焦文鵬，焦文靜，郭秀娟，馮軍花，張金艷*

(1.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院放一科，河北 石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050011)

肝癌是常見惡性腫瘤，發(fā)病率占癌癥發(fā)病率第六位[1]。肝癌的主要誘因為病毒性肝炎，但隨著人們生活方式的改變，酒精相關性肝癌已占有肝癌發(fā)病的30%[2-5]。盡管采用多種治療模式，肝癌的5年生存率仍僅為34%～50%[6-7]。早期診斷和治療是改善預后的主要方式[8-9]。筆者回顧我院于2015—2019年收治的酒精相關性肝癌患者，發(fā)現(xiàn)部分患者可不經(jīng)歷肝硬化階段直接進展為肝癌。尋找酒精性肝炎直接進展為肝癌的標志物可以提高此類患者的早期診斷。微小RNA(MicroRNA，miRNA)是近年來常用的腫瘤標志物，其可與目標mRNA結合，調節(jié)下游途徑[10-11]。本研究旨在研究miR-151a-3p在酒精性肝炎直接進展為肝癌中的作用機制，報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月1日—2019年12月31日我院收治的且經(jīng)病理證實為肝細胞癌的酒精相關性肝癌患者64例的病歷資料。其中男性58例，女性6例；年齡≥60歲34例，<60歲30例。根據(jù)篩選出的病歷信息，于病理科隨機選取5例酒精性肝炎/肝癌患者穿刺組織蠟塊，并根據(jù)性別和年齡配對原則，再隨機選取5例酒精性肝炎/肝硬化患者穿刺組織蠟塊，比較其miR-151a-3p表達水平。

1.2方法

1.2.1細胞系 肝癌細胞系HepG2、Bel-7402、MHCC97、Hep3B和肝正常細胞系HL-7702從中國細胞系資源基礎設施獲得，由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院保留和培養(yǎng)，將所有細胞置于具有10%胎牛血清(Gibco，美國)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco，美國)中培養(yǎng)。

1.2.2福爾馬林固定石蠟包埋組織提取總miRNA miR特異性福爾馬林固定石蠟包埋試劑盒購自比利時Qiagen分支機構。按照試劑說明進行以下操作：①將蠟塊分別切成5 μm、10 μm、20 μm、30 μm、40 μm厚。根據(jù)組織的大小，將2～16片置于無RNA酶的EP試管中，向EP試管中加入1 mL二甲苯，劇烈搖動10 s，在20 ℃以14 000 r/min的速度離心2 min，丟棄上清液，根據(jù)石蠟的含量重復上述步驟1～3次。②加入1 mL的無水乙醇，搖勻并混合，以14 000 r/min的速度離心2 min，丟棄上清液。③風干，加入240 μL蛋白激酶D緩沖液和10 L蛋白酶K，搖勻并混合，根據(jù)組織溶解情況在55 ℃孵育15 min，1、12、24、36、48 h。若組織不溶解時，于24 h加入10 L蛋白酶K，繼續(xù)孵育12～24 h，后在80 ℃孵育15 min。④加入500 L 紅細胞裂解緩沖液，搖勻并混合，將所有液體轉移至gDNA消除柱離心管中，以10 000 r/min的速度離心30 s，棄去離心管，保存上清液。⑤加入1.2 mL的無水乙醇，充分混合，將700 μL混合液轉移至miR特異性試劑盒最小洗脫液離心管，以1 000 r/min的速度離心15 s，棄去上清液，重復上述過程至所有樣品均離心。⑥加入500 L 藻紅蛋白緩沖液，以1 000 r/min的速度離心15 s，棄去上清液，重復以上步驟，但第二次離心2 min。⑦將miR特異性試劑盒最小洗脫液離心管放入新的收集管中，以14 000 r/min的速度離心5 min，棄去上清液。⑧將miR特異性試劑盒最小洗脫液離心管置于RNA收集管中，加入30 L的無RNase離心14 000 r/min，持續(xù)1 min，以溶解總RNA(包括miRNA)，使用紫外可見分光光度計測試質量和濃度。以上實驗數(shù)據(jù)重復3次。

1.2.3CCK-8實 準備90 μL肝癌細胞懸液，計數(shù)3×103個/孔，接種于96孔板中。細胞培養(yǎng)24 h后，向每個孔中添加10 μLLCCK-8增強溶液。于48 h和72 h時，在450 nm波長處測量吸光度(A)值，繪制曲線。以上實驗數(shù)據(jù)重復3次。

1.2.4實時定量RT-PCR RNA提取方法提取細胞總RNA(“細胞總”，指的是細胞的所有RNA)，根據(jù)反轉錄試劑盒的說明進行操作，qPCR反應條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，40個循環(huán)和72 ℃ 1 min，數(shù)據(jù)表示為倍數(shù)差，基于2-△△Ct的計算。以上實驗數(shù)據(jù)重復3次。

1.2.5流式細胞儀測定 將肝癌細胞以1×107個/L的密度接種于6孔板中。 培養(yǎng)24 h后，使用流式細胞儀檢測細胞周期。以上實驗數(shù)據(jù)重復3次。

1.2.6蛋白印跡分析 提取細胞蛋白，進行十二烷基硫酸鈉電泳，轉移到聚偏二氟乙烯膜上，孵育第一抗體過夜，并孵育第二抗體4 h，以增強化學發(fā)光超敏發(fā)光液發(fā)展。以上實驗數(shù)據(jù)重復3次。

1.2.7在肝癌細胞系中敲除miR-151a-3p 將肝癌細胞接種在6孔細胞培養(yǎng)皿中，并用慢病毒(si-miR-151a-3p)轉導24 h。于48 h使用0.8 mg/L嘌呤霉素進行選擇，直至平行實驗的所有親代細胞死亡，剩余活細胞是具有敲低的miR-151a-3p的穩(wěn)定的HCC細胞系。本研究中使用的敲除miR-151a-3p的序列是5′-CUAGACUGAAGCUCCUUGAG-G-3′(GeneChem，中國上海)。被miR-151a-3p擊倒的穩(wěn)定細胞系即為si-miR-151a-3p。以上實驗數(shù)據(jù)重復3次。

1.2.8熒光素酶報告實驗 預測ATM的3′-非翻譯區(qū)序列與miR-151a-3p相互作用，或合成預測的靶位點內的突變序列并將其插入pGL3對照熒光素酶報道載體(Promega，美國威斯康星州)。后產生pGL3-ATM-Wt和pGL3-ATM-Mut載體。將miR-151a-3p模擬物、pGL3、pGL3-ATM-Mut、pGL3-ATM-Wt質粒共轉染肝癌細胞48 h。隨后裂解細胞，通過熒光素酶檢測試劑盒(Promega)分別測定熒光素酶活性。以上實驗數(shù)據(jù)重復3次。

1.3統(tǒng)計學方法 應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，采用Fisher精確概率法確定miRNA與患者信息變量之間的關系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1酒精性肝癌患者的一般資料 所有酒精相關性肝癌患者均由病理證實為肝細胞癌，且除外感染病毒性肝炎。其中，酒精性肝炎經(jīng)酒精性肝硬化最終進展為肝癌44例；酒精性肝炎未經(jīng)歷肝硬化階段直接進展為肝癌20例。酒精性肝炎/肝癌患者年齡較酒精性肝炎/肝硬化/肝癌患者年輕，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同進展過程酒精相關性肝癌患者臨床比較Table 1 Clinical comparison of patients with alcohol-related liver cancer in different progression stages (例數(shù))

2.2兩組患者癌組織中miR-151a-3p表達水平比較 酒精性肝炎/肝癌患者癌組織中miR-151a-3p表達水平2.377±0.441顯著高于酒精性肝炎/肝硬化患者肝組織1.146±0.299，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.989，P=0.002)。

2.3肝癌細胞系中miR-151a-3p表達水平升高 評估m(xù)iR-151a-3p在4種肝癌細胞系和1種正常肝細胞系中的表達，結果表明miR-151a-3p 在4種常見肝癌細胞系中的表達顯著高于正常肝細胞系。而在肝癌細胞系中，HepG2中的表達最高。見表2。

表2 miR-151a-3p在不同肝癌細胞系和正常肝細胞系中的表達水平Table 2 The expression level of miR-151a-3p in different liver cancer cell lines and normal liver cell lines

2.4下調miR-151a-3p的影響 下調HepG2和Bel-7402中miR-151a-3p的表達水平，Si-miR-151a-3p(HepG2)細胞系和Si-miR-151a-3p(Bel-7402)細胞系中G0/G1期的細胞百分比明顯增加，而 S期和G2/M期的細胞明顯減少。見表3，4。

表3 HepG2細胞和Bel-7402細胞與其下調miR-151a-3p表達后miR-151a-3p表達水平比較Table 3 Comparison of miR-151a-3p expression levels in HepG2 cells and Bel-7402 cells and those after down-regulation of miR-151a-3p expression cells

表4 Bel-7402細胞與其下調miR-151a-3p表達后miR-151a-3p表達水平比較Table 4 Comparison of miR-151a-3p expression levels in Bel-7402 cells and those after down-regulation of miR-151a-3p expression cells

2.5下調miR-151a-3p抑制細胞周期的機制 與HepG2比較，Si-miR-151a-3p(HepG2)細胞中ATM的mRNA和蛋白表達水平增加，P53的mRNA表達水平增加，P-P53蛋白的表達水平增加，而Cyclin D1的mRNA和蛋白的表達水平下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同樣，與Bel-7402相比，Si-miR-151a-3p(Bel-7402)細胞中ATM的mRNA表達水平顯著增加，P53的mRNA表達水平顯著增加，而Cyclin D1的mRNA的表達水平顯著下降。見表5～8。

表5 HepG2細胞系ATM 、P53、Cyclin D1 mRNA表達水平Table 5 The mRNA expression levels of ATM, P53, and Cyclin D1 in HepG2 cell lines

表6 Bel-7402細胞系ATM 、P53、Cyclin D1 mRNA表達水平Table 6 The mRNA expression levels of ATM, P53, and Cyclin D1 in Bel-7402 cell lines

表7 HepG2細胞系ATM 、P53、Cyclin D1 蛋白表達水平Table 7 The protein expression levels of ATM, P53, and Cyclin D1 in HepG2 cell lines

表8 Bel-7402細胞系ATM 、P53、Cyclin D1 蛋白表達水平Table 8 The protein expression levels of ATM, P53, and Cyclin D1 in Bel-7402 cell lines

2.6miR-151a-3p調節(jié)細胞周期的機制 熒光素酶報告實驗結果顯示，在HepG2細胞系和Bel-7402細胞系中，相應的ATM-Mut構建體不再被miR-151a-3p抑制，表明miR-151a-3p是直接靶向ATM-WT的miRNA。見圖2、表9，10。

圖1 ATM RNA的假定的miR-151a-3p結合序列

表9 qRT-PCR檢測HepG2細胞系和Si-miR-151a-3p(HepG2)中ATM基因表達水平Table 9 qRT-PCR detection of ATM gene expression level in HepG2 cell lines and Si-miR-151a-3p(HepG2)cell lines

表10 qRT-PCR檢測Bel-7402細胞系和Si-miR-151a-3p(Bel-7402)中ATM基因表達水平Table 10 qRT-PCR detection of ATM gene expression level in Bel-7402 cell lines and Si-miR-151a-3p(Bel-7402)cell lines

3 討 論

大量長期飲酒對人體的DNA、蛋白質造成永久性損傷，增加促炎細胞因子釋放，減少抗腫瘤細胞的CD8+T細胞招募，從而促進免疫反應的抑制，導致肝癌的發(fā)生[12]。研究酒精性肝炎進展至肝癌的過程，有助于實現(xiàn)肝癌的早期診斷和治療。本研究于我院病案室篩選住院治療且經(jīng)病理證實為肝細胞癌的酒精相關性肝癌患者64例，其中44例為酒精性肝炎經(jīng)酒精性肝硬化，最終進展為肝癌；20例為酒精性肝炎，未經(jīng)歷肝硬化階段，直接進展為肝癌。對比臨床病歷特征，酒精性肝炎/肝癌患者年齡較酒精性肝炎/肝硬化/肝癌患者年輕。這說明其可能經(jīng)歷了不同的進展過程。

本研究對比5例酒精性肝炎/肝癌患者組織和5例酒精性肝炎/肝硬化患者組織中10種相關miRNA的表達，結果顯示，酒精性肝炎/肝癌患者組織中miR-151a-3p的表達水平顯著高于酒精性肝炎/肝硬化患者。因此，筆者認為miR-151a-3p可能在酒精性肝炎直接進展為肝癌的發(fā)病過程中起到重要作用。

為了進一步探討miR-151a-3p在酒精相關性肝癌中的作用，本研究進行了體外實驗。首先，驗證miR-151a-3p在肝癌組織中的表達水平。在4種常見的HCC細胞系和1種肝正常細胞系中檢測miR-151a-3p的表達水平，結果顯示，miR-151a-3p在4種肝癌細胞系中的表達均顯著高于肝正常細胞系，且在HepG2中的表達水平最高。本研究在2種肝癌細胞系中驗證miR-151a-3p的作用機制。在HepG2和Bel-7402中通過慢病毒下調miR-151a-3p表達水平，結果顯示，Si-miR-151a-3p(HepG2和Bel-7402)細胞系G0/G1期的細胞百分比顯著增加，而 S期和G2/M期的細胞明顯減少。實驗結果表明miR-151a-3p可以通過促進肝癌細胞進入細胞周期，從而促進肝癌的發(fā)生與發(fā)展。但其具體機制尚需進一步探索。

Liu等[13]研究顯示，miR-151a-3p可以通過抑制p53來促進鼻咽癌的增殖，遷移和侵襲。因此，本研究使用qRT-PCR和蛋白印跡分析檢測與細胞周期相關蛋白的mRNA和蛋白表達水平，結果表明，在Si-miR-151a-3p(HepG2和Bel-7402)細胞系中，ATM的mRNA和蛋白表達水平顯著增加，P53的mRNA表達水平顯著增加，P-P53蛋白的表達水平顯著增加，而Cyclin D1的mRNA和蛋白的表達水平顯著下降。共濟失調毛細血管擴張突變是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，通常被認為是一種腫瘤抑制因子[14-15]。ATM被激活以磷酸化不同細胞周期中的不同靶蛋白。P53是ATM基因的下游基因，是細胞信號通路的重要組成部分，主要在抑制細胞癌中發(fā)揮作用[16]。 P53抗腫瘤作用最重要的方法是阻滯細胞周期并誘導細胞凋亡[17-19]。此外，本研究構建了熒光素酶報告分子，顯示相應的ATM-Mut構建體不再受到miR-151a-3p的抑制，說明miR-151a-3p可以通過直接靶向ATM從而抑制其表達。本研究顯示miR-151a-3p在肝癌細胞中過表達，通過直接靶向ATM抑制P53，從而促進cyclin D1的表達，導致肝癌的進展。

綜上所述，部分酒精性肝炎患者可以不經(jīng)過肝硬化階段而直接進展為肝癌。miR-151a-3p在其中扮演重要角色，通過直接靶向ATM抑制P53，從而促進Cyclin D1的表達，導致肝癌發(fā)生、發(fā)展。