK蛋白形成一個異二聚體，通過結(jié)合到Per和Cry啟動子的順式作用元件(E-box和D-box等)來激活其轉(zhuǎn)錄表達，然后其蛋白產(chǎn)物在細胞漿中形成異二聚體，并移位到胞核內(nèi)抑制BMAL1/CLOCK異二聚體對下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，形成負反饋調(diào)節(jié)環(huán)路。隨著PER和CRY異二聚體蛋白水平的降低，不能再抑制CLOCK/BMAL1的轉(zhuǎn)錄活性后，啟動新的轉(zhuǎn)錄-翻譯周期，進而調(diào)節(jié)生物體24 h的晝夜節(jié)律。BMAL1/CLOCK異二聚體也調(diào)節(jié)孤兒核受體基因Rev-erbα/β和Rorα/β的轉(zhuǎn)錄。翻譯后的REV-ERB與ROR蛋白參與競爭位于BMAL1啟動子區(qū)域結(jié)合位點的ROR應(yīng)答元件(ROR response element，RRE)。這種競爭結(jié)合根據(jù)其結(jié)合的蛋白質(zhì)不同而導(dǎo)致Bmal1轉(zhuǎn)錄的激活或抑制。ROR蛋白可激活Bmal1的轉(zhuǎn)錄，而REV-ERB則抑制Bmal1的轉(zhuǎn)錄，形成晝夜節(jié)律的另一個轉(zhuǎn)錄反饋調(diào)控環(huán)路[4，6]。

圖1 生物鐘分子機制

2 晝夜節(jié)律和心臟損傷

幾乎所有類型的哺乳動物中，心臟和血管細胞都存在生物節(jié)律，包括心肌細胞、心肌成纖維細胞、血管平滑肌細胞和血管內(nèi)皮細胞。在離體培養(yǎng)的心肌組織、細胞以及在體心臟中均觀察到生物鐘基因呈節(jié)律性振蕩表達[5]。心臟轉(zhuǎn)錄組學分析表明心臟中有10%～15%基因的表達具有節(jié)律性[1，7]。在以人和小鼠為代表的哺乳動物中，生物鐘基因可調(diào)控許多細胞增殖、代謝和死亡相關(guān)的重要生命過程。因此，晝夜節(jié)律紊亂可導(dǎo)致細胞分裂失調(diào)，加重包括高血壓和冠心病等在內(nèi)的心血管疾病的風險[5]。在大鼠心肌IR模型中，IR可迅速引起缺血區(qū)心肌細胞生物鐘基因的表達異常。與非缺血區(qū)相比，所有核心生物鐘基因(包括Bmal1、Clock、Npas2、Per1/2、Cry1/2和Rev-erbα)的振蕩幅度均明顯降低。同時，鐘控基因(Dbp、Tef和E4bp4)表達的模式在缺血區(qū)也發(fā)生了明顯改變[8]。這些結(jié)果表明，心肌IR不僅導(dǎo)致心臟功能與整體環(huán)境的同步性喪失，也會造成心臟不同區(qū)域的功能無法實現(xiàn)同步，從而導(dǎo)致心肌IR的病理學改變。另一方面，生物鐘紊亂可明顯影響IR和心肌梗死后心臟損傷發(fā)生和進展的嚴重程度。Per2敲除可增高IR后心臟中單不飽和脂肪酸和促炎因子[白介素(IL)-6和腫瘤壞死因子-α]的表達，加重心肌損傷[9]。圍手術(shù)期心肌梗死是極為常見的心血管并發(fā)癥，麻醉劑咪達唑侖可能因為下調(diào)了Per2基因的表達，從而加重IR所導(dǎo)致的心臟功能損傷。通過使用具有上調(diào)Per2表達活性的藥物川陳皮素或柑橘黃酮可一定程度上保護在心肌IR損傷治療時使用咪達唑侖所造成的心臟功能損害[10]。Rev-erb的激動劑SR9009處理可降低小鼠心肌IR后的NLRP3炎性小體的產(chǎn)生，減少免疫細胞的聚集，從而有利于損傷心肌的修復(fù)[11]。此外，缺氧誘導(dǎo)因子1α是心肌細胞感知缺血缺氧的一個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能通過與相關(guān)基因啟動子區(qū)的缺氧反應(yīng)元件相結(jié)合，調(diào)控細胞的代謝、生存和死亡。研究表明，缺氧誘導(dǎo)因子1α也通過與Bmal1和Clock基因相互作用，參與節(jié)律基因的表達調(diào)控[12-13]，但生物鐘基因在調(diào)控心肌梗死及IR損傷中的作用及分子機制仍需進一步探討。

3 晝夜節(jié)律和細胞死亡

研究證實心肌細胞死亡和細胞數(shù)量的減少是引起心臟重構(gòu)和心功能不全的根本原因。晝夜節(jié)律可通過調(diào)節(jié)多條細胞死亡相關(guān)信號通路參與心肌細胞死亡的過程，包括細胞凋亡、壞死、自噬性死亡、鐵死亡和焦亡等。

3.1 細胞凋亡

細胞凋亡是機體在生理或病理條件下通過激活胱天蛋白酶(caspase)引起的一種程序性細胞死亡方式，受細胞內(nèi)外多種因子的調(diào)控。研究表明其在多種心臟疾病包括IR損傷和心肌梗死中發(fā)揮重要作用。細胞凋亡主要有兩種方式，即外源性死亡受體途徑和內(nèi)源性線粒體途徑。腫瘤壞死因子-α是外源性死亡受體通路的重要介質(zhì)，在免疫組織和器官中其轉(zhuǎn)錄和分泌具有節(jié)律性[14]。Cry1/2可通過核因子κB信號通路調(diào)節(jié)T細胞中腫瘤壞死因子-α的合成和分泌，從而影響其所介導(dǎo)的細胞凋亡進程[15]。晝夜節(jié)律紊亂可引起包括上述分子在內(nèi)的細胞因子的表達規(guī)律變化，并誘導(dǎo)和參與心肌IR損傷等多種心血管疾病的發(fā)生。因此，改善生物鐘紊亂或合理選擇給藥時間可能影響心肌IR后的炎癥反應(yīng)，對預(yù)防細胞凋亡及心力衰竭具有重要的臨床意義。

caspase的激活和線粒體外膜損傷通過激活B細胞淋巴瘤2家族蛋白(Bcl-2家族)促凋亡成員(Bax、Bak和Bnip3)介導(dǎo)內(nèi)源性線粒體死亡途徑，放大死亡信號從而造成組織的形態(tài)學改變。腫瘤抑制蛋白p53在DNA損傷引起的細胞凋亡和內(nèi)源性凋亡通路中起著重要作用，盡管該蛋白似乎未以晝夜節(jié)律的方式表達，但研究顯示它可直接與核心生物鐘基因相互作用，其啟動子的活性可能受Bmal1的調(diào)控[16]。此外 p53還被證明可轉(zhuǎn)錄激活Bcl-2死亡蛋白Bnip3，并在心肌細胞中引發(fā)自噬細胞死亡[17]。Bnip3是參與心肌細胞線粒體功能障礙、線粒體自噬和細胞死亡的關(guān)鍵信號因子，可引起線粒體內(nèi)膜紊亂，導(dǎo)致呼吸鏈損傷，線粒體內(nèi)膜跨膜電位降低，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，進而通過線粒體自噬或通過凋亡或壞死途徑，最終造成細胞死亡。線粒體靶向缺失Bnip3可抑制缺氧時Bnip3誘導(dǎo)的線粒體損傷和細胞死亡[18]。也有研究表明，核心生物鐘基因Bmal1可通過Bnip3調(diào)節(jié)線粒體的分裂和吞噬功能，在擴張型心肌病的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用，進一步提示生物鐘在調(diào)節(jié)心肌細胞死亡中的重要作用[19]。

3.2 壞死

壞死最初被認為是缺血性損傷期間一種偶然的細胞死亡形式。近期越來越多的證據(jù)表明，壞死像細胞凋亡一樣，是程序性細胞死亡的一種調(diào)控形式，但其細胞的形態(tài)學改變與凋亡不同。其特點包括細胞膜通透性的增高和腫脹、線粒體功能障礙、DNA降解和細胞膜破裂，最后共同激活損傷部位的炎癥反應(yīng)。有研究表明多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(PARP1)和受體相互作用蛋白1(RIP1)在心肌IR后的表達顯著上調(diào)，并且與梗死后心肌細胞死亡、心臟收縮功能下降以及心肌中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(輔酶I)和腺苷三磷酸含量的減少相關(guān)[20-22]。在果蠅芯片分析的結(jié)果表明，Clock基因的突變能明顯地上調(diào)RIP1和PARP1的表達[23]。因此，鑒于RIP1和PARP1與缺血損傷后細胞死亡之間存在密切的關(guān)系，并結(jié)合臨床數(shù)據(jù)(即在早晨發(fā)生心肌梗死和心臟損傷的風險更大)，進一步探討晝夜節(jié)律對心肌細胞壞死相關(guān)基因和信號通路的影響十分必要。

3.3 自噬性死亡

自噬是指在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下利用溶酶體降解大分子蛋白和受損或衰老的細胞器以維持細胞自身需要的過程。心臟的自噬作用對于維持心血管穩(wěn)態(tài)和功能至關(guān)重要。正常心臟中自噬小體的體積和密度呈節(jié)律變化模式，在光照后期達到峰值，然后下降，夜間到達谷值，證明自噬流的出現(xiàn)也具有晝夜節(jié)律性[24]。自噬過程的缺陷或增多均會引起心臟損傷和心功能不全等病理過程[25]。在心肌IR損傷過程中，缺血早期(即再灌注前)自噬激活發(fā)揮保護作用；而再灌注期間自噬活性低下或延遲則有損傷作用[26]。因此，深入了解晝夜節(jié)律、自噬和心臟功能之間的關(guān)系將為心肌梗死后的治療和修復(fù)提供最佳策略。

目前發(fā)現(xiàn)，晝夜節(jié)律效應(yīng)因子和代謝信號均可轉(zhuǎn)錄調(diào)控自噬流的節(jié)律。CCAAT增強子結(jié)合蛋白β(C/EBPβ)是一個具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，呈晝夜節(jié)律依賴方式表達。C/EBPβ基因敲除可消除晝夜節(jié)律介導(dǎo)的自噬作用，提示C/EBPβ是調(diào)節(jié)自噬節(jié)律的一個關(guān)鍵基因[27]。AMP活化蛋白激酶(AMPK)是一個重要的能量感應(yīng)激酶，可觸發(fā)不同的分解代謝途徑，包括葡萄糖攝取和氧化代謝，并且還負責延遲各種合成代謝過程，包括脂類、蛋白質(zhì)和碳水化合物。在心肌細胞，AMPK也是連接晝夜節(jié)律與自噬的一個重要激酶。AMPK既可激活unc-51樣激酶1，也可通過抑制雷帕霉素復(fù)合體1進而激活unc-51樣激酶1。而且AMPK和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白活性均呈節(jié)律性調(diào)控[28-29]，提示晝夜節(jié)律與AMPK介導(dǎo)的自噬之間存在密切的關(guān)系。

3.4 鐵死亡

鐵死亡是一種鐵離子調(diào)節(jié)的非凋亡細胞死亡形式，其特征是依賴鐵離子介導(dǎo)的活性氧產(chǎn)生而引起脂質(zhì)過氧化物的聚積。盡管關(guān)于鐵死亡在心臟中的作用的研究報道有限，但一項在大腦中的研究表明腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子可通過TrkB.T1和p75NTR受體復(fù)合物激活核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)，進而保護鐵離子誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞毒性。而Clock和Bmal1可調(diào)節(jié)p75NTR表達，提示腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對Nrf2的激活可能受晝夜節(jié)律的調(diào)控[30]。心臟中鐵死亡是否受到相同水平的晝夜節(jié)律控制仍有待研究。最近，Liu等[31]通過體內(nèi)外試驗證實生物鐘調(diào)控分子Bmal1可被選擇性的自噬降解，即鐘表性自噬(clockophagy)，從而導(dǎo)致鐵敏感性癌細胞死亡。近年，多個研究證明鐵死亡參與心肌損傷過程。Gao等[32]發(fā)現(xiàn)應(yīng)用鐵螯合劑或谷氨酰胺分解抑制劑處理小鼠可明顯降低鐵死亡，改善IR后心功能不全。Li等[33]發(fā)現(xiàn)心臟移植后鐵死亡可通過Toll樣受體4/β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白/I型干擾素信號通路促進中性粒細胞黏附于動脈內(nèi)皮細胞，進而向損傷的心肌聚集；而鐵死亡特異性抑制劑能有效地降低心肌細胞的鐵死亡和中性粒細胞的浸潤。Fang等[34]也證明，鐵死亡是IR和阿霉素誘導(dǎo)的小鼠心肌病的一個重要機制，而應(yīng)用鐵死亡特異性抑制劑和鐵螯合劑阻斷鐵死亡后可明顯改善心力衰竭，但晝夜節(jié)律是否調(diào)控心臟鐵死亡仍有待進一步研究。

3.5 焦亡

焦亡是一種程序性細胞死亡的形式，其特征是質(zhì)膜的迅速破裂，以及隨后細胞內(nèi)容物和包括IL-1β和IL-18在內(nèi)的促炎介質(zhì)的釋放所引起的炎癥級聯(lián)反應(yīng)[35]。焦亡主要包括caspase-1依賴的經(jīng)典途徑與涉及caspase-4、caspase-5(人類)和caspase-11(小鼠)的非經(jīng)典途徑[36]。在caspase-1依賴的焦亡途徑中，受到高血脂、高血糖和炎癥的刺激后，細胞通過識別病原體相關(guān)分子模式和危險相關(guān)分子模式的作用激活各自的炎性小體(包括NLRP3、AIM2或pyrin)，招募凋亡相關(guān)斑點樣蛋白并觸發(fā)前半胱天冬酶-1的裂解和活化，介導(dǎo)IL-1β和IL-18等促炎性細胞因子的成熟和分泌。此外，caspase-1裂解消皮素D(消皮素蛋白家族成員，由500多個氨基酸組成)并寡聚形成消皮素D的氨基端產(chǎn)物，介導(dǎo)細胞膜孔的形成，促進炎癥因子的釋放，導(dǎo)致細胞腫脹和焦亡的最終發(fā)生[37-38]。在非經(jīng)典途徑中，革蘭氏陰性細菌的細胞壁成分脂多糖在小鼠中激活caspase-11，在人類細胞中激活caspase-4和caspase-5，直接剪切消皮素D引發(fā)細胞焦亡；同時，消皮素D的氨基端產(chǎn)物激活NLRP3炎性小體，并間接激活caspase-1，引發(fā)焦亡[38-39]。

盡管晝夜節(jié)律是否直接調(diào)控細胞焦亡過程尚不清楚，但大量研究證實了細胞焦亡在心血管疾病中的重要作用。在心血管疾病中，各種刺激(如高脂肪/高糖)導(dǎo)致的線粒體功能障礙，以及隨后活性氧的過度產(chǎn)生、核因子κB核轉(zhuǎn)位的增加以及炎性小體NLRP3的活化所誘導(dǎo)的細胞焦亡在心臟和血管細胞中廣泛發(fā)生。例如，有研究發(fā)現(xiàn)在心肌梗死動物模型中，抑制NLRP3炎癥小體或凋亡相關(guān)斑點樣蛋白可縮小梗死面積和改善心功能[40-41]。可見，干預(yù)焦亡途徑中的相關(guān)分子(如NLRP3、AIM2、caspase-1和IL-1β)可通過影響細胞焦亡參與心血管疾病的發(fā)生和進展，其可能成為心血管疾病治療的潛在靶點。因此，晝夜節(jié)律也可能通過調(diào)節(jié)細胞焦亡的相關(guān)過程影響心血管疾病的進程，但這方面的研究仍需進一步的深入和擴充。

4 小結(jié)

人和動物的大量研究證明，生物鐘在調(diào)節(jié)心血管穩(wěn)態(tài)和疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。雖然有證據(jù)表明生物鐘基因參與調(diào)節(jié)細胞凋亡、壞死以及自噬性細胞死亡等，但仍需進一步闡明其調(diào)控的特異信號通路。這對于深入了解在心臟損傷后心肌細胞死亡的分子機制，闡明晝夜節(jié)律在其中的重要作用，為心血管病患者的治療和預(yù)后提供最佳策略具有重要的指導(dǎo)意義。