宋 惠， 楊 蘭， 徐莉敏， 沈振華， 劉倩倩， 劉興暉

（上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院檢驗科，上海 200135）

有研究結(jié)果顯示，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染者肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的發(fā)病率比普通人群高出200倍，我國HCC患者中80%有HBV感染史[1]。HBV感染引起HCC的機制目前尚不明確。同源框蛋白A10（homeobox protein A10，HOXA10）屬于人類的同源框（homeobox，HOX）基因，是DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，擁有序列特異的DNA結(jié)合活性，參與生殖道發(fā)育、胚胎植入的調(diào)控及細胞定向分化和增殖，在胚胎發(fā)育、分化、癌癥和造血系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用[2]。目前，HOXA10在HBV感染中的作用鮮有報道。ZHU等[3]采用基因芯片篩選到HOXA10在整合了HBV全基因組的HepG2.2.15細胞株中呈高表達。為此，本研究擬探討HBV對HOXA10表達的影響及其調(diào)節(jié)的分子機制。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院臨床確診為慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的患者20例（CHB組），其中男12例、女8例，年齡（43.5±14.9）歲，診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南》（2019年版）[4]。所有患者均排除丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒等其他病毒感染。選取上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院體檢中心既往無病史、無肝炎病毒感染史且體檢報告無任何異常的健康體檢者23名，其中男14名、女9名，年齡（42.7±15.6）歲。本研究經(jīng)上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院倫理委員會批準，所有對象均簽訂知情同意書。

1.2 材料

人肝癌細胞系HepG2及HepG2.2.15均購自武漢大學(xué)典藏培養(yǎng)物保藏中心。Lipofectamine 2000、TRIzol R、SYBR GreenER qPCR mix和逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV均購自美國Invitrogen公司。兔抗人HOXA10單克隆抗體及羊抗兔二抗均購自美國Abcam公司。HBV單個基因（S基因、E基因、C基因、X基因和P基因）的真核表達質(zhì)粒pCMV-S、pCMV-E、pCMV-C、pCMV-X、pCMV-P及含有HOXA10基因啟動子的熒光素酶報告基因pGL3-HOXA10由本實驗室自行構(gòu)建[4]。

1.3 細胞培養(yǎng)

將HepG2細胞和穩(wěn)定表達HBV的HepG2.2.15細胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染

當細胞密度達到60%～70%時，用100 μL Opti-MEM減血清培養(yǎng)基分別稀釋pCMV-S、pCMV-E、pCMV-C、pCMV-X、pCMV-P、空載體pCMV-tag2B、pGL3-HOXA10和Lipofectamine 2000，稀釋比例均為1∶2，室溫放置5～10 min后混勻，繼續(xù)靜置5～10 min，將配好的Lipofectamine 2000和質(zhì)粒懸液加入細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，4～6 h后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）分離

在15 mL離心管中加入3 mL淋巴細胞分離液（景德鎮(zhèn)市美景生物科技有限公司），取1 mL抗凝血樣本，加入等體積磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）稀釋后混勻，緩慢加至淋巴細胞分離液的液面上，117×g離心20 min，小心環(huán)吸乳白色單個核細胞層。

1.6 RT-qPCR

將X基因真核表達質(zhì)粒p C M V-X和空載體pCMV-tag2B分別轉(zhuǎn)染HepG2細胞，采用TRIzol R試劑提取細胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA（complementary DNA，cDNA），采用ABI 7500實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）及SYBR GreenER qPCR mix試劑盒[實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）]檢測HOXA10基因，引物序列：HOXA10上游引物為5'-CTCTACGACTCGGCGGACAA-3'，下游引物為5'-GGCCTGAGAAAGGCGGAAGT-3'，以HOXA10 mRNA/甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）mRNA比值作為HOXA10 mRNA的相對表達量。

1.7 免疫印跡法檢測HOXA10蛋白的表達

配制用于十二烷基硫酸鈉（s o d i u m dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）的濃縮膠（含5%丙烯酰胺）及分離膠（含10%濃縮膠）。提取細胞總蛋白，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定總蛋白濃度，每份樣本的上樣量約為 40 μg，加入5×蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min。70 V恒壓電泳，待樣本電泳進入分離膠后，改為100 V恒壓電泳，180 mA轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h，磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate-buffered saline Tween-20，PBST）清洗，加入一抗，4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次，加入二抗，室溫孵育1 h，再次用PBST洗膜，將聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜置于ECL顯色液中，孵育5 min，用ImageQuant LAS 4000化學(xué)發(fā)光成像分析儀（美國GE公司）收集顯色信號，保存圖片。以HOXA10/GAPDH比值作為HOXA10蛋白的相對表達量。

1.8 熒光素酶活性測定

將pCMV-S、pCMV-E、pCMV-C、pCMV-X、pCMV-P分別與pGL3-HOXA10用Lipofectin2000共轉(zhuǎn)染HepG2細胞，以轉(zhuǎn)染空載體pCMV-tag2B的HepG2細胞作為對照。轉(zhuǎn)染48 h后加入RIPA裂解液（北京索萊寶科技有限公司）進行裂解，取10 μL裂解液與100 μL熒光色素酶底物（廣州賽誠公司）充分混勻，用Luminometer化學(xué)發(fā)光酶標儀（美國Maxweu Sensors公司）測定熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同肝癌細胞系及CHB組、正常對照組HOXA10 mRNA和蛋白的表達

HepG2.2.15細胞中HOXA10 mRNA和蛋白的相對表達量均顯著高于HepG2細胞（P=0.001）。見圖1。

圖1 不同肝癌細胞系HOXA10 mRNA和蛋白的表達

HBV患者PBMC中HOXA10 mRNA的相對表達量為1.37±0.21，顯著高于正常對照組（0.28±0.03）（P=0.001）。

2.2 轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的HepG2細胞之間熒光素酶活性比較

轉(zhuǎn)染pCMV-tag2B、pCMV-S、pCMV-E、pCMV-C、pCMV-X和pCMV-P的HepG2細胞的熒光素酶活性分別為（269.33±27.24）、（295.12±25.53）、（255.42±26.33）、（289.23±23.65）、（1 235.65±62.21）和（302.33±38.31）RUL/μg蛋白。轉(zhuǎn)染pCMV-X的HepG2細胞的熒光素酶活性顯著高于轉(zhuǎn)染空載體pCMV-tag2B的HepG2細胞（P=0.001），轉(zhuǎn)染其他質(zhì)粒的HepG2細胞之間熒光素酶活性差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 轉(zhuǎn)染pCMV-X的HepG2細胞與轉(zhuǎn)染空載體pCMV-tag2B的HepG2細胞之間HOXA10 mRNA和蛋白表達的比較

轉(zhuǎn)染pCMV-X的HepG2細胞HOXA10 mRNA和蛋白的相對表達量均顯著高于轉(zhuǎn)染空載體pCMV-tag2B的HepG2細胞（P=0.001）。見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染pCMV-X的HepG2細胞與轉(zhuǎn)染空載體pCMV-tag2B的HepG2細胞之間HOXA10 mRNA和蛋白相對表達量的比較

3 討論

有研究結(jié)果顯示，HOXA10基因高表達與白血病、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[6]。HOXA10啟動子的甲基化水平與高表達HOXA10的腦膠質(zhì)瘤和乳腺癌有關(guān)[7-8]。TANG等[8]的研究結(jié)果顯示，miR-135a是HOXA10的靶點RNA，抑制HOXA10的過表達能夠抑制卵巢癌細胞的生長和黏附；同時，敲除HOXA10后能夠抑制細胞的凋亡。

HBV是肝癌的主要誘因之一，但其致病機制不明。為深入探討HBV的致癌機制，本課題組前期采用基因芯片篩選了HepG2細胞與穩(wěn)定表達HBV的Hep2.2.15細胞中表達有差異的基因[3]，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達HBV的HepG2.2.15細胞中HOXA10的表達高于HepG2細胞。本研究采用RT-qPCR和免疫印跡法對基因芯片的檢測結(jié)果進行了驗證。

HBV可以被吞噬進入PBMC，并刺激PBMC產(chǎn)生某些細胞因子，以回應(yīng)病毒的感染。本研究結(jié)果顯示，HBV患者PBMC中HOXA10表達升高。HBV屬于嗜肝DNA病毒科，為部分雙鏈環(huán)狀DNA分子，其基因組含有4個開放讀碼框，分別為S、C、P和X；其中，X基因編碼154個氨基酸殘基的X蛋白，相對分子質(zhì)量為17 000，與致癌作用密切相關(guān)[9-10]。YANG等[11]發(fā)現(xiàn)，HBV通過上調(diào)HOXA10的表達促進HBV的復(fù)制，但具體通過哪個基因調(diào)節(jié)HOXA10的表達尚不清楚。為深入探討HBV調(diào)節(jié)HOXA10表達的分子機制，本研究檢測了HBV各個基因的真核表達質(zhì)粒（pCMV-S、pCMV-E、pCMV-C、pCMV-X、pCMV-P）對HOXA10基因啟動子活性的影響。結(jié)果顯示，HBVX基因能夠上調(diào)HOXA10的啟動子活性，上調(diào)HOXA10 mRNA和蛋白的表達。由此可見，HBV可能是通過其X基因上調(diào)HOXA10的表達。

HBV X蛋白具有多種調(diào)節(jié)功能，包括調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄修飾、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期和凋亡，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用，參與肝癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)化[12-14]。HBVX基因可以調(diào)節(jié)多種宿主蛋白的表達，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[15]。LI等[16]的研究結(jié)果顯示，HBVX基因能夠上調(diào)趨化因子CCL15的表達，且CCL15的表達水平與疾病預(yù)后相關(guān)。LIU等[5]的研究結(jié)果顯示，HBV通過其X基因調(diào)節(jié)羧基末端結(jié)合蛋白2的表達來參與肝癌的形成。ZHANG等[17]發(fā)現(xiàn)，敲除HOXA10后可抑制肝癌細胞的增殖，并通過調(diào)節(jié)組蛋白脫乙酰基酶的轉(zhuǎn)錄來促進肝癌細胞的凋亡。

綜上所述，HBV可能通過其X基因調(diào)節(jié)HOXA10的表達來參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展。但HBVX基因調(diào)節(jié)HOXA10表達的具體分子機制還有待進一步研究。