王夢(mèng)卉 彩 麗 吳 婷 駱 秦 張瑋瑋 周克明 王國(guó)亮 趙建雯 張智華 李南方

原發(fā)性醛固酮增多癥(primary aldosteronism，PA)是目前臨床上最常見(jiàn)的內(nèi)分泌性高血壓疾病，常誘發(fā)或促進(jìn)動(dòng)脈硬化、糖尿病或阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征。PA主要分5型，即醛固酮瘤(aldosterone production adenoma，APA)、特發(fā)性醛固酮增多癥、糖皮質(zhì)激素可治性醛固酮增多癥、醛固酮癌、異位醛固酮分泌性腺瘤或腺癌，其中部分APA患者行腎上腺病灶切除術(shù)后可達(dá)到治愈的療效。已證實(shí)腎上腺球狀帶細(xì)胞膜上內(nèi)向整流鉀通道KCNJ5(Kir3.4)基因突變與APA的發(fā)生密切相關(guān)，主要突變位點(diǎn)有G151R、L168R、G151E、T158A、delI157、Y152C等，其中G151R、L168R位點(diǎn)突變占KCNJ5基因突變的90%以上，突變可使內(nèi)向整流鉀通道的通透性增加，細(xì)胞去極化及電壓門(mén)控鈣通道激活，細(xì)胞內(nèi)鈣超載后促進(jìn)醛固酮過(guò)度分泌。鈉鈣交換體(Na/Caexchanger，NCX)是一種雙向離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，具有兩種工作模式，分別將鈣離子轉(zhuǎn)入或轉(zhuǎn)出細(xì)胞，其成員有NCX1、NCX2及NCX3，主要作用是維持細(xì)胞內(nèi)Ca穩(wěn)態(tài)，與高血壓發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。NCX1與內(nèi)向整流鉀通道同處于腎上腺球狀帶細(xì)胞膜，協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外鉀、鈉、鈣離子的濃度，抑制或促進(jìn)球狀帶細(xì)胞釋放醛固酮。然而，APA患者瘤體內(nèi)外KCNJ5基因突變位點(diǎn)是否一致及NCX1的表達(dá)情況目前研究少有報(bào)道。本研究旨在分析已行腎上腺病灶切除術(shù)的APA患者瘤組織、瘤旁組織中KCNJ5基因G151R、L168R變異及NCX1表達(dá)的特征,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年8月至2017年8月就診于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院高血壓科，經(jīng)病理證實(shí)的APA患者的組織標(biāo)本共35例，平均年齡50(46，55)歲，女性19例，男性16例。35例患者中APA瘤內(nèi)KCNJ5基因G151R及L168R位點(diǎn)變異情況為：G151R(+)4例，L168R(+)7例，G151R(-)/L168R(-)24例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)；②依據(jù)PA診療指南確診PA后行腎上腺CT檢查及腎上腺靜脈取血術(shù)(adrenal venous sampling，AVS)明確為單側(cè)型PA,請(qǐng)本院泌尿外科專家會(huì)診行單側(cè)腎上腺病變切除術(shù)，最終病理證實(shí)為APA；③已行術(shù)后血壓、血鉀、腎素及醛固酮激素隨訪者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①基線數(shù)據(jù)不全；②瘤旁組織較少，不足以完成檢測(cè)。其中9例患者同時(shí)完成APA瘤內(nèi)及瘤旁組織KCNJ5基因G151R及L168R位點(diǎn)檢測(cè)。

1.2 組織標(biāo)本收集及處理 行單側(cè)腎上腺病變切除術(shù)后組織標(biāo)本立即置于液氮中保存，直至提取組織DNA。

1.3 臨床資料收集 收集35例APA患者的手術(shù)前及術(shù)后半年的臨床指標(biāo)，包括收縮壓、舒張壓、血清鉀離子、血漿腎素活性及醛固酮濃度。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 提取APA瘤內(nèi)及瘤旁組織DNA 使用組織基因組DNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司D1700)提取9例APA瘤內(nèi)及瘤旁組織的DNA，使用核酸蛋白定量?jī)x檢測(cè)DNA濃度，使用分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的純度，瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA的完整性，DNA保存于-20℃。

1.4.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增及測(cè)序 用1.4.1已提取的腺瘤組織和瘤旁組織的DNA 50～100 ng，配制各反應(yīng)試劑如下：2×EasyTaq PCR SuperMix 25 μL(全式金AS111)，10 μM上游引物和10 μM下游引物各1μL[引物序列(5’ to 3’)：KCNJ5-F CATGGAGAAGAGTGGCAAGTG；KCNJ5-R ATGTGGGAGTTGCGGAGG]，補(bǔ)水至反應(yīng)總體積為50 μL。PCR循環(huán)反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性3 min；94℃反應(yīng)30 s，60℃反應(yīng)30 s，72℃反應(yīng)30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃反應(yīng)5 min。終止反應(yīng)的PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖電泳檢測(cè)及成像分析。將PCR產(chǎn)物按照武漢昆泰銳公司試劑盒操作指南進(jìn)行純化，上樣于全自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行DNA序列測(cè)定，所測(cè)單鏈序列經(jīng)序列閱讀軟件讀序，然后人工校閱及分析。

1.4.3 樣本分型 將所有樣本的測(cè)序序列，采用Blast和ClustaW與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載的參考序列進(jìn)行DNA序列的突變位點(diǎn)比較，結(jié)合直接測(cè)序的峰型圖對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行分型統(tǒng)計(jì)。

1.4.4 蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)(Western-blot)檢測(cè)NCX1蛋白表達(dá) 取APA瘤體及瘤旁組織樣本，加入蛋白酶抑制劑(博士德AR1178)和磷酸酶抑制劑(博士德AR1183)，再加入300 μL的RIPA裂解液(博士德AR0105)提取組織總蛋白，BCA(全式金DQ111-01)定量后取40 μg蛋白上樣，在10%SDS-PAGE凝膠中電泳(北京六一DYCZ-24DN電泳儀)，然后將SDS-PAGE凝膠、濾紙以及經(jīng)甲醇處理過(guò)的PVDF膜一起轉(zhuǎn)膜(美國(guó)Bio-Rad公司蛋白轉(zhuǎn)膜儀)，漂洗后使用5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST漂洗3次，然后加入使用TBST稀釋的NCX1蛋白(abcam公司ab177952)檢測(cè)一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗3次后再加入適當(dāng)稀釋的二抗(abcam公司ab205718)，室溫孵育1 h，TBST漂洗3次后進(jìn)行顯色，用化學(xué)發(fā)光成像儀系統(tǒng)檢測(cè)、拍照(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司Chemiscop3000)。

1.4.5 內(nèi)參蛋白 β-actin抗體購(gòu)自生工生物公司D110001。與提取的組織總蛋白同時(shí)進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，并以檢測(cè)蛋白/內(nèi)參蛋白的比值表示檢測(cè)的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 APA患者手術(shù)前后臨床資料比較 本研究中的35例APA患者平均年齡(50±9)歲，其中女性19例(54.3%)，身體質(zhì)量指數(shù)(24.9±2.0)kg/m，低鉀血癥患者27例(75.0%)。隨訪結(jié)果：35例(100%)患者術(shù)后血鉀恢復(fù)至3.5 mmol/L以上，25例(69.4%)患者未服用降壓藥，術(shù)后血壓低于149/90 mmHg。治療后收縮壓、舒張壓、血漿醛固酮濃度均較治療前降低，血清鉀、血漿腎素活性均較治療前升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 35例APA患者手術(shù)前后臨床指標(biāo)的比較

2.2 瘤內(nèi)、瘤旁組織KCNJ5基因變異位點(diǎn)基因型及NCX1/β-actin 9例患者APA瘤內(nèi)與瘤旁組織KCNJ5基因變異位點(diǎn)基因型一致，見(jiàn)表2。NCX1在APA瘤內(nèi)及瘤旁表達(dá)的Western-blot見(jiàn)圖1，APA瘤內(nèi)NCX1/β-actin為0.133(0.128，0.047)，提示有表達(dá)，且在G151R及L168R不同基因型中均有表達(dá)；瘤旁組織NCX1/β-actin為0.016(0.002，0.022)，提示低表達(dá)。

表2 瘤內(nèi)、瘤旁組織KCNJ5基因變異位點(diǎn)基因型及NCX1表達(dá)

圖1 NCX1在APA瘤內(nèi)瘤旁表達(dá)的Western-blot圖

3 討論

APA是PA的典型代表，臨床特征相對(duì)明顯，易于鑒別，行腎上腺病變切除術(shù)后低鉀血癥可被糾正，部分患者可停用降壓藥，是少數(shù)可以治愈的繼發(fā)性高血壓。本研究回顧35例經(jīng)手術(shù)切除病理證實(shí)的APA患者，均為典型PA患者，所有患者術(shù)后血鉀恢復(fù)正常，60%以上的患者術(shù)后血壓達(dá)標(biāo)。9例患者的瘤組織及瘤旁組織均已行KCNJ5基因G151R和L168R位點(diǎn)測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在KCNJ5突變的瘤旁組織存在相應(yīng)基因位點(diǎn)突變。NCX1在APA腫瘤內(nèi)表達(dá)高于瘤旁組織，但與KCNJ5變異位點(diǎn)基因型無(wú)關(guān)。

有研究提示，APA瘤內(nèi)超高分泌醛固酮可負(fù)反饋抑制其瘤旁組織醛固酮的正常分泌。大部分APA在增強(qiáng)CT上呈不被強(qiáng)化的低密度結(jié)節(jié)(CT值≤10 HU)，腫瘤與瘤旁組織有清晰的界限。雖然APA有清晰包膜，但瘤旁組織也存在球狀帶細(xì)胞增生、醛固酮合成酶基因(CYP11B2)高表達(dá)、分泌醛固酮的細(xì)胞簇增多、血管化表面減少等結(jié)構(gòu)重塑，此外，瘤旁組織還可見(jiàn)不易被影像學(xué)檢測(cè)到的次級(jí)微腺瘤，基因組學(xué)證實(shí)主瘤體及瘤旁微腺瘤KCNJ5基因突變類型一致，主要為G151R位點(diǎn)突變。本研究也發(fā)現(xiàn)APA瘤旁組織具有與瘤體一致的KCNJ5突變基因型。

NCX1在人體多個(gè)器官組織中有表達(dá)，且與心腦血管疾病、糖尿病等疾病密切相關(guān)。NCX1還可參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移、腫瘤血管生成，并促進(jìn)上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化，最后誘導(dǎo)正常細(xì)胞凋亡。研究顯示，腎上腺球狀帶細(xì)胞存在NCX表達(dá)，主要作用為穩(wěn)定胞漿內(nèi)Ca平衡，其活性是限速的；除NCX外，球狀帶細(xì)胞膜上還存在血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)受體，但表達(dá)低、無(wú)功能；咖啡因可減低AngⅡ?qū)CX的抑制，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增加促進(jìn)醛固酮釋放，這個(gè)過(guò)程還涉及p38絲裂原活化蛋白激酶和脂氧合酶產(chǎn)物。本研究結(jié)果提示：APA瘤內(nèi)有NCX1表達(dá)，且在不同G151R、L168R基因型中均有表達(dá)；在瘤旁組織中，NCX1表達(dá)少，因此，推測(cè)NCX1可能通過(guò)其他機(jī)制參與腫瘤的形成，需要進(jìn)一步研究及探討。此外，PA除有KCNJ5基因突變外，還存在ATP1A1、ATP2B3、CACNA1D等多種體細(xì)胞突變基因，不除外NCX的表達(dá)與APA其他形式的基因突變有關(guān)。本研究所有APA診斷均經(jīng)病理證實(shí)，所有試驗(yàn)規(guī)范操作均有質(zhì)量控制環(huán)節(jié)，數(shù)據(jù)真實(shí)可靠，但可作為NCX1參與APA發(fā)病機(jī)制的初步探索病例例數(shù)較少，結(jié)果的準(zhǔn)確性需在大樣本研究中驗(yàn)證。此外，根據(jù)目前NCX1在APA瘤內(nèi)有表達(dá)的特征，可提出新假設(shè)：NCX1可能通過(guò)調(diào)節(jié)KCNJ5突變腫瘤細(xì)胞內(nèi)鈉鈣離子濃度而促進(jìn)或抑制腎上腺球狀帶細(xì)胞醛固酮的分泌，有待設(shè)計(jì)新課題進(jìn)一步研究。

綜上所述，APA患者，瘤內(nèi)及瘤旁組織的KCNJ5基因G151R、L168R位點(diǎn)變異一致；NCX1在APA瘤體內(nèi)有表達(dá)，在瘤旁組織表達(dá)不明顯。