馬 鳳

（甘肅省靖遠(yuǎn)縣畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心，甘肅靖遠(yuǎn) 730900）

近些年來，肺炎克雷伯菌逐漸在羊身上被發(fā)現(xiàn)，發(fā)展速度較快，對羊養(yǎng)殖產(chǎn)生了重要影響。大腸桿菌又稱為大腸埃希菌，這種細(xì)菌在腸道內(nèi)正常存在，但一些血清型的大腸桿菌會引發(fā)動物機(jī)體發(fā)生抵抗力低下，導(dǎo)致腹瀉或敗血癥的發(fā)生[1～3]。本研究對這兩種細(xì)菌混合感染進(jìn)行分析，以便獸醫(yī)能更好地對患病山羊進(jìn)行治療。

1 材料與方法

1.1 一般材料

患羊病癥為眼部紅腫，在放牧的過程中出現(xiàn)神經(jīng)性問題，不吃青草。本次實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的試劑為血平板培養(yǎng)基、腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）、麥康凱類瓊脂培養(yǎng)皿，使用16s rDNA Bacterial Identification PCR Kit試劑盒（寶生物工程有限公司生產(chǎn)），大腸桿菌診斷血清（天津生物芯片診斷）。

1.2 方法

1.2.1 對山羊病變組織急性處理

對山羊病變的部位進(jìn)行剖檢，病羊剖檢部位出現(xiàn)肺部淤血伴有壞死，心外膜增厚，肝臟腫大伴有壞死，病羊腹腔壞死，心臟外的薄膜厚度增加，其他組織有缺血情況，病羊腸道內(nèi)出血。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)

對病羊體內(nèi)細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，采用接種環(huán)對病羊體內(nèi)病變的器官內(nèi)的組織進(jìn)行挑選，使用麥康凱的平板進(jìn)行劃線處理，將培養(yǎng)皿放置在恒溫箱中，溫度維持在37℃，培養(yǎng)時間16 h以上。

1.2.3 染色鑒定

染色鑒定的方法主要采用革蘭氏染色。對培養(yǎng)皿中的菌落進(jìn)行挑選，將疑似患病的組織菌落固定在一處，采用結(jié)晶初染，滴加碘液，滴加時間控制在1 min，滴加乙醇和沙黃水溶液，時間控制在0.5 min，上述操作完成后進(jìn)行吸干和鏡檢操作。

1.2.4 生化方面的試驗(yàn)

抽取2只病羊血樣進(jìn)行測驗(yàn)，診斷腸桿菌科，主要采用玻璃板對菌株1、2進(jìn)行相關(guān)鑒定。

1.2.5 對血清型進(jìn)行鑒定

將病羊中的菌株1、2使用大腸桿菌進(jìn)行診斷，主要采用血清玻璃板凝集的方式進(jìn)行鑒定。

1.2.6 16S rRNA 測定基因序列的方法

主要方法步驟為：將純化完成的菌液煮沸，提取DNA，并將其作為模板，采用16s rDNA Bacterial Identification PCR Kit試劑盒對其中通用的物質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)充，測定基因序列，并將測試結(jié)果上傳至數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行全面分析。

1.2.7 藥敏試驗(yàn)

使用滅菌棉簽將純化完成的菌液均勻涂抹在培養(yǎng)皿中，再使用滅菌鑷子將藥敏紙片貼于培養(yǎng)皿上，隨后將其放置于培養(yǎng)箱內(nèi)，溫度保證在37℃，保存1 d左右，培養(yǎng)完成后，使用小尺測量培養(yǎng)菌圈的直徑。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)皿中細(xì)菌呈現(xiàn)的形態(tài)

菌株1在培養(yǎng)皿中通過麥康凱進(jìn)行培養(yǎng)形成圓形狀態(tài)，表現(xiàn)為光滑狀態(tài)，且菌株培養(yǎng)較為濕潤，邊緣較為齊整，呈現(xiàn)紅色狀態(tài)。菌株2呈現(xiàn)狀態(tài)與菌株1相同，但呈灰白色，且顏色較淺，菌株較小。

2.2 革蘭氏染色情況

使用光學(xué)顯微鏡觀察菌株1發(fā)現(xiàn)，呈粉紅色直桿菌，且直桿菌呈現(xiàn)菌體較大的情況，菌體兩端為鈍圓，且成對出現(xiàn)。菌株1和菌株2在革蘭氏染色處理下情況相同。

2.3 兩組生化試驗(yàn)情況對比

菌株1中，與伯杰氏細(xì)菌進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)其屬于大腸桿菌。菌株2與肺炎克雷伯菌情況相同（見表1）。

表1 兩組菌株生化試驗(yàn)情況

2.4 血清型鑒定和16S序列測定

對菌株1和菌株2進(jìn)行血清型鑒定，經(jīng)大腸桿菌診斷，其血清及玻璃板凝集試驗(yàn)出現(xiàn)大腸桿菌為菌株1，血清型為020，菌株2PCR的擴(kuò)增使用產(chǎn)物為1800 bp。

2.5 兩組藥敏試驗(yàn)結(jié)論

對菌株1、2兩組進(jìn)行24種藥物藥敏反應(yīng)，測試結(jié)果顯示：大腸桿菌對頭炮素類藥物有藥敏反應(yīng)，對苯唑啉高敏感（見表2）。

表2 兩組菌株藥敏情況（mm）

3 討論

肺炎克雷伯氏菌可引發(fā)羊等動物肺部炎癥，造成腦出血。因此，獸醫(yī)應(yīng)及時進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測，進(jìn)行確診，采取科學(xué)的防治措施，降低養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)損失。這種細(xì)菌檢測方法主要通過細(xì)菌培養(yǎng)進(jìn)行，如采用16s rDNA進(jìn)行診斷準(zhǔn)確度較高，但需在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，有一定的局限性。

大腸桿菌是一種傳染性較高的病菌。當(dāng)羊舍衛(wèi)生條件不達(dá)標(biāo)、生長環(huán)境差、羊舍溫度控制不好、飼喂不科學(xué)導(dǎo)致羊胃腸功能下降時可引發(fā)病變，傳播速度快，傳播能力強(qiáng)，一旦發(fā)病影響較大[4]。

本研究通過藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)菌情況較為相似；通過血清監(jiān)測發(fā)現(xiàn)血清型O2O對羊致病性等于0；藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩種細(xì)菌對喹諾酮類藥物敏感性較強(qiáng)，可采用諾氟沙星藥物對患羊進(jìn)行預(yù)防或治療。治療羊源性感染時，應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)的敏感程度，選擇敏感性較強(qiáng)的藥物進(jìn)行治療，保證治療效果。