張俊光，張書麗，張會(huì)英，蘇艷文

(1.冀中能源峰峰集團(tuán)有限公司總醫(yī)院兒科，河北 邯鄲 056200；2.冀中能源峰峰集團(tuán)有限公司總醫(yī)院產(chǎn)科，河北 邯鄲 056200)

肺炎支原體肺炎主要是由肺炎支原體引發(fā)的肺部急性炎癥病變，是兒童中較為常見的肺部疾傳染病，能夠通過呼吸道進(jìn)行傳染，在人群較多的地方，傳染率更是高達(dá)50%[1]。其主要能夠?qū)獾郎掀ぜ?xì)胞產(chǎn)生黏附作用，造成氧化應(yīng)激損傷，同時(shí)釋放CARDS毒素，使氣道出現(xiàn)損傷[2]。近年來，隨著自然環(huán)境的不斷變化，使得該病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[3]。該病作為較強(qiáng)的傳染性疾病，臨床癥狀較為多變，隨著炎癥反應(yīng)的不斷加重，不僅會(huì)影響到患者呼吸系統(tǒng)，同時(shí)易引發(fā)腦炎、腎炎及心肌炎等多種疾病[4]。同時(shí)，隨著病情的加重，可導(dǎo)致多系統(tǒng)功能障礙的出現(xiàn)[5]。甲潑尼龍屬于中效的糖皮質(zhì)激素，其主要作用有穩(wěn)定細(xì)胞膜、促進(jìn)抗炎、抑制炎癥因子的釋放[6]。甲潑尼龍應(yīng)用在肺組織損傷中取得顯著效果，但通過建立小鼠模型治療肺炎支原體肺炎涉及肺組織通路機(jī)制的研究，目前尚未見報(bào)道。現(xiàn)基于肺炎支原體肺炎模型，分析不同劑量甲潑尼龍應(yīng)用中對(duì)小鼠肺組織Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)/核因子κB(nuclear factor κB ，NF-κB)通路的影響，旨在為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 選取40只SD健康雄性小鼠，由吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，年齡7～10月，平均(8.5±0.8)月；體重220～234 g，平均(226.9±4.7) g。在環(huán)境中相對(duì)濕度為50%～55%、溫度在(24.1±2.1)℃，對(duì)小鼠進(jìn)行喂養(yǎng)1周，光照時(shí)間在12 h/d。

本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)所批準(zhǔn)通過。

實(shí)驗(yàn)試劑、甲潑尼龍(NV 公司)；兔抗小鼠白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)抗體(Hyclone公司)；小鼠抗小鼠TLR4、NF-κB抗體(Gibco公司)；小鼠抗小鼠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，硫代巴比妥酸法檢測(cè)丙二醛(malondialdehyde,MDA)抗體(Sigma公司)；小鼠抗兔腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)抗體(Invitrogen公司)；正置熒光顯微鏡(日本Olympas公司)。

1.2方法

1.2.1建模及分組 參照蒙艷麗等[7]相關(guān)建肺炎支原體模型文獻(xiàn)，隨機(jī)選取10只小鼠作為正常小鼠組，進(jìn)行滴鼻0.1 mL蒸餾水。其余30只建立肺炎支原體肺炎小鼠模型，以乙醚對(duì)全部小鼠進(jìn)行輕度麻醉，后使用1 mL注射器對(duì)小鼠鼻腔進(jìn)行緩慢滴入1×107CCU/mL的MP菌液0.1 mL，并連續(xù)滴鼻3 d。在造模9 d后，采集小鼠血液進(jìn)行分離培養(yǎng)及PCR檢測(cè)肺炎支原體，確認(rèn)成功建立肺炎支原體模型。其中隨機(jī)選取10只小鼠為模型組，不做任何處理。其余20只進(jìn)行甲潑尼龍，分別為低劑量干預(yù)組、高劑量干預(yù)組。參照宋立成等[8]相關(guān)不同劑量甲潑尼龍干預(yù)方法對(duì)大鼠進(jìn)行干預(yù)，低劑量干預(yù)組對(duì)小鼠腹腔內(nèi)進(jìn)行注射0.4 mg/kg，高劑量干預(yù)組于小鼠腹腔內(nèi)進(jìn)行注射4 mg/kg。

1.2.2標(biāo)本制備 取各組小鼠尾部靜脈血2 mL,2 000 r/min離心處理15 min后分離上清液，在-80 ℃環(huán)境中保存待檢。對(duì)各組小鼠進(jìn)行麻醉處理后，斷頭法處死，取小鼠頸動(dòng)脈組織，之后固定在4%甲醛中，完全浸泡，于24 h后行常規(guī)石蠟包埋及連續(xù)切片。

1.2.3HE染色 首先將切片烤干，后進(jìn)行脫蠟處理，按照順序置入不同濃度的酒精中各進(jìn)行復(fù)水3 min。選擇應(yīng)用蘇木精進(jìn)行15 min染色，然后清洗3次，以鹽酸酒精分化進(jìn)行30 s處理，將其充分清洗后，以1%伊紅染色，酒精脫水處理，后脫蠟處理，待封片之后，顯微鏡觀察。

1.2.4TLR4、NF-κB表達(dá)檢測(cè) 將大鼠均抽取靜脈血，并放置在無添加劑真空試管中，在室溫下靜置30 min，將血液充分凝結(jié)。后在低速離心機(jī)內(nèi)，以4 ℃環(huán)境下進(jìn)行2 000 r/min轉(zhuǎn)速離心處理10 min，后以移液器移至1.5 mL無酶EP試管內(nèi)，使用300 μL的EP管進(jìn)行分裝，保存在-80 ℃冰箱中備用。以RT-PCR對(duì)TLR4、NF-κB表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，首先提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)其RNA純度、含量，逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得cDNA，設(shè)計(jì)引物序列，采用2-△△Ct方法計(jì)算TLR4、NF-κB表達(dá)，PCR引物以Primer Premier 6.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)(Invitrogen公司合成)。其中TLR4上引物為5′-TGGTTTACACGTCCA-TCGGT-3′,下游引物為5′-ATCAATGGTCACA-TCACATAGTCC-3′。NF-κB上引物為5′-AAAA-TGCCCCACGGTTATG-3′,下游引物為5′-ATTC-CTTTGCCTCC-3′。

1.2.5TLR4、NF-κB檢測(cè) 取小鼠肺部組織進(jìn)行研磨，采用蛋白裂解液提取總蛋白，以免疫組化法檢測(cè)TLR4、NF-κB水平，以PBS作為陰性對(duì)照，當(dāng)細(xì)胞膜或細(xì)胞漿呈棕黃色或棕褐色為CK19染色陽性信號(hào)。將組織蠟塊進(jìn)行石蠟切塊，將厚度切為4 μm，以常規(guī)脫蠟、脫水，進(jìn)行抗原修復(fù)，除去離子水孵化，并滴加TLR4、NF-κB為一抗，在4 ℃置放12 h，進(jìn)行2次PBS清洗，同時(shí)滴加聚合梅輔助劑，在37 ℃下水浴，進(jìn)行持續(xù)孵化，時(shí)間為20 min；2次PBS清洗，并進(jìn)行滴加IgG多聚體。在37 ℃下水浴，進(jìn)行持續(xù)孵化，時(shí)間為30 min。后計(jì)算出TLR4、NF-κB水平。

1.2.6TNF-α、IL-1β水平檢測(cè) 使用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)TNF-α、IL-1β水平，首先將血清置于室溫后，標(biāo)記酶標(biāo)板，制作標(biāo)準(zhǔn)品，然后取出試劑盒，選擇1∶2稀釋液對(duì)樣品稀釋；在反應(yīng)孔上選擇將稀釋好的待測(cè)血清和標(biāo)準(zhǔn)品100 μL/孔依次加入，在恒溫孵育箱中進(jìn)行濕育2 h，溫度為37 ℃；以專用的洗滌液對(duì)反應(yīng)板進(jìn)行3次清洗，后置入抗體工作液(1∶100倍稀釋后)，以100 μL/孔，在37 ℃恒溫孵育箱內(nèi)進(jìn)行濕育45 min；待繼續(xù)4次清洗反應(yīng)板后，將反應(yīng)孔中放入TMB溶液，規(guī)格為100 μL/孔，放置在37 ℃恒溫孵育箱中進(jìn)行濕育45 min，后在反應(yīng)孔中加入終止液100 μL/孔進(jìn)行終止反應(yīng)，以450 nm波長測(cè)定吸光度，顏色反應(yīng)深淺與TNF-α、IL-1β水平成正比，經(jīng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TNF-α、IL-1β水平。

1.2.7SOD檢測(cè) 應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD，首先取用聚苯乙烯試管，并分為測(cè)量管、對(duì)照管。提取樣品后，于上清中加蒸餾水，體積是上清的10倍，將樣品配制為濃度1%。測(cè)量管、對(duì)照管內(nèi)均加1.0 mL試劑盒中的試劑，在試劑1、2、3、4內(nèi)各加入0.1 mL，然后測(cè)量管加入樣品50 μL，在對(duì)照管內(nèi)加50 μL蒸餾水，待加樣后，將試管放入旋渦混勻器進(jìn)行充分混勻，在37 ℃恒溫水浴箱中存40 min。顯色：在對(duì)照管、測(cè)量管中各加2 mL顯色劑，室溫放置10 min。使用蒸餾水調(diào)零分光光度計(jì)算，選擇1 cm光徑條件下，以波長550 nm比色。

1.2.8MDA檢測(cè) 取用聚苯乙烯試管，將其分為標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)空白管及測(cè)量管、測(cè)量空白管，分別在標(biāo)準(zhǔn)管中加入10 nmol/L四乙氧基丙烷0.1 mL與試劑盒試劑，標(biāo)準(zhǔn)空白管加0.1 mL的無水乙醇與試劑，測(cè)量管加入肌肉組織勻漿0.1 mL的上清液與試劑，測(cè)量空白管加肌肉組織勻漿0.1 mL的上清液與試劑。加樣完畢后，搖動(dòng)試管架將其混勻，標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)空白管、測(cè)量管均置入3 mL的硫代巴比妥酸與1 mL的雙蒸水，測(cè)量空白管內(nèi)置入硫代巴比妥酸3 mL與50%冰醋酸 1 mL。所有試管置入旋渦混勻器混勻，將試管口使用用保鮮薄膜扎緊，用針頭刺出一個(gè)小孔，在95 ℃進(jìn)行水浴40 min，使用后流水進(jìn)行冷卻，然后在4 ℃，以3 500～4 000 r/min離心處理10 min，將上清液使用移液器吸取，加入比色皿內(nèi)待檢，使用蒸餾水調(diào)零分光光度計(jì)算出MDA值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)、SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1HE染色 正常小鼠組肺泡及支氣管結(jié)構(gòu)清晰且完整，且未出現(xiàn)肺泡間隔增厚及炎性細(xì)胞侵襲；模型組肺泡出現(xiàn)融合、破裂，氣管和肺間質(zhì)被較多淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤；低劑量干預(yù)組肺泡及支氣管結(jié)構(gòu)完整，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤以及少量分泌物；高劑量干預(yù)組肺泡及支氣管結(jié)構(gòu)得到改善較為顯著(圖1)。

圖1 各組間小鼠肺組織病理學(xué)變化(HE ×200)

2.2各組TLR4、NF-κB表達(dá)比較 各組間小鼠TLR4、NF-κB表達(dá)進(jìn)行比較，相比正常小鼠組，模型組、低劑量干預(yù)組與高劑量干預(yù)組TLR4、NF-κB表達(dá)均較高，低劑量干預(yù)組與高劑量干預(yù)組TLR4、NF-κB表達(dá)低于模型組，且高劑量干預(yù)組TLR4、NF-κB表達(dá)低于低劑量干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組TLR4、NF-κB表達(dá)比較Table 1 Comparison of the expression of TLR4 and NF-κB among groups

2.3TLR4、NF-κB水平比較 相比正常小鼠組，模型組、低劑量干預(yù)組與高劑量干預(yù)組TLR4、NF-κB水平均較高，低劑量干預(yù)組與高劑量干預(yù)組TLR4、NF-κB水平低于模型組，且高劑量干預(yù)組TLR4、NF-κB水平低于低劑量干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組間TLR4、NF-κB水平比較Table 2 Comparison of TLR4 and NF-κB levels among groups

2.4TNF-α、IL-1β水平比較 相比正常小鼠組，模型組、低劑量干預(yù)組與高劑量干預(yù)組TNF-α、IL-1β水平均較高，低劑量干預(yù)組與高劑量干預(yù)組TNF-α、IL-1β水平低于模型組，且高劑量干預(yù)組TNF-α、IL-1β水平低于低劑量干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組間小鼠TNF-α、LI-1β水平進(jìn)行比較Table 3 Comparison of the levels of TNF-α and LI-1β among groups

2.5MDA、SOD水平比較 相比正常小鼠組，模型組、低劑量干預(yù)組與高劑量干預(yù)組MDA水平較高、SOD水平均較低，低劑量干預(yù)組與高劑量干預(yù)組MDA水平低于、SOD水平高于模型組，且高劑量干預(yù)組MDA水平低于、SOD水平高于低劑量干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組間小鼠MDA、SOD水平進(jìn)行比較Table 4 Comparison of the levels of MDA and SOD of mice in each group

3 討 論

當(dāng)肺炎支原體造成肺部急性炎癥病變即肺炎支原體肺炎，是兒童人群中較為常見的一種肺炎，近年來其發(fā)病率有著明顯的升高的趨勢(shì)[8]。肺炎支原體肺炎具有較高的傳染性，主要通過呼吸道進(jìn)行傳染，經(jīng)血液流經(jīng)全身[9]。在較多人群中，傳染率高達(dá)50%。在肺炎支原體肺炎中，當(dāng)大量炎癥因子的釋放，進(jìn)而使患者病情加重，病死率得到提升[10]。多數(shù)學(xué)者研究表明，TLR4/NF-κB是較為經(jīng)典的信號(hào)傳導(dǎo)通路，在炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激中均發(fā)揮重要作用[11]。TLR4能夠激活NF-κB進(jìn)而使炎癥因子的釋放，當(dāng)TLR4介導(dǎo)信號(hào)通路激發(fā)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而造成炎癥與抗炎癥反應(yīng)失衡及組織損傷。在肺炎中，糖皮質(zhì)激素能夠有效抑制炎癥反應(yīng)。甲潑尼龍屬于一類中效糖皮質(zhì)激素，具有穩(wěn)定細(xì)胞膜、抗炎及非特異性免疫抑制的作用[12]。能夠有效做到消除肺間質(zhì)水腫，同時(shí)能夠減輕肺組織細(xì)胞的凋亡。

Toll樣受體作為一類的跨細(xì)胞膜受體蛋白。其能夠識(shí)別病原體相關(guān)分子模式，同時(shí)引發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)，并使得炎癥介質(zhì)釋放[13]。目前，在Toll樣受體中共發(fā)現(xiàn)13個(gè)，其中TLR4在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞等廣泛分布。在肺炎中，TLR4呈高表達(dá)狀態(tài)，當(dāng)NF-κB被TLR4所激活，對(duì)組織造成嚴(yán)重?fù)p傷，是出現(xiàn)死亡的主要原因[14]。在炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激中TLR4/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路過表達(dá)發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究顯示，TLR4單克隆抗體能夠明顯減輕小鼠肺部損傷，通過干預(yù)TLR4信號(hào)通路，能夠有效減輕炎癥反應(yīng)[15]。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用甲潑尼龍對(duì)肺炎支原體肺炎模型小鼠進(jìn)行干預(yù)，TLR4、NF-κB表達(dá)較低，且高劑量效果較為顯著，說明在肺炎支原體肺炎模型小鼠應(yīng)用甲潑尼龍，抑制TLR4/NF-κB通路表達(dá)，顯著改善肺組織損傷。

在肺炎支原體肺炎中，炎癥反應(yīng)在其中發(fā)揮重要作用。TNF-α能夠誘導(dǎo)并放大炎癥反應(yīng)，當(dāng)細(xì)胞接受到炎癥信號(hào)，TNF-α?xí)杆俚玫结尫臶16]。相關(guān)研究顯示，當(dāng)TNF-α初次釋放，能夠與其他炎癥細(xì)胞結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng)機(jī)體內(nèi)免疫應(yīng)激；當(dāng)TNF-α再次釋放，正反饋放大炎癥反應(yīng)，能夠促進(jìn)其他炎癥因子的生成與釋放[17]。IL-1β屬于一類較為重要的促炎因子，能夠與IL-1RI受體結(jié)合，進(jìn)一步造成NF-κB的下游活化[18]。同時(shí)能夠?qū)е耇NF-α分泌上升，進(jìn)而誘導(dǎo)一系列炎癥相關(guān)分子的表達(dá)。相關(guān)研究顯示，通過對(duì)IL-1β信號(hào)傳導(dǎo)的阻斷，其他炎性因子的效應(yīng)能夠有效得到改善[19]。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用甲潑尼龍對(duì)肺炎支原體肺炎模型小鼠進(jìn)行干預(yù)，TNF-α、IL-1β水平較低，且高劑量效果較為顯著，說明在肺炎支原體肺炎模型小鼠應(yīng)用甲潑尼龍，抑制炎癥反應(yīng)較為顯著。

氧化應(yīng)激在疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用。當(dāng)機(jī)體被病原體入侵，能夠直接造成呼吸道上皮細(xì)胞與黏膜損傷，進(jìn)而使氧自由基增多，能夠?qū)е聶C(jī)體氧化/抗氧化出現(xiàn)失衡，進(jìn)而引發(fā)氧化應(yīng)激的發(fā)生[20]。SOD是生物體內(nèi)較為主要的自由基清除劑，能夠使超氧陰離子歧化成過氧化氫，在氧化物水解酶作用下成為水分子，具有清除多種來源自由基，并對(duì)機(jī)體發(fā)揮保護(hù)的作用[21]。MDA屬于脂質(zhì)過氧化物所分解的一種產(chǎn)物，其水平能夠反映機(jī)體細(xì)胞因自由基產(chǎn)生的損傷程度，對(duì)MDA相關(guān)測(cè)定能夠得知脂質(zhì)過氧化水平[22]。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用甲潑尼龍對(duì)肺炎支原體肺炎模型小鼠進(jìn)行干預(yù)，MDA水平較低、SOD水平較高，且高劑量效果較為顯著，說明在肺炎支原體肺炎模型小鼠應(yīng)用甲潑尼龍，顯著改善氧化應(yīng)激。

綜上所述，在肺炎支原體肺炎模型小鼠中，應(yīng)用甲潑尼龍能夠顯著改善出現(xiàn)的肺組織損傷，抑制TLR4/NF-κB通路表達(dá)，降低炎癥反應(yīng)程度，改善氧化應(yīng)激，且高劑量效果較為顯著。