陳叢，趙敏

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響婦女健康。由于宮頸癌病因明確，且疾病的發(fā)展需要數(shù)十年的時間[1]，作為可防可治的腫瘤，預(yù)防宮頸癌的有效措施依然是宮頸病變的篩查。目前宮頸病變篩查采用“三階梯的方式”，而用于普查的宮頸薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查（thin-prep cytology test，TCT）具有特異度高、敏感度低的特點，高危型人乳頭瘤病毒（high risk human papillomavirus，HR-HPV）檢測具有敏感度高、特異度低的特點，在臨床中的作用受限。眾所周知惡性腫瘤的發(fā)生與抑癌基因雜合性丟失、基因突變和異常甲基化等導(dǎo)致正常細(xì)胞功能喪失、增殖失控有關(guān)。其中，DNA 甲基化是抑癌基因功能失活和轉(zhuǎn)錄抑制的關(guān)鍵機(jī)制之一，基因啟動子過甲基化已被證實在宮頸癌等腫瘤中普遍存在[2]。隨著對宮頸病變研究的深入，特異性的DNA 甲基化標(biāo)志物檢測成為一種新興的篩查策略，可預(yù)測宮頸病變進(jìn)展的風(fēng)險。

1 宮頸病變篩查現(xiàn)狀

宮頸病變篩查始于宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查，現(xiàn)階段用于普查的TCT 檢測方式受取材方式、人工閱片等主觀性影響，導(dǎo)致檢測結(jié)果易出現(xiàn)偏差。細(xì)胞學(xué)P16/Ki67 檢測是目前預(yù)測宮頸病變的研究熱點。P16INK4a（P16）是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，已被證明在致癌型HPV 的轉(zhuǎn)化感染中過表達(dá)，并被認(rèn)為是宮頸癌前病變的替代標(biāo)志物[3]。Klaes等[4]的研究表明，P16 免疫組織化學(xué)染色可以精確識別小的宮頸癌前病變及宮頸癌。Ki67 是一種核抗原和細(xì)胞增殖生物標(biāo)志物，在細(xì)胞周期的G0 階段不表達(dá)，在細(xì)胞有絲分裂期間表達(dá)達(dá)到峰值，一直是測量和監(jiān)測腫瘤細(xì)胞增殖的標(biāo)志物。宮頸病變的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Ki67 的陽性表達(dá)隨著宮頸病變程度的加重而增加[5]。但是也有研究發(fā)現(xiàn)，P16/Ki67 雙重染色對CIN2 的陽性檢出率低于對CIN3+的陽性檢出率（41.1%vs.86.9%）[6]。

HR-HPV 持續(xù)感染被認(rèn)為是宮頸癌前病變進(jìn)展到宮頸癌的主要因素，21 世紀(jì)初，HPV DNA 檢測由于其高敏感度被用于宮頸病變篩查。但隨后研究發(fā)現(xiàn)，臨床上HPV 陽性患者多為“一過性感染”，可在1～2 年內(nèi)清除，不會引起前驅(qū)病變或惡性腫瘤，故HPV 檢測結(jié)果的假陽性率較高。HPV 致癌的關(guān)鍵在于基因組整合入宿主細(xì)胞發(fā)生病毒癌基因E6、E7的過表達(dá)，刺激細(xì)胞進(jìn)入無限增殖狀態(tài)，導(dǎo)致癌變。以HPV 的致癌基因E6、E7 轉(zhuǎn)錄的mRNA 為靶點，根據(jù)轉(zhuǎn)錄情況來判斷HPV 的感染及病毒活性狀態(tài)，可以區(qū)別感染性質(zhì)，排除“一過性感染”，更有效地反映病變的進(jìn)展，減少不必要的陰道鏡轉(zhuǎn)診。

宮頸病變篩查的目的在于及時篩查出高級別鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL），但是基于我國國情，大部分宮頸病變篩查仍選用單一的TCT 檢查或用HPV DNA 檢測分流TCT 結(jié)果異常的方式，造成了臨床工作中宮頸HSIL 的漏診或過度診斷。

2 DNA 甲基化與宮頸病變

惡性腫瘤通常是由遺傳和表觀遺傳改變的積累引起的，最近的證據(jù)表明，特定基因的表觀遺傳變化可能介導(dǎo)或預(yù)測致癌進(jìn)展。基因的表觀遺傳學(xué)調(diào)控包括DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和非編碼RNA調(diào)控等，其中基因啟動子區(qū)的異常DNA 甲基化是癌前和惡性階段中公認(rèn)的最常見的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志。它通常發(fā)生在腫瘤抑制因子、轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子基因的CpG 二核苷酸中的胞嘧啶上，通過啟動子沉默抑制基因表達(dá)導(dǎo)致整體低甲基化和基因特異性高甲基化，在包括宮頸癌在內(nèi)的致癌機(jī)制中起關(guān)鍵作用[7]。宮頸組織中DNA 甲基化包括宿主基因甲基化和HPV DNA 甲基化，可采用甲基化特異性定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測、焦磷酸測序以及最近發(fā)現(xiàn)的各種基于芯片的深度測序等方法進(jìn)行檢測。目前在宮頸組織中已檢測出超過100 種甲基化標(biāo)志物，近20 種在文獻(xiàn)中被報道，其中約有10 種基因的甲基化水平在宮頸HSIL 和宮頸癌中升高[8]。DNA 甲基化異常不僅被證實與宮頸癌治療后的隨訪及遠(yuǎn)期預(yù)后密切相關(guān)[9]，由于其具有較高特異度，故現(xiàn)階段也正被開發(fā)作為宮頸病變篩查策略的附加工具。

2.1 宿主細(xì)胞甲基化預(yù)測宮頸病變宿主細(xì)胞DNA 甲基化是來自宿主的細(xì)胞防御機(jī)制，沉默入侵的外來病毒基因組并抑制病毒復(fù)制。由于其檢測具有自動化、客觀性，不依賴于分子形態(tài)學(xué)及主觀解釋，且對宮頸HSIL+的檢出有較高特異度，既可以用作分流HPV DNA 陽性患者，又可以用在缺乏專業(yè)病理醫(yī)生的地區(qū)。目前已知可以預(yù)測宮頸病變的宿主細(xì)胞甲基化的基因包括配對盒家族基因1（PAX1）、性別決定區(qū)域Y 盒1（SOX1）、鋅指蛋白582（ZNF582）和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白1（CCNA1）等。

2.1.1 PAX1 PAX 基因編碼一個由9 個轉(zhuǎn)錄因子組成的家族，這些轉(zhuǎn)錄因子在正常表達(dá)的組織中充當(dāng)細(xì)胞譜系特異性調(diào)節(jié)劑，被認(rèn)為是惡性腫瘤進(jìn)展的重要因素。PAX 基因家族根據(jù)基因結(jié)構(gòu)分為4 組，包括PAX1/9、PAX2/5/8、PAX3/7 和PAX4/6。PAX1位于染色體20p11.2 上，是PAX 家族中甲基化最頻繁的基因[10]。PAX1 可能參與浸潤性或侵襲性惡性腫瘤的癌變和腫瘤進(jìn)展，如宮頸癌、口腔癌和卵巢癌。Lai 等[11]首次報道了PAX1 異常甲基化與宮頸癌相關(guān)。Nikolaidis 等[12]的薈萃分析納入了1 385 例不同級別的宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）患者和正常對照者，發(fā)現(xiàn)CIN3+與正常對照樣本中PAX1 甲基化的敏感度和特異度分別為77%和92%。Liu 等[13]研究認(rèn)為，當(dāng)鑒別宮頸惡性與非惡性病變的臨界值（△Cp 值）的截斷值為13.28 時，PAX1 甲基化檢測的敏感度、特異度和受試者工作特征（ROC）曲線下面積（AUC）分別可達(dá)92.30%、78.60%和0.902，其陽性預(yù)測值為80.00%，陰性預(yù)測值為91.67%。在檢出CIN3+方面，與HPV 檢測相比，PAX1 甲基化檢測的特異度及陽性預(yù)測值顯著增高（93.3% vs.60.0%，87.0% vs.57.1%）[14]。因此，若PAX1 甲基化與HPV 聯(lián)合檢測或分流HPV DNA 陽性患者可以提高宮頸病變篩查的準(zhǔn)確性，避免臨床工作中過度轉(zhuǎn)診陰道鏡。

2.1.2 SOX1 SOX 基因是一類Y 染色體性別決定區(qū)（sex determination region of Y chromosome，SRY）相關(guān)基因構(gòu)成的基因家族，其參與胚胎發(fā)育和凋亡過程中轉(zhuǎn)錄因子的編碼，與Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路有關(guān)。SOX 基因的異常表達(dá)可以激活β-連環(huán)蛋白信號通路，促進(jìn)β-連環(huán)蛋白分解，抑制β-連環(huán)蛋白的活性，從而影響胚胎發(fā)育和腫瘤形成。SOX1 基因是SOX 基因家族的成員，參與多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。例如，SOX1 甲基化水平在肝癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌和宮頸癌組織中顯著升高[15]。Lai 等[16]研究認(rèn)為，SOX1甲基化是CIN3+檢測的一個潛在的生物學(xué)標(biāo)志物，在CIN3+患者中SOX1 甲基化發(fā)生率為100%。一項薈萃研究納入了918 例CIN3+患者和2 193 例CIN2-患者共14 項相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)SOX1 啟動子的高甲基化在區(qū)分CIN3+患者和CIN2-患者時的AUC為0.838，敏感度和特異度分別為75%和71%，用于評估綜合敏感度和特異度數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的診斷優(yōu)勢比（diagnostic odds ratio，DOR）為11.12（＞1），表明SOX1甲基化對CIN3+的篩查具有重要的診斷價值[17]。在與HPV 相關(guān)的研究中發(fā)現(xiàn)，HPV 陽性聯(lián)合SOX1 甲基化檢測較單獨HPV 陽性診斷CIN3+的準(zhǔn)確性顯著升高（69.8%vs.27.9%）[18]。

2.1.3 ZNF582 KRAB-鋅指蛋白家族參與調(diào)節(jié)DNA 修復(fù)、細(xì)胞周期和組織轉(zhuǎn)化等生理過程。既往研究表明，ZNF582 甲基化與宮頸癌有關(guān)，且ZNF582甲基化檢測提高了目前宮頸病變篩查的有效性，并將不必要的陰道鏡檢查和活檢轉(zhuǎn)診減少了60%[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)截斷值為0.62 時，ZNF582 檢測CIN3+的敏感度和特異度分別為70%和82%，AUC可達(dá)到0.80[20]。對未明確診斷意義的不典型鱗狀上皮細(xì)胞（ASCUS）人群進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，ZNF582 甲基化檢測CIN3+的敏感度為91.4%，特異度為95.0%，且AUC 大于PAX1 甲基化檢測和HPV 檢測（0.96 vs.0.92 vs.0.67）[21]。在HPV相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ZNF582 的截斷值≤11 時，ZNF582 聯(lián)合HPV16/18是檢出CIN3+的最佳組合，其敏感度為85.4%，特異度81.1%[22]。

2.1.4 CCNA1 CCNA1 是一種腫瘤抑制基因，在HPV E6 和E7 蛋白嵌入宿主細(xì)胞后被激活，導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生。2014 年Khunamornpong 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，正常宮頸、低級別鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）和HSIL 的CCNA1 甲基化水平不同，分別為0、2.88%、83.33%。Oranratanaphan 等[24]研究顯示，CCNA1 甲基化的陽性預(yù)測值高達(dá)80.0%，可以用于分流ASCUS 陽性患者。診斷宮頸HSIL 時，盡管CCNA1 甲基化檢測的敏感度低于HPV 檢測（83.33%vs.100%），但特異度顯著高于HPV 檢測（96.88%vs.21.88%），可以用于與HPV 聯(lián)合篩查或分流HPV 陽性患者[25]。

此外，還有其他基因啟動子甲基化被認(rèn)為是預(yù)測宮頸病變的標(biāo)志物。Bu 等[26]研究發(fā)現(xiàn)趨化因子成員A4（FAM19A4）與細(xì)胞學(xué)分級呈正相關(guān)，甲基化率由低到高依次為正常宮頸組織、LSIL、HSIL、宮頸癌（10.61%、35.48%、56.14%和93.44%）。細(xì)胞黏附分子1（CADM1）和T 淋巴細(xì)胞成熟相關(guān)蛋白（MAL）啟動子的甲基化可能與宮頸病變進(jìn)展相關(guān)。有研究表明，宮頸炎癥標(biāo)本中CADM1 和MAL 啟動子的甲基化水平是正常宮頸組織的1.5 倍（P＜0.05）[27]。由于持續(xù)炎癥與宮頸病變進(jìn)展風(fēng)險升高相關(guān)，推測CADM1 和MAL 啟動子的甲基化水平升高可能出現(xiàn)在組織破壞中，推動宮頸病變進(jìn)展。連接黏附分子3（JAM3）通過細(xì)胞間的黏附及相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長，能夠顯著提高特異度和陽性預(yù)測值，對于ASCUS 患者，尤其是小于30 歲的患者有一定的分流效能[28]。

2.2 HPV 病毒基因甲基化預(yù)測宮頸病變目前認(rèn)為，HR-HPV 持續(xù)感染是宮頸癌前病變進(jìn)展到宮頸癌的主要因素，HPV 病毒基因分型以及病毒癌蛋白E6/E7 的轉(zhuǎn)錄水平已被用作預(yù)測宮頸病變進(jìn)展的重要生物學(xué)標(biāo)志。HPV 感染進(jìn)展也與HPV DNA 甲基化模式有關(guān)，宮頸HSIL+中HPV DNA 甲基化水平更高，因此HPV DNA 甲基化正被用作宮頸病變篩查的新標(biāo)志物。HR-HPV 病毒通過宮頸上皮的微傷口進(jìn)入，HPV 病毒衣殼蛋白L1 和L2 附著在基底膜上，2～4 h 后被內(nèi)化，導(dǎo)致基底上皮細(xì)胞感染。病毒基因組是作為染色體外環(huán)狀附加體建立的，可以參與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。HPV DNA 甲基化可能是宿主對感染的反應(yīng)，但也可能是病變向腫瘤進(jìn)展的表現(xiàn)。目前研究主要集中在HPV L1、L2 區(qū)域CPG 位點的甲基化。有研究指出，HPV31、HPV18 和HPV45 在L2 和L1具有高甲基化區(qū)域，且在CIN3 病毒CpG 位點甲基化增加[29]；HPV16 晚期啟動子內(nèi)病毒CpG 位點的甲基化率可能隨著病變（炎癥-LSIL-HSIL-癌）的程度變化而增加，在宮頸LSIL、HSIL 及宮頸癌樣本中，甲基化率分別為13.6%、31.9%和83.1%。與TCT 檢查相比，HPV DNA 甲基化檢出宮頸HSIL 的敏感度（80.0% vs.76.6%）及約登指數(shù)（0.46 vs.0.31）均較高，且不需要細(xì)胞學(xué)標(biāo)本制備設(shè)備，表現(xiàn)出HPV DNA 甲基化檢測即時分診CIN3+的潛力[30]。

3 結(jié)語與展望

選擇最優(yōu)的聯(lián)合篩查技術(shù)進(jìn)行宮頸病變篩查，是為了使低級別病變與高級別病變完全分化。既要避免自然消退的HPV 感染患者不必要的手術(shù)所導(dǎo)致不良影響，同時也要及時檢測疾病進(jìn)展防治癌前病變進(jìn)展到癌。DNA 甲基化是臨床研究中改進(jìn)診斷、分期和預(yù)測的良好生物學(xué)標(biāo)志物，對于檢出宮頸HSIL+有潛在作用。但是DNA 甲基化作為單一篩選工具的效用有限，聯(lián)合HPV 檢測或分流HPV DNA陽性患者，既可以彌補(bǔ)TCT 檢查的主觀性，又可以避免HPV 檢查假陽性造成的過度轉(zhuǎn)診陰道鏡，可能是一種合理的篩查選擇。