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        HBV對HOXA10表達的影響及其機制研究

        2021-11-29 11:33:42徐莉敏沈振華劉倩倩劉興暉
        檢驗醫(yī)學(xué) 2021年11期
        關(guān)鍵詞:肝癌

        宋 惠, 楊 蘭, 徐莉敏, 沈振華, 劉倩倩, 劉興暉

        (上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院檢驗科,上海 200135)

        有研究結(jié)果顯示,乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染者肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的發(fā)病率比普通人群高出200倍,我國HCC患者中80%有HBV感染史[1]。HBV感染引起HCC的機制目前尚不明確。同源框蛋白A10(homeobox protein A10,HOXA10)屬于人類的同源框(homeobox,HOX)基因,是DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子,擁有序列特異的DNA結(jié)合活性,參與生殖道發(fā)育、胚胎植入的調(diào)控及細胞定向分化和增殖,在胚胎發(fā)育、分化、癌癥和造血系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用[2]。目前,HOXA10在HBV感染中的作用鮮有報道。ZHU等[3]采用基因芯片篩選到HOXA10在整合了HBV全基因組的HepG2.2.15細胞株中呈高表達。為此,本研究擬探討HBV對HOXA10表達的影響及其調(diào)節(jié)的分子機制。

        1 材料和方法

        1.1 研究對象

        選取上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院臨床確診為慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)的患者20例(CHB組),其中男12例、女8例,年齡(43.5±14.9)歲,診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南》(2019年版)[4]。所有患者均排除丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒等其他病毒感染。選取上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院體檢中心既往無病史、無肝炎病毒感染史且體檢報告無任何異常的健康體檢者23名,其中男14名、女9名,年齡(42.7±15.6)歲。本研究經(jīng)上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院倫理委員會批準,所有對象均簽訂知情同意書。

        1.2 材料

        人肝癌細胞系HepG2及HepG2.2.15均購自武漢大學(xué)典藏培養(yǎng)物保藏中心。Lipofectamine 2000、TRIzol R、SYBR GreenER qPCR mix和逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV均購自美國Invitrogen公司。兔抗人HOXA10單克隆抗體及羊抗兔二抗均購自美國Abcam公司。HBV單個基因(S基因、E基因、C基因、X基因和P基因)的真核表達質(zhì)粒pCMV-S、pCMV-E、pCMV-C、pCMV-X、pCMV-P及含有HOXA10基因啟動子的熒光素酶報告基因pGL3-HOXA10由本實驗室自行構(gòu)建[4]。

        1.3 細胞培養(yǎng)

        將HepG2細胞和穩(wěn)定表達HBV的HepG2.2.15細胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。

        1.4 細胞轉(zhuǎn)染

        當細胞密度達到60%~70%時,用100 μL Opti-MEM減血清培養(yǎng)基分別稀釋pCMV-S、pCMV-E、pCMV-C、pCMV-X、pCMV-P、空載體pCMV-tag2B、pGL3-HOXA10和Lipofectamine 2000,稀釋比例均為1∶2,室溫放置5~10 min后混勻,繼續(xù)靜置5~10 min,將配好的Lipofectamine 2000和質(zhì)粒懸液加入細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng),4~6 h后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

        1.5 外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)分離

        在15 mL離心管中加入3 mL淋巴細胞分離液(景德鎮(zhèn)市美景生物科技有限公司),取1 mL抗凝血樣本,加入等體積磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)稀釋后混勻,緩慢加至淋巴細胞分離液的液面上,117×g離心20 min,小心環(huán)吸乳白色單個核細胞層。

        1.6 RT-qPCR

        將X基因真核表達質(zhì)粒p C M V-X和空載體pCMV-tag2B分別轉(zhuǎn)染HepG2細胞,采用TRIzol R試劑提取細胞總RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA(complementary DNA,cDNA),采用ABI 7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)及SYBR GreenER qPCR mix試劑盒[實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)]檢測HOXA10基因,引物序列:HOXA10上游引物為5'-CTCTACGACTCGGCGGACAA-3',下游引物為5'-GGCCTGAGAAAGGCGGAAGT-3',以HOXA10 mRNA/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)mRNA比值作為HOXA10 mRNA的相對表達量。

        1.7 免疫印跡法檢測HOXA10蛋白的表達

        配制用于十二烷基硫酸鈉(s o d i u m dodecyl sulfate,SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)的濃縮膠(含5%丙烯酰胺)及分離膠(含10%濃縮膠)。提取細胞總蛋白,采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法測定總蛋白濃度,每份樣本的上樣量約為 40 μg,加入5×蛋白上樣緩沖液,煮沸5 min。70 V恒壓電泳,待樣本電泳進入分離膠后,改為100 V恒壓電泳,180 mA轉(zhuǎn)膜2 h,5%脫脂奶粉封閉1 h,磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate-buffered saline Tween-20,PBST)清洗,加入一抗,4 ℃孵育過夜,PBST洗膜3次,加入二抗,室溫孵育1 h,再次用PBST洗膜,將聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜置于ECL顯色液中,孵育5 min,用ImageQuant LAS 4000化學(xué)發(fā)光成像分析儀(美國GE公司)收集顯色信號,保存圖片。以HOXA10/GAPDH比值作為HOXA10蛋白的相對表達量。

        1.8 熒光素酶活性測定

        將pCMV-S、pCMV-E、pCMV-C、pCMV-X、pCMV-P分別與pGL3-HOXA10用Lipofectin2000共轉(zhuǎn)染HepG2細胞,以轉(zhuǎn)染空載體pCMV-tag2B的HepG2細胞作為對照。轉(zhuǎn)染48 h后加入RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司)進行裂解,取10 μL裂解液與100 μL熒光色素酶底物(廣州賽誠公司)充分混勻,用Luminometer化學(xué)發(fā)光酶標儀(美國Maxweu Sensors公司)測定熒光素酶活性。

        1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

        用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示,2個組之間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 不同肝癌細胞系及CHB組、正常對照組HOXA10 mRNA和蛋白的表達

        HepG2.2.15細胞中HOXA10 mRNA和蛋白的相對表達量均顯著高于HepG2細胞(P=0.001)。見圖1。

        圖1 不同肝癌細胞系HOXA10 mRNA和蛋白的表達

        HBV患者PBMC中HOXA10 mRNA的相對表達量為1.37±0.21,顯著高于正常對照組(0.28±0.03)(P=0.001)。

        2.2 轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的HepG2細胞之間熒光素酶活性比較

        轉(zhuǎn)染pCMV-tag2B、pCMV-S、pCMV-E、pCMV-C、pCMV-X和pCMV-P的HepG2細胞的熒光素酶活性分別為(269.33±27.24)、(295.12±25.53)、(255.42±26.33)、(289.23±23.65)、(1 235.65±62.21)和(302.33±38.31)RUL/μg蛋白。轉(zhuǎn)染pCMV-X的HepG2細胞的熒光素酶活性顯著高于轉(zhuǎn)染空載體pCMV-tag2B的HepG2細胞(P=0.001),轉(zhuǎn)染其他質(zhì)粒的HepG2細胞之間熒光素酶活性差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

        2.3 轉(zhuǎn)染pCMV-X的HepG2細胞與轉(zhuǎn)染空載體pCMV-tag2B的HepG2細胞之間HOXA10 mRNA和蛋白表達的比較

        轉(zhuǎn)染pCMV-X的HepG2細胞HOXA10 mRNA和蛋白的相對表達量均顯著高于轉(zhuǎn)染空載體pCMV-tag2B的HepG2細胞(P=0.001)。見圖2。

        圖2 轉(zhuǎn)染pCMV-X的HepG2細胞與轉(zhuǎn)染空載體pCMV-tag2B的HepG2細胞之間HOXA10 mRNA和蛋白相對表達量的比較

        3 討論

        有研究結(jié)果顯示,HOXA10基因高表達與白血病、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[6]。HOXA10啟動子的甲基化水平與高表達HOXA10的腦膠質(zhì)瘤和乳腺癌有關(guān)[7-8]。TANG等[8]的研究結(jié)果顯示,miR-135a是HOXA10的靶點RNA,抑制HOXA10的過表達能夠抑制卵巢癌細胞的生長和黏附;同時,敲除HOXA10后能夠抑制細胞的凋亡。

        HBV是肝癌的主要誘因之一,但其致病機制不明。為深入探討HBV的致癌機制,本課題組前期采用基因芯片篩選了HepG2細胞與穩(wěn)定表達HBV的Hep2.2.15細胞中表達有差異的基因[3],發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達HBV的HepG2.2.15細胞中HOXA10的表達高于HepG2細胞。本研究采用RT-qPCR和免疫印跡法對基因芯片的檢測結(jié)果進行了驗證。

        HBV可以被吞噬進入PBMC,并刺激PBMC產(chǎn)生某些細胞因子,以回應(yīng)病毒的感染。本研究結(jié)果顯示,HBV患者PBMC中HOXA10表達升高。HBV屬于嗜肝DNA病毒科,為部分雙鏈環(huán)狀DNA分子,其基因組含有4個開放讀碼框,分別為S、C、P和X;其中,X基因編碼154個氨基酸殘基的X蛋白,相對分子質(zhì)量為17 000,與致癌作用密切相關(guān)[9-10]。YANG等[11]發(fā)現(xiàn),HBV通過上調(diào)HOXA10的表達促進HBV的復(fù)制,但具體通過哪個基因調(diào)節(jié)HOXA10的表達尚不清楚。為深入探討HBV調(diào)節(jié)HOXA10表達的分子機制,本研究檢測了HBV各個基因的真核表達質(zhì)粒(pCMV-S、pCMV-E、pCMV-C、pCMV-X、pCMV-P)對HOXA10基因啟動子活性的影響。結(jié)果顯示,HBVX基因能夠上調(diào)HOXA10的啟動子活性,上調(diào)HOXA10 mRNA和蛋白的表達。由此可見,HBV可能是通過其X基因上調(diào)HOXA10的表達。

        HBV X蛋白具有多種調(diào)節(jié)功能,包括調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄修飾、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期和凋亡,在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用,參與肝癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)化[12-14]。HBVX基因可以調(diào)節(jié)多種宿主蛋白的表達,參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[15]。LI等[16]的研究結(jié)果顯示,HBVX基因能夠上調(diào)趨化因子CCL15的表達,且CCL15的表達水平與疾病預(yù)后相關(guān)。LIU等[5]的研究結(jié)果顯示,HBV通過其X基因調(diào)節(jié)羧基末端結(jié)合蛋白2的表達來參與肝癌的形成。ZHANG等[17]發(fā)現(xiàn),敲除HOXA10后可抑制肝癌細胞的增殖,并通過調(diào)節(jié)組蛋白脫乙酰基酶的轉(zhuǎn)錄來促進肝癌細胞的凋亡。

        綜上所述,HBV可能通過其X基因調(diào)節(jié)HOXA10的表達來參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展。但HBVX基因調(diào)節(jié)HOXA10表達的具體分子機制還有待進一步研究。

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