張彥萍 高力英 韓鵬炳 楊銀芳

甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州730050

鼻咽癌是頭頸部常見惡性腫瘤之一，其發(fā)生率在我國南方地區(qū)較高，由南到北逐漸降低［1］。我省為鼻咽癌非高發(fā)區(qū)域。EB病毒是鼻咽癌發(fā)病的重要原因之一。血漿EBV-DNA是鼻咽癌強(qiáng)有力的生物標(biāo)志物［2］，檢測不同時(shí)期鼻咽癌患者血漿中EBV-DNA含量在鼻咽癌早期篩、早期診斷、臨床分期、療效評估、預(yù)后判斷等方面有著重要的臨床意義［3］。因檢測方法、試劑不同，EBV-DNA含量數(shù)據(jù)亦不相同［4］。EBV-DNA檢測結(jié)果是否受不同性別、年齡的影響，暫無明確定論。不同腫瘤分期及免疫功能同樣影響鼻咽癌患者血清EBV-DNA檢測含量。現(xiàn)將我科88例鼻咽癌EBVDNA檢測過程及陽性率與其性別，年齡，分期，免疫功能的變化簡單介紹如下，以期為相關(guān)研究提供臨床數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年3月至2019年3月就診于我科的鼻咽癌患者88例，患者來自我省各個(gè)市縣地區(qū)。其中男性65例，女性23例。年齡15～71歲，中位年齡51歲。依據(jù)AJCC第8版進(jìn)行分期［5］，其中Ⅰ期2例，Ⅱ期0例，Ⅲ期36例，Ⅳ期50例。對所有患者進(jìn)行EB病毒NDA檢測、免疫功能檢測。EBV DNA數(shù)值＜4.0E+2為陰性，≥4.0E+2為陽性。

1.2 方法 采用圣湘生物開發(fā)的EB病毒核酸定量檢測試劑盒進(jìn)行檢測，具體如下：（1）取出紅細(xì)胞裂解液，室溫放置，混勻后備用。（2）出全血樣本，充分混勻（如果混勻后管蓋上有殘留全血樣本，瞬時(shí)低速離心即可），取樣時(shí)用加樣槍吹打2～3次（樣本靜止時(shí)全血中的白細(xì)胞自然沉降，造成分布不均一，充分混勻），取1mL紅細(xì)胞裂解液加入2mL離心管，加入200μL全血樣本，混勻（顛倒混勻20～30次），12000rpm/min離心1min，去上清。（3）向沉淀中再加入1mL紅細(xì)胞裂解液，充分混勻（顛倒混勻20～30次，確保無明顯紅色狀沉淀），12000rpm/min離心3min，去上清。（4）再加入1mL生理鹽水，無須混勻，直接12000rpm/min離心10min，吸凈上清液（全血樣本中，去上清時(shí)，不要把沉淀一起吸棄，否則會(huì)出現(xiàn)Ct值拖/或者假陰性）。管底白色沉淀即為分離得到的白細(xì)胞，可用于核酸提取。于沉淀中加入100μL核酸釋放劑，震蕩混勻，75C恒溫處理20min，離心1～2min備用。（5）加樣：每個(gè)PCR反應(yīng)管中加入上述處理后的待測樣本，陰性對照，陽性對照以及定量參考品；每管加入PCR-混合液40μl，蓋上管蓋（去除氣泡后），2000rpm離心30s，PCR擴(kuò)增（在擴(kuò)增與分析區(qū)進(jìn)行），將PCR反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀樣品槽，按對應(yīng)順序設(shè)置陰性對照陽性對照，定量參考品A～D以及未知樣本。

雙擊圖標(biāo)SLAN8.2.2實(shí)驗(yàn)向?qū)Э装寰庉嬤x擇反應(yīng)孔-選擇項(xiàng)目（EB）選擇樣本類型，分別選擇待測樣品陽性對照陰性對照和標(biāo)準(zhǔn)品。選好標(biāo)準(zhǔn)品后再選擇自動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)品，彈出自動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)品對話框，復(fù)管個(gè)數(shù)：1；起始濃度：4×107；稀釋梯度：遞減。點(diǎn)擊確定即可。單擊實(shí)驗(yàn)運(yùn)行-開始?！?.0E+2（4×102）表示陽性，反之為陰性。

2 結(jié)果

88例受檢患者中59例EBV DNA檢測結(jié)果呈陽性，陽性率為67.0%（59/88）；陽性患者中男性有44例，陽性率為74.6%（44/59）；女性15例，陽性率為25.4%（15/59）。依據(jù)《中國年齡劃分標(biāo)準(zhǔn)》［6］劃分為4個(gè)年齡段，中少年（7～17歲）共2例，1例陽性；青年（18～40歲）共14例，11例陽性；中年（41～65歲）共60例，37例陽性；老年（66歲以上）共12例，10例陽性。依據(jù)AJCC第8版［5］分期進(jìn)行臨床分期：Ⅰ期占1.7%（1/59例），Ⅱ期0例，Ⅲ期占33.9%（20/59例），Ⅳ期占64.4%（38/59例）。依據(jù)淋巴細(xì)胞免疫分析結(jié)果59例EBVDNA陽性患者中33例（55.9%）患者出現(xiàn)免疫功能不同程度低下。

3 討論

我國鼻咽癌男女發(fā)病比率為2.8∶1，其中以30～60歲多見，40～59歲發(fā)病高峰［7］。2018年至2019年我院鼻咽癌患病率男性高于女性，患病率比約3∶1。本研究EBV DNA檢測陽性率為67.0%，其中男性占74.6%，女性占25.4%，好發(fā)年齡41～65歲。2013年我國男性鼻咽癌新發(fā)病例約30 000；女性鼻咽癌新發(fā)病例約12 000，年齡在25～29歲開始迅速上升，男性在60～64歲達(dá)到高峰，女性在75～79歲達(dá)到高峰，之后明顯下降［8］。張慶等［9］通過檢測9445例EB病毒感染者發(fā)現(xiàn)，EB病毒感染存在性別、年齡及不同季節(jié)的差異性，季節(jié)性差異可能因地域不同而引起。凡任芝［10］研究發(fā)現(xiàn)，EBV DNA陽性率與患者的性別及年齡段均無相關(guān)性；TNM分期中Ⅲ期和Ⅳ期的EBV DNA濃度檢測結(jié)果的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且Ⅳ期較高；隨T分期的發(fā)展，各期EBV DNA陽性檢出率增高，M和N分期患者的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢妼τ诓煌詣e、年齡是否影響EB病毒檢測結(jié)果尚存在分歧。本研究檢測結(jié)果提示，Ⅳ期陽性率最高，Ⅲ期次之，Ⅰ期較少，陽性率隨分期的降低而下降，證明分期越晚，EBV DNA檢測濃度越高。常莉等［11］研究發(fā)現(xiàn)，兒童感染EB病毒后，不同性別、年齡段EBV-DNA檢測結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。成年人與兒童感染EB病毒存在性別差異。對于兒童鼻咽癌EBV-DNA研究暫無明確大數(shù)據(jù)說明。由上可見EB病毒感染與性別、年齡、分期、免疫功能皆相關(guān)。

EBV與胃癌、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤等腫瘤相關(guān)［12］，與鼻咽癌發(fā)病關(guān)系更為密切。不同EBV株的生物學(xué)特性也指向了不同類型的癌癥［13］。尤其是在未分化型鼻咽癌中，90%以上呈EBV陽性［14］。已有學(xué)者提出，可利用EBV特異性抗體和EBV DNA來診斷早期鼻咽癌，且EBV感染后的特異性病理學(xué)改變有助于鼻咽癌病理學(xué)的診斷［15］。Ji MF等［16］對廣東省825例高風(fēng)險(xiǎn)患鼻咽癌者行EBV DNA檢查，1年內(nèi)診斷鼻咽癌的敏感性為86.8%，特異性為90%。因此，用血清EBV評估的基礎(chǔ)上聯(lián)合EBV DNA檢測可明顯提高篩查的準(zhǔn)確率。盧煜明教授及其研究團(tuán)隊(duì)研究［17］發(fā)現(xiàn)，檢測EBV DNA對診斷鼻咽癌的敏感性和特異性分別為97.1%和98.6%。王琳等［18］檢測EBV DNA結(jié)果顯示高危人群的陽性率為12%，低危人群的陽性率為3.4%，臨床初診為鼻咽癌的患者EBV DNA陽性率為91.4%。鼻咽癌患者血清中大多有EBV抗體效價(jià)升高，且效價(jià)水平常與病變好轉(zhuǎn)或惡化呈正相關(guān)。Meng C等［19］研究報(bào)道放療前血漿EBVDNA陽性患者在放療后2年無病生存率為80.8%，而EBVDNA陰性患者2年無病生存率為98.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Lo YM等［20］研究證實(shí)，放療后血漿中EBV DNA中位半衰期為3.8天，如放射治療后檢測EBV DNA持續(xù)陽性或再次升高往往提示腫瘤未控或進(jìn)展。EVB DNA對早期鼻咽癌分期有一定指導(dǎo)作用。在AJCC鼻咽癌臨床分期（第8版）［5］中，若頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌伴EBV DNA陽性，即使鼻咽部未發(fā)現(xiàn)腫瘤，亦定義為T0期鼻咽癌［21］。

綜上所述，血清EBV DNA檢測對于鼻咽癌的診斷、治療療效及預(yù)后都有非常重要的指導(dǎo)作用。臨床中我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)EBV DNA陽性患者的免疫功能出現(xiàn)不同程度下降。Chung BK等［22］研究表明，免疫功能正常的個(gè)體被EBV感染后會(huì)進(jìn)入休眠狀態(tài)，但病毒仍能夠持續(xù)在人體內(nèi)通過EBV編碼的小RNA和病毒micro-RNA來表達(dá)病毒產(chǎn)物。免疫功能低下的個(gè)體感染后，EBV在淋巴組織中大量增殖，并可異位感染T細(xì)胞與NK細(xì)胞等，導(dǎo)致宿主免疫系統(tǒng)功能紊亂。多項(xiàng)研究提出，除傳統(tǒng)影像學(xué)隨訪外，EBV DNA滴度的定量檢測可用于監(jiān)測鼻咽癌局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，滴度越高，越容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［23-25］?，F(xiàn)臨床已將EBV DNA視為鼻咽癌患者腫瘤標(biāo)志物，陰性、陽性及陽性數(shù)值的高低可指導(dǎo)臨床治療。