韋少釵，李冠武

（汕頭大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，腫瘤分子生物學開放實驗室，廣東 汕頭 515041）

引 言

細胞自噬是利用溶酶體內(nèi)水解酶降解細胞質(zhì)中受損成分和細胞器，使細胞應對各種刺激環(huán)境，從而維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的一種高度保守的自我調(diào)節(jié)機制.按照底物進入溶酶體的方式，細胞自噬分為3 種途徑，分別為細胞自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬[1].根據(jù)降解底物有無專一選擇性，自噬可分為非選擇性自噬和選擇性自噬[2].非選擇性自噬對底物沒有專一性，自噬過程一般先激活mTOR 通路的上游因子，通過Beclin1 復合體形成隔離膜，接著ATG12 和LC3/p62 系統(tǒng)對隔離膜的延伸從而形成自噬體，最終與溶酶體結合成自噬溶酶體對物質(zhì)進行降解.另外一類細胞自噬可以專一性地降解特定的大分子或細胞器如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等，這種自噬稱為選擇性自噬[3].

長期以來人們主要關注二甲雙胍通過激活AMPK 能量信號通路，抑制mTOR 通路[4]，對自噬起始信號起調(diào)控作用.但是越來越多研究表明二甲雙胍也能夠對自噬流過程進行調(diào)控，同時參與線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器的調(diào)節(jié)[5].人們發(fā)現(xiàn)二甲雙胍不僅對糖尿病的療效顯著，而且它能降低二型糖尿病患者許多惡性腫瘤（如結直腸癌、前列腺癌等）的發(fā)病風險[6-8]，甚至能延長二型糖尿病患者的生存時間[9]，因此二甲雙胍通過調(diào)節(jié)自噬抗腫瘤以及抗衰老的作用引發(fā)人們強烈關注.但二甲雙胍誘導自噬的分子機制尚不清楚，本文對以二甲雙胍誘導細胞自噬機制及相關應用綜述如下.

1 二甲雙胍對自噬靶點的影響

1.1 mTOR 通路

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin）分為mTORC1 和mTORC2兩種復合體，由于它們結構域不同，在細胞中起不同的作用[10]. mTORC1 主要結構是Raptor、PRAS40，參與自噬、溶酶體合成、脂質(zhì)合成等途徑. mTORC2 是由Rictor、SIN1、Proctor 組成，參與細胞增殖、代謝和細胞骨架組成相關途徑[11].mTORC1 復合體作為自噬過程的中心樞紐，二甲雙胍主要通過與其相關的PI3K/Akt/mTOR 途徑跟LKB1/AMPK/mTOR 途徑參與調(diào)節(jié)自噬過程. 生長因子能激活PI3K/AKT/mTOR 信號通路，研究表明二甲雙胍在體內(nèi)可以降低胰島素樣生長因子，減少IGF-1 的合成與分泌[12-13]，使胰島素受體底物不能活化細胞中磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K），抑制AKT 磷酸化，進而抑制mTORC1 磷酸化，誘導細胞自噬或凋亡，最終抑制癌細胞生長[14-15].其次由于二甲雙胍能抑制線粒體的活性，造成細胞能量缺乏，激發(fā)LKB1 激酶使AMPK 的Thr172發(fā)生磷酸化.活化的AMPK 激酶不但使mTORC1 上的raptor 的Ser792 位點磷酸化，同時磷酸化ULK1Ser317 跟Ser777 位點[16-17]，ULK1 與自噬相關基因（如Atg13、Atg17等）共同參與自噬隔離膜的形成[18]，共同調(diào)節(jié)自噬過程.

1.2 Beclin1 蛋白

Beclin1 可與Vps34、Ambral、Vps15、Atg14 形成PI3K-Beclin1 復合體參與形成自噬前膜，但是如果Beclin1 與Bcl-2 的BH3 結構域結合，就無法與Vps34 等形成PI3K-Beclin1 復合體，從而抑制自噬膜生成[19]. 研究者發(fā)現(xiàn)BNIP3 與Bcl-2 競爭結合Beclin1，導致Beclin1 與Bcl-2 分開，促進形成PI3K-Beclin1 復合體，誘發(fā)自噬體的形成[20].但是在高糖誘導細胞受損的情況下，二甲雙胍會通過激發(fā)Hedgehog 信號途徑，降低BNIP3 的表達，增加Beclin1 與Bcl-2 的相互作用，阻滯自噬進程[21].然而在H9C2 細胞中經(jīng)二甲雙胍處理后會激活細胞中Jun N 末端激酶1（JUNK1），JUNK1 的激活使Bcl-2Ser70位置發(fā)生磷酸化同時改變自身BH3 的結構域，使得Beclin1 與BCL2 解離，有利于自噬前體PI3K-Beclin1 復合物的形成[22-23].

1.3 二甲雙胍與LC3 酯化和P62 連接系統(tǒng)

pro-LC3 蛋白的羧基末端被Atg4 切割，形成LC3Ⅰ狀態(tài)，接著LC3Ⅰ在atg4 和atg7協(xié)作下使LC3Ⅰ與磷脂酰乙醇胺（PE）形成LC3Ⅱ.LC3Ⅱ與atg5-atg12-atg16 蛋白復合體以及連接蛋白p62 一起使自噬體膜延伸形成自噬泡，參與受損物質(zhì)的降解.CCAAT/增強子結合蛋白δ（CEBPD）是一種基本的亮氨酸拉鏈轉錄因子，能夠作用于自噬相關蛋白LC3 的-978/618 和Atg3-1179/-537 位點，促進LC3 和Atg3 基因表達[24]. 二甲雙胍作用于肝癌細胞（Huh7 細胞）中，通過降低Src 激酶在酪氨酸416 位點的磷酸化，降低蛋白酶體降解程度，從而增加細胞中CEBPD 蛋白，使LC3 和Atg3 表達上升[25]. 研究發(fā)現(xiàn)TRIB3 轉錄水平受到SMAD3 基因調(diào)節(jié)，能通過干擾p62 與LC3 的結合調(diào)節(jié)自噬信號通路.二甲雙胍治療黑色素瘤細胞時會抑制SMAD3 蛋白磷酸化，同時干擾賴氨酸乙?；D移酶5（KAT5）對SMAD3K333 乙?；?，導致TRIB3 轉錄降低，減少其對p62 與LC3結合的影響，受損物質(zhì)參與自噬[26].

1.4 二甲雙胍促進自噬溶酶體的水解功能

溶酶體中含有50 多余種酸性水解酶，主要功能是接受和降解胞內(nèi)受損的蛋白或細胞器.溶酶體膜上存在蛋白受體，溶酶體膜內(nèi)的蛋白1 和2、v 型ATP 酶等具有維持結構完整與物質(zhì)運輸?shù)墓δ躘27].研究表明在二甲雙胍作用下，可以通過轉移折疊蛋白AXIN 和ULK1 共同聚集在溶酶體膜v-ATPase 受體上，從而形成v-ATPase-Ragulator-AXIN/ULK1復合體，促進溶酶體與自噬小體融合成自噬溶酶體[28-29].TAK1 是絲裂原活化蛋白激酶（MAP3K）的成員之一，具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，可以調(diào)節(jié)蛋白水解酶、黏附分子等的表達[30].二甲雙胍造成溶酶體損傷時，會使溶酶體囊泡中存在的Gal9（半凝集素9）代替膜上USP9X 和TAK1 復合體，接著使TAK1 在K63 泛素化，增強AMPK/ULK1 誘導自噬[31].近年來，人們發(fā)現(xiàn)TFEB 是調(diào)控溶酶體生成和細胞自噬的開關，正向調(diào)控溶酶體酸性水解酶跟膜蛋白的表達[32]. 研究表明二甲雙胍作用于小鼠體內(nèi)激活自噬標志Beclin1、LC3Ⅱ的表達，降低p62；同時增強TFEB 在胞質(zhì)中和核中含量，從而提高組織蛋白酶的活性，提高溶酶體中酶的水解能力[33].

2 二甲雙胍對細胞器的影響

2.1 線粒體自噬

由于受損線粒體上存在許多線粒體自噬效應分子，機體能產(chǎn)生專一的自噬機制清除受損的線粒體以維持細胞穩(wěn)定狀態(tài)，稱為線粒體自噬.如今人們了解線粒體自噬效應分子主要由PINK1/Parkin 蛋白、Nix/BNIP3L 蛋白、MFN 蛋白和FUNDC1 蛋白組成[34].通過體內(nèi)體外研究，二甲雙胍抑制線粒體呼吸鏈上ComplexⅠ的活性，細胞內(nèi)環(huán)境中NADH 形成NAD+受阻，天冬氨酸的水平下降，造成線粒體功能損傷，從而通過自噬途徑清除受損線粒體[35].二甲雙胍處理人外周血單核細胞，在電鏡下表現(xiàn)為細胞中出現(xiàn)大量的線粒體自噬溶酶體，主要其能明顯降低線粒體活性氧，使線粒體中的DNA 受損，促進線粒體膜上的PINK1、Parkin、Nix、MFN2 等蛋白表達，細胞能清除受損的線粒體，而且改善細胞功能[36].糖尿病的發(fā)病機理通常伴隨著線粒體自噬受損和NLRP3 炎癥小體的激活導致細胞死亡[37].研究表明在糖尿病心肌細胞中二甲雙胍可以增強線粒體自噬，從而快速改變線粒體的形狀和功能，通過抑制NLRP3 信號通路降低caspase1、IL-1 的表達，減少細胞壞死[38].

2.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬指在多種應激刺激下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)出現(xiàn)錯誤折疊與未折疊的蛋白聚集或缺少膽固醇時，細胞引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激清除物質(zhì)以維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定所激發(fā)的選擇性自噬.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與自噬的相互作用可以通過未折疊蛋白反應（UPR）的三種主要蛋白，即蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK），跨膜激酶1α（IRE1α）以及激活轉錄因子6α（ATF6α）調(diào)控細胞穩(wěn)態(tài)[39].研究表明，二甲雙胍引起腫瘤細胞內(nèi)能量缺乏，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的感應器PERK，真核起始因子2α（Eif2α）被PERK 磷酸化，減少蛋白質(zhì)合成，同時使LC3Ⅱ跟Atg5-Atg12 復合體上升，通過促進自噬增加受損蛋白降解[40].另有研究表明二甲雙胍誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在磷酸化Eif 2α 時也會激活ATF4，ATF4 轉錄調(diào)控ATG12，介導CHOP 活化ATG5，促進自噬隔離膜的延伸[41-42]. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬存在六種自噬蛋白受體如（FAM134B、RTN3L、SEC62、CCPG1、ATL3、TEX264），但是關于二甲雙胍所誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬至今鮮有報道[43].

3 二甲雙胍自噬機制對細胞的影響

3.1 抑制腫瘤增殖生長

大量實驗研究表明，二甲雙胍在誘導自噬后能通過阻滯細胞周期跟促進細胞凋亡來抑制細胞增殖.二甲雙胍能使不同腫瘤細胞停滯在G0/G1 期、G2/M 期，抑制其增殖.在多發(fā)性骨髓瘤細胞（8226 和U266）和黑色素瘤中，二甲雙胍誘導AMPK/mTOR 自噬途徑，間接促進p53 的表達，從而使細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子（p21 和p27）表達上升，于是減少細胞周期蛋白CyclinD 含量，導致視網(wǎng)膜細胞瘤基因（RB 基因）無法被CyclinD 磷酸化，同時轉錄因子（E2F）不從RB 上能釋放參與促進S 期蛋白的合成[44]，造成細胞阻滯在G0/G1 期[45-46].在肝癌細胞中二甲雙胍提高轉錄因子CEBPD 的表達，可能會誘導腫瘤抑制基因miR-193b-3p 的表達，從而抑制原癌基因Cyclin D1 跟ETS1 表達[47]，造成細胞滯留在G1 期[25]. 二甲雙胍能抑制Akt 的磷酸化，抑制mTOR 的活性，促發(fā)caspase 凋亡，增加caspase3 的切割，導致細胞凋亡[48].在肺癌細胞中，二甲雙胍介導自噬促進LC3Ⅱ的上升同時使p62 下降，造成細胞發(fā)生腫瘤壞死因子（TRAIL）介導的凋亡[49].

3.2 抑制腫瘤侵襲遷移

惡性腫瘤容易發(fā)生侵襲轉移，造成多種器官功能性損傷.上皮間質(zhì)轉化（EMT）將丟失緊密連接和黏附連接的有極性的上皮樣細胞，轉化成有遷移能力的間質(zhì)形態(tài)和特征細胞的過程，大量研究表明二甲雙胍能通過抑制EMT 抑制腫瘤細胞轉移[15，50-52].二甲雙胍治療可以直接干擾PP2A 催化亞單位A4 和MID1 的關聯(lián)，從而釋放PP2A 的催化活性，進而抑制肺癌細胞侵襲[53]. YAP 是一種有效的致癌基因，它的異常調(diào)控會引起腫瘤發(fā)生，二甲雙胍通過上調(diào)miR-381 表達，下降YAP 蛋白的表達，抑制非小細胞肺癌細胞遷移[54].此外，人們還發(fā)現(xiàn)誘導自噬后下降腫瘤轉移相關因子（MTA1），這是另一個二甲雙胍抑制腫瘤侵襲遷移的途徑[55].

3.3 延緩細胞衰老

細胞衰老會不斷積累損傷的蛋白跟細胞器，自噬可以分解細胞內(nèi)受損物質(zhì)，二甲雙胍能通過氧化應激和AMPK 信號通路參與調(diào)節(jié)自噬，延緩衰老，緩解老年相關疾病[56].二甲雙胍作為自噬激活劑治療衰老的人牙周膜干細胞，它能減少衰老產(chǎn)生的氧化應激，降低衰老基因（p21、p16）的表達，同時激活自噬因子Beclin1、LC3Ⅱ，采用自噬抑制劑（3-MA）加快細胞衰老進程[57].衰老紊亂細胞內(nèi)的能量狀態(tài)，二甲雙胍能通過調(diào)節(jié)能量感受器AMPK 的活性，改善細胞的衰老情況.小鼠在年老時容易造成神經(jīng)損傷，二甲雙胍能夠通過激發(fā)AMPK/ULK1 依賴的自噬途徑，提高海馬突觸密度，微管結合蛋白2（MAP2）和突觸后密度蛋白95（PSD95）的含量，減少由七氟醚在老年小鼠中造成的神經(jīng)損傷[58]. 二甲雙胍在心肌細胞中能夠激活細胞質(zhì)中AMPKα/mTOR/TFEB 和細胞核中AMPK/βSkp2/CARM1/TFEB 的通路促進自噬[59].老年小鼠容易出現(xiàn)I/R 損傷性心肌細胞壞死，研究顯示二甲雙胍通過促進自噬可以降低壞死激活因子（p-RIP3 跟p-MLKL），同時干擾p62/RIP1/RIP3 復合體形成，使p62 能與LC3Ⅱ等自噬蛋白結合，恢復老年化受損的心肌細胞[60].

4 結語

二甲雙胍作為T2DM 的首選藥，不僅具有良好的降糖作用，而且能誘導多條信號通路參與對抗多個系統(tǒng)的腫瘤，其中二甲雙胍誘導自噬通路起重要作用. 二甲雙胍在誘導自噬時能對不同細胞的不同時期產(chǎn)生不一樣的靶點控制，這可以利用二甲雙胍設計靶向藥物參與自噬的調(diào)節(jié). 二甲雙胍在多種刺激下能誘發(fā)選擇性自噬（線粒體自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬）的產(chǎn)生，達到抑制細胞增殖、侵襲遷移，同時還具有延緩細胞衰老等作用，因此仍需不斷研究二甲雙胍誘導自噬機制，進一步為治療腫瘤提供更有效的思路和途徑.