楊博鑫，楊 碩 綜述，崔麗艷 審校

北京大學(xué)第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100191

急性腎損傷(AKI)是由多種病因和病理生理機(jī)制引起的致死率很高的疾病，以腎功能迅速下降為特點(diǎn)，同時(shí)伴有代謝物潴留和水電解質(zhì)和酸堿平衡失衡。臨床上AKI主要發(fā)生于膿毒血癥、急性缺血或缺氧后、服用腎毒性藥物等情況。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，AKI發(fā)病率約為0.5%，住院患者發(fā)病率約為5.0%，重癥監(jiān)護(hù)病房患者發(fā)病率為30%～50%[1]。由于對(duì)AKI的修復(fù)機(jī)制不清楚，所以治療手段有限[2]。臨床實(shí)踐中排除病因和腎臟替代治療是目前主要的治療策略，但是AKI病死率仍然很高，為25%～80%[2]。因此，找到一種更加有效的AKI治療手段，對(duì)降低患者病死率、改善預(yù)后至關(guān)重要。

近年來(lái)，干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)、細(xì)胞治療等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，干細(xì)胞的作用包括抗凋亡、抗腫瘤和新生血管作用等。已證實(shí)不同來(lái)源的干細(xì)胞可以改善AKI患者腎功能和腎臟病理形態(tài)，但是在臨床應(yīng)用中仍存在問(wèn)題。例如，胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用存在倫理問(wèn)題，骨髓和脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞取材有創(chuàng)且相對(duì)較困難，原料稀有，成本較高。而尿源性干細(xì)胞 (USCs))有干細(xì)胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，且從健康人尿液中即可提取，取材簡(jiǎn)單，成本較低，與泌尿系統(tǒng)高度同源，通常不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，因此，其在泌尿系統(tǒng)疾病的治療中有非常廣闊的應(yīng)用前景。

1 USCs的來(lái)源、分離與鑒定

USCs是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的自體干細(xì)胞。體外實(shí)驗(yàn)表明，USCs可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、功能上皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等[3]。USCs還可以通過(guò)分泌多種營(yíng)養(yǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子和肝臟生長(zhǎng)因子等產(chǎn)生旁分泌效應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)，同時(shí)，USCs還具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和誘導(dǎo)周圍細(xì)胞旁分泌效應(yīng)的能力[4]。動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)，利用USCs治療可以有效減少組織損傷，促進(jìn)組織修復(fù)，同時(shí)改善器官組織功能[5]。USCs作為新型的干細(xì)胞來(lái)源，由于其在組織損傷修復(fù)中的優(yōu)勢(shì)，已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。

1.1USCs的來(lái)源 ZHANG等[6]于2008年從100 mL無(wú)菌尿液中成功提取分離出2～7個(gè)祖細(xì)胞，命名為“尿源祖細(xì)胞”，隨后發(fā)現(xiàn)這類細(xì)胞有類似間充質(zhì)干細(xì)胞跨胚層多向分化的特征，所以改命名為“尿源性干細(xì)胞”。有研究將男性腎臟移植入女性體內(nèi)后收集女性患者的USCs，發(fā)現(xiàn)其USCs中含有Y染色體，由此說(shuō)明USCs來(lái)源于腎臟[7]。

目前，USCs的培養(yǎng)方法是首先將尿液裝入50 mL無(wú)菌離心管中，離心力400×g，離心10 min，其目的是去除尿液中脫落的上皮細(xì)胞和可能對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾的物質(zhì)。磷酸鹽緩沖液(PBS)潤(rùn)洗后，將沉淀懸浮在DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，同時(shí)在培養(yǎng)基中補(bǔ)充加入10%胎牛血清、10 ng/mL人類表皮生長(zhǎng)因子、2 ng/mL血小板源性生長(zhǎng)因子、1 ng/mL轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、2 ng/mL纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、0.5 μmol/mL氫化可的松、25 μg/mL胰島素、20 μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、549 ng/mL腎上腺素、50 ng/mL三碘甲狀腺原氨酸和20 U/mL抗菌藥物。將細(xì)胞懸液移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%CO2潮濕環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞[8]。開(kāi)始培養(yǎng)1～3 d后，培養(yǎng)基表面會(huì)漂浮大量死細(xì)胞和血細(xì)胞，所以前3 d培養(yǎng)基應(yīng)該每天更換一次，3 d后，隔天更換一次[4]。有研究表明，將USCs在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～2周，并在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，可見(jiàn)極少量USCs(每50 mL尿液中有2～4個(gè)USCs)，USCs呈梭型。繼續(xù)培養(yǎng)2周后細(xì)胞融合達(dá)到80%～90%時(shí)傳代，傳代后生長(zhǎng)極其迅速，有非常強(qiáng)的增殖能力[8]。

1.2USCs的分離與鑒定 USCs的鑒定包括細(xì)胞學(xué)形態(tài)、細(xì)胞表面抗原、RNA端粒酶活性、核型、分化潛能等。USCs的外觀呈米粒樣，具有較長(zhǎng)的端粒，在增殖過(guò)程中端粒可以保持穩(wěn)定。USCs在表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)具有的細(xì)胞表面標(biāo)志物有CD29、CD44、CD54、CD90、CD105、CD117、CD133、CD146、SSEA4等；不表達(dá)的細(xì)胞表面標(biāo)志物有CD14、CD19、CD31、CD45、人類白細(xì)胞抗原-DR、主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ等[9]。采用流式細(xì)胞術(shù)可對(duì)其表面標(biāo)志物進(jìn)行鑒定。USCs同時(shí)還有多能轉(zhuǎn)化潛能，其在不同的培養(yǎng)基中可以轉(zhuǎn)化為不同種類的細(xì)胞，例如脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞等[10-12]。

2 USCs對(duì)AKI的保護(hù)作用

有研究證明，在不同病因?qū)е碌拇笫?、豬或猿的AKI模型中，利用USCs修復(fù)腎組織起到了明顯的改善及保護(hù)作用[13-14]。例如在順鉑導(dǎo)致的AKI動(dòng)物模型中，利用USCs治療組尿素、肌酐、腎臟損傷指數(shù)等評(píng)估腎臟功能的指標(biāo)均明顯低于PBS對(duì)照組。糖原染色和凋亡染色結(jié)果顯示，USCs治療組的腎小管上皮細(xì)胞損傷程度輕于PBS對(duì)照組，同時(shí)腫瘤壞死因子-α、BCL-2蛋白等凋亡因子及白細(xì)胞介素-6等炎癥因子表達(dá)水平也明顯降低[15]。USCs在缺血再灌注導(dǎo)致的AKI中也起到了明顯的保護(hù)作用和修復(fù)功能[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，USCs治療組除可以明顯降低肌酐、尿素、腎臟損傷指數(shù)外，還可以明顯降低干擾素-γ和白細(xì)胞介素-1β的表達(dá)水平。USCs在膿毒血癥引起的AKI中也有較好的保護(hù)作用[17]，膿毒血癥誘導(dǎo)AKI發(fā)生時(shí)表現(xiàn)為全身血管擴(kuò)張伴低血壓、腎臟低血流灌注、腎小管間質(zhì)損傷和腎小管內(nèi)皮功能障礙伴毛細(xì)血管血栓形成。USCs通過(guò)調(diào)節(jié)輔助性T細(xì)胞比例、調(diào)控膿毒癥免疫應(yīng)答，從而治療AKI。USCs主要通過(guò)抗炎、抗凋亡的細(xì)胞保護(hù)作用，同時(shí)抑制組織損傷，從而對(duì)AKI起保護(hù)作用。

3 USCs對(duì)AKI的保護(hù)機(jī)制

USCs在AKI動(dòng)物模型中有較好的保護(hù)效果，而USCs對(duì)AKI的保護(hù)作用是如何實(shí)現(xiàn)的呢？有研究提出，USCs分泌的外泌體可能在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[8]。外泌體是一種被雙層薄膜包裹的囊泡，直徑為30～120 nm，可以通過(guò)超高速連續(xù)離心的方法提取，其在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞間通訊中發(fā)揮重要作用。USCs可通過(guò)降低半胱天冬酶促進(jìn)有絲分裂作用，達(dá)到抗細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞損傷的作用。添加USCs外泌體的培養(yǎng)基可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管的增殖，同時(shí)增強(qiáng)成骨功能并抑制破骨功能，從而促進(jìn)骨組織的增殖。外泌體對(duì)癌癥、心血管疾病、自身免疫性疾病等均有治療療效，其在細(xì)胞增殖、炎癥、免疫調(diào)節(jié)、血管反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等細(xì)胞生物行為調(diào)控中發(fā)揮重要作用；同時(shí)，外泌體還涉及疾病診斷與預(yù)后、藥物遞送等重要醫(yī)學(xué)前沿領(lǐng)域[18]。

外泌體富含蛋白質(zhì)、DNA、mRNA、微小RNA(miRNA)、環(huán)狀 RNA(circRNA)等，這些物質(zhì)如果直接暴露在血液和體液中很容易被降解，而由磷脂雙分子層組成的外泌體為它們提供了一個(gè)安全的載體，這些物質(zhì)可以作為介質(zhì)被靶細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞)攝取吸收，從而調(diào)節(jié)AKI的損傷過(guò)程[19]。有研究報(bào)道，AKI的修復(fù)主要是通過(guò)USCs的旁分泌機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，而外泌體正是實(shí)現(xiàn)旁分泌機(jī)制的重要工具[20]。USCs外泌體可以降低促炎因子(腫瘤壞死因子-α、干擾素γ、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-1β)水平，同時(shí)升高抗炎因子(白細(xì)胞介素-10與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1)水平，降低氧化應(yīng)激和膠原沉積水平[16]。外泌體利用細(xì)胞外囊泡介導(dǎo)生物活性內(nèi)容物，例如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和RNA至損傷部位，從而達(dá)到減少腎小管損傷和細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制腎臟局部炎癥的目的[21]。有研究證明，給予AKI小鼠模型的腹腔注射USCs與直接注射入腎臟的USCs均可以減輕AKI造成的損傷，同時(shí)促進(jìn)修復(fù)[22]，說(shuō)明USCs可以通過(guò)旁分泌機(jī)制治療AKI。外泌體內(nèi)容物治療AKI的機(jī)制是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，其中對(duì)于治療AKI研究較廣泛的是miRNA和circRNA。

miRNA是由19～23個(gè)核苷酸組成的非編碼內(nèi)源性單鏈RNA，其由核內(nèi)編碼的miRNA基因轉(zhuǎn)錄為miRNA前體，然后在解螺旋酶和Dicer酶作用下生成單鏈miRNA，在生物體內(nèi)可以穩(wěn)定存在。外泌體中的miRNA通過(guò)降低某些生物標(biāo)志物的釋放，抑制或增強(qiáng)通路，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞修復(fù)功能。有研究表明，USCs來(lái)源的外泌體可以釋放miR-216a-5p，靶向作用于同源性張力蛋白磷酸酶，激活蘇氨酸蛋白激酶(AKT)通路，促進(jìn)AKT磷酸化，同時(shí)降低半胱天冬酶3的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡[8]。而添加miR-216a-5p拮抗劑的USCs對(duì)細(xì)胞的抗凋亡、抗損傷作用則大大降低，證明USCs通過(guò)外泌體傳遞miR-216a-5p對(duì)AKI發(fā)揮保護(hù)作用。有研究顯示，miR-30c-5p可以靶向作用于硫氧還蛋白相互作用蛋白，通過(guò)抑制炎癥小體NLRP3通路減少凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白和半胱天冬酶1等因子的表達(dá)，最終達(dá)到抗炎、抗凋亡的作用[23]。另外，USCs外泌體中富含的miR-146a-5p還可以下調(diào)白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶Ⅰ，通過(guò)抑制核因子激活的B細(xì)胞的κ-輕鏈增強(qiáng)通路p65核轉(zhuǎn)位，減輕腎小管上皮細(xì)胞的損傷[21]。

circRNA作為miRNA 的分子海綿，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，使miRNA失去其自身功能及對(duì)下游靶基因的調(diào)節(jié)功能[24]，同樣影響人類多種致病過(guò)程，例如心肌梗死、視網(wǎng)膜血管功能障礙、糖尿病、癌癥、精神疾病等[25]。circRNA屬于目前新的研究熱點(diǎn)，但其在AKI發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制及其在USCs保護(hù)作用中所扮演的角色亟待人們?nèi)ヌ剿骱脱芯?。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)顯示，1 664個(gè)circRNA在人類腎臟組織中呈明顯高表達(dá)，474個(gè)circRNA是腎臟中唯一表達(dá)的circRNA[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠高血壓模型的腎臟組織中有多達(dá)超過(guò)12 000個(gè)circRNA分子表達(dá)[27]。在缺血再灌注損傷引起的AKI模型中，有許多差異表達(dá)的circRNA，如circ-DNMT3A、circ-AKT3、circ-PLEKHA7和circ-ME1[24]。而在膿毒血癥引起的AKI細(xì)胞模型中，circ-FANCA表達(dá)上調(diào)，來(lái)自脂多糖處理過(guò)的人腎小管上皮細(xì)胞的外泌體參與了circ-FANCA的體外傳遞。敲除circ-FANCA可以靶向作用于miR-93-5p，調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)蛋白1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而減輕脂多糖誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞損傷[28]。在AKI中circRNA的表達(dá)譜及其調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究，而USCs是否可以靶向調(diào)控circRNA、減輕AKI尚需探索。

4 總結(jié)與展望

AKI由于出現(xiàn)突然性的腎功能惡化，目前缺乏特效治療方法，病死率較高。USCs具有采集簡(jiǎn)單，成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，并且對(duì)于多種疾病的治療均有明顯效果。USCs在各種AKI的細(xì)胞和動(dòng)物模型中均發(fā)揮保護(hù)作用，其主要機(jī)制之一是利用USCs外泌體介導(dǎo)生物活性物質(zhì)至損傷部位，發(fā)揮抗炎、抗凋亡作用。miRNA、circRNA等在AKI的發(fā)病和調(diào)控中起重要作用，可能成為AKI治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。USCs可以通過(guò)外泌體傳遞miRNA、circRNA等重要分子，為AKI的治療提供新思路。