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        淺談基層開展熒光PCR試驗(yàn)的注意事項(xiàng)

        2021-12-01 11:23:47高愛萍
        中國畜禽種業(yè) 2021年9期
        關(guān)鍵詞:實(shí)驗(yàn)室區(qū)域檢測(cè)

        高愛萍

        (江蘇省徐州市畜牧獸醫(yī)站 221000)

        近幾年,隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展,分子生物學(xué)技術(shù)在各行各業(yè)得到廣泛應(yīng)用,PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)的簡稱,是上世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的一種體外擴(kuò)增技術(shù),用于放大特定的DNA片段,該技術(shù)在體外可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量特定目的基因片段,通過DNA基因追蹤系統(tǒng)能迅速掌握體內(nèi)的病毒含量,其精確度高達(dá)納米級(jí),從而大大簡化了傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中通過熒光信號(hào)對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)的技術(shù),在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期,模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系,成為定量依據(jù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有敏感,快速,高通量,簡便、自動(dòng)化程度高等突出優(yōu)勢(shì),目前已成為疫病流行病學(xué)調(diào)查中病原檢測(cè)及病原學(xué)診斷的常規(guī)操作技術(shù)之一。

        隨著我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,及畜禽進(jìn)出口貿(mào)易的加大,動(dòng)物疫病也不斷發(fā)展,尤其是近幾年非洲豬瘟、小反芻獸疫、牛結(jié)節(jié)病等外來疾病的侵入,給傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷和流行病學(xué)調(diào)查帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn),為應(yīng)對(duì)這一形式,實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室診斷和流行病學(xué)調(diào)查中得以廣泛應(yīng)用。但該實(shí)驗(yàn)條件、技術(shù)要求高,目前雖然一部分基層實(shí)驗(yàn)室具備了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)的資質(zhì),也得到農(nóng)業(yè)農(nóng)村部及省級(jí)主管部門通過不同方式的考核及授權(quán),能開展實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)工作,但在實(shí)際檢測(cè)工作的各個(gè)環(huán)節(jié)仍存在很多影響因素,造成檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確,出現(xiàn)假陽性、假陰性的結(jié)果,筆者近幾年一直從事獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室PCR檢測(cè)工作,現(xiàn)參考相關(guān)資料,從實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)過程的不同環(huán)節(jié)、不同層面分析存在的影響因素,提出消除因素的方法。

        1 人員方面

        (1)從事PCR試驗(yàn)的檢測(cè)人員必須參加農(nóng)業(yè)農(nóng)村部或省級(jí)動(dòng)物疫病控制中心舉辦的PCR檢測(cè)技術(shù)培訓(xùn)班,切實(shí)掌握PCR檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)原理、方法和步驟,經(jīng)考核合格后方可上崗操作,試驗(yàn)操作時(shí)嚴(yán)格按照PCR試驗(yàn)操作規(guī)程、檢驗(yàn)流程進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)。

        (2)積極參加行業(yè)部門組織的培訓(xùn)及交流,不斷擴(kuò)充新知識(shí),提高業(yè)務(wù)技術(shù)水平。

        (3)積極參加上級(jí)業(yè)務(wù)部門組織的盲樣比對(duì)試驗(yàn),不斷提高檢測(cè)技術(shù)能力和檢測(cè)技術(shù)水平。

        2 實(shí)驗(yàn)室管理方面

        (1)做好實(shí)驗(yàn)室建設(shè)管理,制定科學(xué)合理的實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)規(guī)章制度。主要包括實(shí)驗(yàn)室生物安全制度,實(shí)驗(yàn)室崗位責(zé)任制度,樣品的采集、運(yùn)輸、保存制度,儀器設(shè)備的使用、維護(hù)管理制度,實(shí)驗(yàn)室安全操作管理制度,實(shí)驗(yàn)室廢棄物處理制度,實(shí)驗(yàn)室清潔消毒制度,實(shí)驗(yàn)室試劑保存使用制度,實(shí)驗(yàn)室記錄、檢驗(yàn)報(bào)告的審核制度等。

        (2)制定實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)操作流程,制定儀器、設(shè)備的使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序。主要包括生物安全柜的使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序,核酸提取儀的使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序,PCR儀的使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序,離心機(jī)的使用及維護(hù)程序,樣品的準(zhǔn)備及核酸提取操作程序,試劑配制操作程序等,以確保實(shí)驗(yàn)室的日常運(yùn)作符合試驗(yàn)要求,確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,確保實(shí)驗(yàn)室的各項(xiàng)生物安全等。

        (3)完善實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)記錄,主要包括藥品、試劑采購、使用記錄,樣品收集、使用記錄,實(shí)驗(yàn)室的各項(xiàng)檢驗(yàn)原始記錄,儀器設(shè)備的使用及維護(hù)記錄,消毒記錄,廢棄物處理記錄,冰箱溫度記錄及檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告記錄等。

        3 功能區(qū)布局方面

        (1)依據(jù)熒光PCR試驗(yàn)檢測(cè)流程可將熒光PCR實(shí)驗(yàn)室分為配液區(qū)(核酸擴(kuò)增試劑的配制、分裝和保存)、樣品準(zhǔn)備區(qū)(樣品的登記、分裝;核酸的提取、保存和加樣)、核酸擴(kuò)增區(qū)(核酸擴(kuò)增、結(jié)果分析、登記及報(bào)告)3個(gè)完全獨(dú)立的區(qū)域,以防止交叉污染。整個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)室需有一個(gè)整體的緩沖區(qū),同時(shí)每個(gè)獨(dú)立的分區(qū)也應(yīng)有單獨(dú)的緩沖區(qū)。

        (2)各區(qū)域的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)要設(shè)置合理,各緩沖區(qū)的排風(fēng)扇往外排氣,在實(shí)驗(yàn)區(qū)的外墻上和各扇門上安裝可調(diào)的回風(fēng)口,空氣通過回風(fēng)口向室內(nèi)換氣。

        (3)試驗(yàn)區(qū)空氣流動(dòng)按配液區(qū)→樣品準(zhǔn)備區(qū)→核酸擴(kuò)增區(qū)單一走向,做負(fù)壓設(shè)計(jì),使氣流定向流動(dòng),避免擴(kuò)增產(chǎn)物回流造成污染,各區(qū)通過機(jī)械連鎖不銹鋼傳遞窗傳遞試劑和樣本。

        4 儀器與設(shè)備方面

        (1)根據(jù)需要,每個(gè)不同的區(qū)域應(yīng)配備相適應(yīng)的設(shè)備、儀器、耗材,且各個(gè)區(qū)域的設(shè)備、儀器、耗材應(yīng)無污染,并做明顯的標(biāo)記,各區(qū)不能混用。

        配液區(qū):超凈工作臺(tái)、合適量程的加樣槍,槍頭,冰箱,臺(tái)式低速離心機(jī),混勻器,可移動(dòng)紫外燈,專用垃圾桶等。

        樣品準(zhǔn)備區(qū):生物安全柜,冰箱,全自動(dòng)核酸提取儀,合適量程的加樣槍,槍頭,臺(tái)式低速離心機(jī),臺(tái)式高速離心機(jī)(冷凍及常溫),混勻器,可移動(dòng)紫外燈,專用垃圾桶等。

        擴(kuò)增區(qū):實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀,通用電腦,自動(dòng)分析軟件,專用垃圾桶等,檢測(cè)設(shè)備必須符合標(biāo)準(zhǔn)PCR熒光實(shí)驗(yàn)室設(shè)置要求。

        (2)所有儀器和設(shè)備均需嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和注意事項(xiàng)進(jìn)行使用,并定期進(jìn)行維護(hù)和校正。

        5 規(guī)范操作方面

        實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入工作區(qū)域應(yīng)按照單一的方向進(jìn)行各項(xiàng)操作工作,由配液區(qū)→樣品準(zhǔn)備區(qū)→核酸擴(kuò)增區(qū),禁止由核酸擴(kuò)增區(qū)逆行至其他兩個(gè)區(qū)域。進(jìn)入不同區(qū)域需穿戴各區(qū)域?qū)S玫墓ぷ鞣⑹痔?、口罩、帽子,切忌從核酸擴(kuò)增區(qū)穿著工作服,戴手套和帽子逆行到核酸提取區(qū);發(fā)現(xiàn)手套有污染時(shí)應(yīng)立即更換;試驗(yàn)完成離開工作場(chǎng)所時(shí)要脫掉手套,更換工作服。

        5.1 試劑配制

        配制擴(kuò)增試劑體系需在配液區(qū)的超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行,所用耗材確保無污染,最好使用帶濾芯的加長槍頭。選擇質(zhì)量好的EP管,加入反應(yīng)體系,各試劑在取用前應(yīng)先瞬時(shí)離心,確保管蓋上的試劑沉于管底;打開管蓋動(dòng)作要輕,吸取試劑要慢,吸樣盡量一次完成,忌多次抽吸,以防止管內(nèi)液體濺出或產(chǎn)生氣溶膠而污染環(huán)境。

        5.2 樣品制備(核酸提?。?/h3>

        接收樣品時(shí)要確保樣品密封完好、編號(hào)清楚且具有唯一性,嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行加樣,操作時(shí)盡量少說話,所有操作需要在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行,操作前后生物安全柜需要進(jìn)行紫外燈消毒,安全柜內(nèi)的物品要擺放整齊、便于操作。核酸提取后小心加入已加入反應(yīng)液的EP管中,同時(shí)設(shè)立陰陽對(duì)照,小心蓋緊蓋子,上機(jī)前混勻、離心,將管壁及管蓋上的液體甩至管底。

        5.3 核酸擴(kuò)增區(qū)

        上機(jī)前需檢測(cè)熒光PCR儀的各項(xiàng)指標(biāo),確保儀器能正常運(yùn)行。

        6 控制污染方面

        由于極微量的核酸污染即可嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性、假陰性的結(jié)果,因此,整個(gè)PCR試驗(yàn)過程始終保持“無核酸觀念”,時(shí)刻注意避免來自樣品、試劑及試驗(yàn)各個(gè)環(huán)節(jié)的操作污染,尤其防止形成的氣溶膠對(duì)環(huán)境造成污染。

        (1)實(shí)驗(yàn)前對(duì)整個(gè)試驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行徹底消毒,包括環(huán)境、儀器設(shè)備耗材,工作服等。

        (2)與試驗(yàn)無關(guān)的人員禁止入試驗(yàn)區(qū)域內(nèi),并減少不必要走動(dòng),減少交叉污染。

        (3)試驗(yàn)前后需用紫外線照射整個(gè)試驗(yàn)區(qū)域,時(shí)間不低于30min,并用含有效氯1000mg/L消毒劑擦拭儀器表面、工作臺(tái)和地面。

        (4)整個(gè)PCR試驗(yàn)結(jié)束后,所有實(shí)驗(yàn)廢棄物尤其是核酸擴(kuò)增區(qū)的廢棄物必須先浸泡于含有效氯1000mg/L消毒劑中60min以上,經(jīng)高壓滅菌后按醫(yī)療垃圾廢棄物統(tǒng)一處理,同時(shí)清理實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)面,并用消毒劑擦洗干凈。

        (5)實(shí)驗(yàn)室要經(jīng)常通風(fēng)換氣和消毒,以消除試驗(yàn)過程中產(chǎn)生的氣溶膠。

        總之,實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是一項(xiàng)靈敏度高且又快速的檢測(cè)技術(shù),目前已成為獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室流行病學(xué)調(diào)查及疾病診斷的主要檢測(cè)技術(shù),在實(shí)際操作中一定要嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行操作,盡量消除影響檢測(cè)結(jié)果的因素,確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,為動(dòng)物疫病防控提供科學(xué)依據(jù)。

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