劉 瑋 綜述，路 穎，于慶潭△ 審校

1.海軍青島特勤療養(yǎng)中心檢驗科，山東青島 266071；2.中國人民解放軍海軍第971醫(yī)院檢驗科，山東青島 266071

生物戰(zhàn)是指在戰(zhàn)爭場景中故意使用生物制劑(如細(xì)菌、病毒、立克次體、衣原體、真菌和毒素)作為武器，生物戰(zhàn)病原微生物可能比其他常規(guī)武器系統(tǒng)更致命，很小的數(shù)量也可能造成大規(guī)模傷亡[1]。生物武器是指裝有生物戰(zhàn)病原微生物及傳播媒介的各種施放裝置的總稱，最初的生物戰(zhàn)病原微生物多為細(xì)菌，隨著科技的進(jìn)步，生物戰(zhàn)病原微生物發(fā)展為多種病原微生物及毒素。生物戰(zhàn)以其較低的經(jīng)濟(jì)成本、大規(guī)模的效應(yīng)面積、難以預(yù)估的心理負(fù)面效應(yīng)，很有可能成為未來戰(zhàn)爭的主要方式。從2003年嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒及2012年中東呼吸綜合征冠狀病毒的暴發(fā)可以明顯看出，傳染病病原體的敏感、特異和快速診斷對于確定陽性病例、追蹤其接觸者、發(fā)現(xiàn)病毒來源及最終使控制感染的措施合理化至關(guān)重要[2]?；仡櫸覈箵粜滦凸跔畈《痉窝?COVID-19)阻擊戰(zhàn)的經(jīng)驗教訓(xùn)，及早確診和隔離是制勝的關(guān)鍵，更是充分說明了病原微生物的早期檢測和鑒定對于打贏生物戰(zhàn)的重要性。2020年新型冠狀病毒的全基因組測序使科學(xué)家們在短期內(nèi)就設(shè)計出了檢測方案來檢測受感染人群中的病原體，并且為病毒的系統(tǒng)發(fā)育研究提供了參考，使研究者對病毒的傳播途徑有了快速、準(zhǔn)確的判斷[3-4]。隨著全球生物安全態(tài)勢的不斷變化，如果未來生物戰(zhàn)中使用類似病原微生物來作為武器將造成非常嚴(yán)重的后果。

1 分子生物學(xué)技術(shù)在生物戰(zhàn)病原微生物檢測中的技術(shù)優(yōu)勢

傳統(tǒng)微生物檢測方法費(fèi)時、費(fèi)力，無法滿足快速檢測的需求，隨著以基因診斷為基礎(chǔ)的各種分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)代分子生物學(xué)對微生物的認(rèn)識，從對微生物外部結(jié)構(gòu)、生物特性的研究和分析繼而轉(zhuǎn)向?qū)ξ⑸飪?nèi)部基因的探究?，F(xiàn)代分子生物學(xué)通過利用核酸探針技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、基因芯片技術(shù)、下一代測序技術(shù)等在遺傳物質(zhì)DNA和RNA分子水平對微生物進(jìn)行檢測，已經(jīng)成為一種重要的微生物檢測方法[5]。如果在未來的生物戰(zhàn)過程中應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行檢驗檢疫，將極大地縮短檢驗時間，并能明顯提高檢驗精度。

2 分子生物學(xué)技術(shù)在生物戰(zhàn)病原微生物檢測中的應(yīng)用

2.1核酸探針技術(shù) 隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的不斷進(jìn)步,發(fā)展出了靈敏度高、特異性好、方便快捷的核酸探針技術(shù)。核酸探針技術(shù)也稱為基因診斷技術(shù)，該技術(shù)是利用微生物基因中DNA或RNA的堿基互補(bǔ)原理，利用生物標(biāo)記的特異核苷酸序列的單鏈 DNA或RNA片段作為探針,通過核酸雜交技術(shù)對病原微生物核酸、蛋白質(zhì)分子進(jìn)行快速檢測，從而達(dá)到快速鑒定相關(guān)病原微生物的目的[6]。目前常用的探針雜交方法主要有:DNA印跡雜交、RNA印跡雜交和蛋白質(zhì)印跡雜交，用于檢測標(biāo)本中的DNA、RNA或相關(guān)蛋白質(zhì)分子的基因，從而對感染性病原體進(jìn)行檢測[7]。核酸雜交技術(shù)可一次性對多種基因的多個位點進(jìn)行快速基因型鑒定，具有檢測信息量大的特點，在未來生物戰(zhàn)病原微生物檢測中應(yīng)用前景極大。

2.2PCR PCR是在聚合酶的催化下由特定引物(寡核苷酸)介導(dǎo)的特異性基因片段體外酶促的擴(kuò)增技術(shù)。在過去一個世紀(jì)里，很少有發(fā)明能與PCR的重要性相提并論，因為它徹底改變了生物和遺傳研究。PCR作為傳染病診斷工具的有用性在1987年的檢測中得到證明，并在后來臨床上被廣泛應(yīng)用于檢測病毒和細(xì)菌感染的微生物學(xué)領(lǐng)域[8]。

反轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)是一種高度特異和敏感的傳染病檢測診斷方法，由于這種方法是基于核酸的檢測，在抗擊COVID-19阻擊戰(zhàn)中發(fā)揮了重要作用，它能夠通過檢測患者標(biāo)本中的新型冠狀病毒核糖核酸來早期診斷COVID-19[9]。目前，COVID-19的確診主要依靠新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒熒光定量PCR,該試劑盒采用多重PCR與RT-PCR相結(jié)合的方法,對新型冠狀病毒感染疑似病例的鼻咽拭子、口咽拭子及痰液標(biāo)本中新型冠狀病毒的相關(guān)基因進(jìn)行檢測[10]。隨著疫情的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)一種簡單方便的收集患者標(biāo)本的方法取代痛苦的鼻咽拭子收集過程，降低衛(wèi)生從業(yè)人員在標(biāo)本收集過程中感染的風(fēng)險，是臨床一線醫(yī)務(wù)人員的迫切需要。在這種情況下，羅格斯臨床基因組實驗室提出了開發(fā)一個基于RT-PCR的想法，他們開發(fā)了一種檢測試劑盒，該試劑盒可以檢測唾液中新型冠狀病毒的核糖核酸[11]。

針對生物戰(zhàn)中多樣化的生物戰(zhàn)病原微生物，現(xiàn)代分子生物學(xué)PCR能夠滿足各種病原微生物的快速檢測需求。

2.3基因芯片技術(shù) 基因芯片技術(shù)又稱為DNA微陣列或DNA芯片,它是在基因探針的基礎(chǔ)上研制出來的,根據(jù)堿基互補(bǔ)的原理,利用基因探針到基因混合物中識別特定基因。利用顯微點樣或原位合成技術(shù)，將大量 DNA探針按照指定順序和密度固定在載體(如硝酸纖維素膜、尼龍膜、塑料片等)的表面，然后與熒光染料或生物素標(biāo)記的核酸分子進(jìn)行雜交，并分析獲取標(biāo)記物的熒光或生物信號，從而獲得待測樣品中相關(guān)基因的表達(dá)信息[12]。

目前，基因芯片技術(shù)分為傳統(tǒng)芯片和可視化芯片兩大類。傳統(tǒng)基因芯片具有高通量、同步檢測大量樣品，核素、熒光或生物素標(biāo)記的放大效應(yīng)及減少外界因素干擾等優(yōu)點；可視化基因芯片靈敏度高、操作簡單，能夠更明顯地提高病原微生物的檢測速度和效率[13]。基因芯片技術(shù)在生物戰(zhàn)病原微生物檢測中能快速高通量檢測病原微生物的核酸，在病原微生物基因診斷研究中意義重大。

2.4微流體技術(shù) 以RNA為遺傳核心物質(zhì)的病毒可導(dǎo)致埃博拉、丙型肝炎、流行性感冒、嚴(yán)重急性呼吸綜合征和脊髓灰質(zhì)炎等疾病。冠狀病毒是包膜的單鏈RNA病毒，可導(dǎo)致人類和動物疾病，曾導(dǎo)致了3次流行病大暴發(fā):2002-2003年的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒，2012年的中東呼吸綜合征冠狀病毒，以及2019年的新型冠狀病毒[14]。由于RNA病毒的高效傳染性，未來不排除以RNA病毒作為生物戰(zhàn)病原微生物進(jìn)行大規(guī)模生物戰(zhàn)的可能。

采用快速定量PCR檢測RNA病毒是常規(guī)做法，RT-PCR由于其具備靈敏度高、特異性好和通量高的特點，現(xiàn)已成為大流行暴發(fā)時主要的病毒檢測技術(shù),但其需要配套的生物安全實驗室作為技術(shù)平臺，無法實現(xiàn)便攜、可移動及現(xiàn)場快速檢測的要求[15]。一種更快速、易于使用和廉價的診斷方法——微流體技術(shù)，能夠在30 min內(nèi)完成檢測，有望成為未來RNA病毒類病原體檢測的新方法。

微流體技術(shù)以前曾用于檢測甲型流感病毒H1N1、寨卡病毒、甲型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒和諾如病毒等核糖核酸病毒，結(jié)果令人滿意。據(jù)報道，在集成有可控微磁場的微流控芯片上進(jìn)行核酸雜交是一種同時檢測和分型多種流感病毒的快速方法，甲型流感病毒H1N1、H3N2和H9N2亞型可在80 min內(nèi)同時檢測，檢測限分別約為0.21、0.16和0.12 nm[16]。因此，微流體技術(shù)可以成為一個可靠的技術(shù)平臺，具有快速診斷和分型病毒的能力。病毒抗體檢測常用的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)通常需要幾個小時才能完成，但將這種方法與微流體系統(tǒng)相結(jié)合，可以實現(xiàn)高效快速的診斷。有研究使用ELISA微流控系統(tǒng)在60 min內(nèi)完成亨德拉病毒IgG抗體檢測；在另一項研究中，在基于ELISA的微流控平臺的幫助下，檢測禽流感病毒僅需1.5 h；基于夾心免疫測定的微流體裝置也被應(yīng)用于流行性感冒的快速檢測[17-19]。目前，主要應(yīng)用的有基于紙張和基于渠道的兩種不同的微流體裝置：紙張工具由一系列親水性纖維素或硝化纖維制成，通過吸收引導(dǎo)紙張中的液體；基于渠道的微流體裝置可以使用4種主要方法來制造，包括層壓、模制、3D打印和納米制造[20]。

微流體系統(tǒng)為許多診斷測試提供了一個平臺，包括RT-PCR、巢式PCR、核酸雜交、ELISA等，有望成為更快、更便宜、更易于使用、靈敏度更高的檢測方法。因此,微流體設(shè)備很有可能成為傳統(tǒng)檢測病毒RNA的替代方法，在未來生物戰(zhàn)RNA類病毒病原體檢測中，微流體系統(tǒng)將發(fā)揮巨大作用。

2.5下一代測序技術(shù) 過去20年高通量DNA測序方法發(fā)展迅速，新方法不斷商業(yè)化，以較低成本對大基因組進(jìn)行高通量測序的需求引發(fā)了下一代測序技術(shù)，下一代測序技術(shù)是一種允許數(shù)百萬個DNA或RNA序列同時測序的技術(shù)[21]。與傳統(tǒng)測序法比較，下一代測序技術(shù)的優(yōu)勢包括樣品復(fù)用的更高吞吐量、檢測低頻變異的更高靈敏度、高樣品量的更快周轉(zhuǎn)時間和更低的成本。

下一代測序技術(shù)也稱為大規(guī)模并行測序或高通量測序，“下一代”一詞意味著DNA測序技術(shù)的下一步發(fā)展，主要包括第2代和第3代測序方法[22]。第2代測序方法可分為兩大類，即雜交測序法和合成測序法，第2代測序反應(yīng)通常在小室中的納米體、微粒體上并行運(yùn)行，因此，每對基因測序的成本比較低廉，同時技術(shù)的不斷改進(jìn)和檢測儀器的小型化正在進(jìn)一步降低其成本。第3代測序以單分子測序和納米孔測序為主，不需要進(jìn)行核酸擴(kuò)增，讀長明顯優(yōu)于第2代測序，與第2代測序方法相比，第3代測序方法旨在對長DNA和RNA分子進(jìn)行測序[23]。

下一代測序技術(shù)相對于經(jīng)典Sanger測序的主要優(yōu)勢是:(1)高通量能力，可以并行完成數(shù)億個測序反應(yīng)，使整個細(xì)菌基因組的完全測序只需一兩次儀器運(yùn)行；(2)單一方案可適合于所有微生物的鑒定和基因分型；(3)在無細(xì)胞系統(tǒng)中，完全依賴于文庫的制備，消除了DNA克??；(4)不需要關(guān)于特定基因/基因組序列的先驗知識，因為高溫超導(dǎo)可以讀取隨機(jī)分布在整個基因組中的DNA模板，然后可以應(yīng)用從頭基因組組裝；(5)不需要分離和培養(yǎng)感興趣的微生物，這是一個特別關(guān)鍵的方面，因為許多菌株不能在培養(yǎng)基中生長，這使能夠鑒定以微量存在的微生物及那些以前用常規(guī)方法未檢測到的微生物；(6)成本和周轉(zhuǎn)時間減少。下一代測序技術(shù)的主要缺點與數(shù)據(jù)存儲需要電腦內(nèi)存空間大、生物信息學(xué)分析技術(shù)復(fù)雜、需要專門學(xué)?；蛴蓪I(yè)人士進(jìn)行有關(guān)[24]。

生物戰(zhàn)病原微生物可以包括許多常見和不常見的病原體，從病毒到細(xì)菌、真菌和寄生蟲，假設(shè)使用常規(guī)的分子檢測，如PCR可以針對許多特定目標(biāo)生物的單獨檢測，但可能遺漏罕見的病原體或使用與所涉及的病原體不匹配的引物，因而降低了檢測的靈敏度和檢出效率[25]。而下一代測序技術(shù)不僅可以高通量對多種可能的病原微生物進(jìn)行檢測，同時還可以通過對測序讀數(shù)的計數(shù)提供關(guān)于樣品中生物體水平的定量或半定量數(shù)據(jù)，這對于生物戰(zhàn)病原微生物種類的確定非常有幫助。同時，隨著DNA測序技術(shù)的進(jìn)步，未來將更快、更準(zhǔn)確地進(jìn)行測序，測序平臺較小、需要較少的動力、較少的試劑和維護(hù)，有利于將測序技術(shù)應(yīng)用于未知生物的檢測和生物戰(zhàn)病原微生物的研究工作中。

3 各種分子生物學(xué)技術(shù)對比分析

生物戰(zhàn)病原微生物普遍具有高傳染性,能形成突發(fā)大規(guī)模疫情,對比2020年10月17日通過、自2021年4月15日起施行的《中華人民共和國生物安全法》，生物安全已經(jīng)不僅僅局限于生物戰(zhàn)等特殊戰(zhàn)場，更是上升到了國家安全的層面。因此，對于未來可能出現(xiàn)的威脅國家安全和戰(zhàn)場勝利的生物戰(zhàn)病原微生物早期、快速、準(zhǔn)確的檢測顯得尤為重要。下面將對上述分子診斷技術(shù)——核酸探針技術(shù)、PCR、微流體技術(shù)、基因芯片技術(shù)及下一代測序技術(shù)在生物戰(zhàn)病原微生物檢測中應(yīng)用的優(yōu)缺點進(jìn)行總結(jié)和比較：核酸探針技術(shù)具有可一次性對多種基因的多個位點進(jìn)行快速基因型鑒定，具有特異性強(qiáng)、檢測速度快、檢測信息量大的特點；核酸探針技術(shù)檢測時存在耗時長、成本高、操作煩瑣、工作量大等缺點，限制了其在生物戰(zhàn)病原微生物檢測中的應(yīng)用，目前核酸探針技術(shù)主要被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前診斷過程中。

PCR不僅具有較高的靈敏度和特異度，還能區(qū)分病原微生物的類型和亞型，適合于多種類型的病原微生物；其缺點在于僅適合于已知的病原微生物，對于新發(fā)和未知的病原微生物沒有辦法設(shè)計相應(yīng)的引物，一般在基因測序技術(shù)明確了生物戰(zhàn)病原微生物的種類和基因序列之后，可以作為大規(guī)模篩查的工具。

基因芯片技術(shù)在生物戰(zhàn)病原微生物檢測中的應(yīng)用優(yōu)勢在于能夠快速高通量檢測病原微生物的核酸，并且操作簡單、自動化程度高；其缺點在于目前制作基因芯片成本高、價格昂貴、對操作人員的技術(shù)要求較高，并且具有重復(fù)性差的缺點，使其應(yīng)用范圍受到很大的限制。由于基因芯片技術(shù)的上述優(yōu)點和缺點，在未來生物戰(zhàn)病原微生物檢測中，基因芯片不能作為常規(guī)檢測方法，但是可作為科研的研究手段對生物戰(zhàn)病原微生物的生物性狀、基因特點進(jìn)行深入分析。

微流體技術(shù)以其小型化、便攜式裝置非常適合在生物戰(zhàn)病原微生物檢測中發(fā)揮作用，因為這些自動化的、精確的和成本有效的微流體技術(shù)診斷設(shè)備不需要受過專業(yè)訓(xùn)練的醫(yī)療專家，并且可以由一般軍隊醫(yī)療人員在現(xiàn)場使用；但微流體技術(shù)目前主要應(yīng)用于病毒的檢測方面，應(yīng)用范圍比較窄，并且其對專業(yè)技術(shù)的要求比較高，需要醫(yī)務(wù)人員和工程師的全力配合。因此，微流體技術(shù)以其快速、簡便、高效的檢測能力，在未來生物戰(zhàn)病原微生物的檢測過程中可以選擇性應(yīng)用于病毒檢測方面。

下一代測序技術(shù)在新發(fā)病原體檢測方面的優(yōu)勢是可以快速、經(jīng)濟(jì)、精確、高通量對多種可能的病原微生物進(jìn)行檢測，并對新發(fā)的病原微生物進(jìn)行鑒定，為臨床篩查、診治贏得了寶貴時間；下一代測序技術(shù)的缺點是檢測樣品中存在的微生物污染物、用于處理的試劑殘留或?qū)嶒炇噎h(huán)境的影響，這可能使結(jié)果的分析和解釋變得復(fù)雜。在臨床標(biāo)本的常規(guī)采集過程中，即使對身體中可能無菌的部位進(jìn)行活組織檢查也會被無意污染，包括采樣過程中皮膚菌群的污染或口腔菌群的污染[26]。因此，需要嚴(yán)格遵守試劑和工作流程的質(zhì)量控制程序，以保持盡可能無菌和無核酸的測試環(huán)境，使用陰性質(zhì)控品、試劑評估和定期刷檢來確保實驗室和樣品交叉污染不會產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

目前，國內(nèi)外均在積極研制簡便、實用、可攜帶的便攜式生物戰(zhàn)病原微生物檢測箱，主要集中在實用新型發(fā)明專利中，但其核心還是檢測技術(shù)的更新，如何將更快、更便捷、更準(zhǔn)確、更經(jīng)濟(jì)的檢測技術(shù)應(yīng)用于生物戰(zhàn)病原微生物的檢測是未來的研究方向。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展，技術(shù)不斷成熟，核酸探針技術(shù)、PCR、微流體技術(shù)、基因芯片技術(shù)及下一代測序技術(shù)等分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)在臨床診治中得到廣泛應(yīng)用，如果能夠正確將各種不同的分子生物學(xué)技術(shù)加以合理應(yīng)用，分子生物學(xué)技術(shù)將在未來生物戰(zhàn)病原微生物的檢測檢疫中發(fā)揮十分重要的作用。