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        面膜類化妝品微生物檢查方法學研究

        2021-11-29 05:03:42
        天津藥學 2021年5期

        杭 婧

        (淮安市食品藥品檢驗所,江蘇 223300)

        面膜是當今社會最常見的日用化妝品之一,尤其受愛美女士的喜愛。不同功能的面膜有不同的功效,如深層清潔、淡斑祛痘、補水保濕、改善暗沉膚色等?;瘖y品成份中含豐富的蛋白質、脂肪、多種維生素、無機鹽和水分,pH值約4~7,極利于微生物的生長和繁殖,導致化妝品腐敗變質,嚴重影響化妝品的衛(wèi)生質量與使用的安全性,對人們的健康造成危害[1]。面膜類化妝品一旦受到微生物污染,就會引起皮膚感染或者過敏。為了抑制面膜內微生物的生長,商家在面膜產品中添加了多種類別的防腐劑,有的是單一防腐劑,有的是聯(lián)合添加不同類別的防腐劑以達到更好的抑菌效果。由于面膜類產品中防腐抑菌劑存在實際添加與標簽不一致的情況[2],防腐劑的濫用容易出現(xiàn)樣品陽性菌檢出率低甚至“全部合格”的情況。本文參考《中國藥典》2020年版微生物限度檢查方法進行方法驗證,以消除產品抑菌物質的影響,提高陽性檢出率,真實地反應樣品受微生物污染的程度。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器 潔凈工作臺(BCM-1600A,蘇州安泰空氣技術有限公司);電熱恒溫鼓風干燥箱(101-3,上海躍進有限公司);SPX-350型生化培養(yǎng)箱;高壓蒸汽滅菌鍋(MLS-3781L-PC型,松下);生物安全柜(BSC-1304IIA2,蘇州安泰空氣技術有限公司);電子天平(PL6001,梅特勒公司)。

        1.2 試驗樣品 樣品A:Dr.magic黑金備長炭控油凈致面膜(批號WR022D,科絲美詩廣州化妝品有限公司);樣品B:SKIN Advanced卓沿白金水耀肌光感晶潤煥采面膜(批號202309010I01,華安堂生物科技集團有限公司);樣品C:御泥坊清爽平衡泥漿面膜(批號N352G11F,湖南歐標化妝品有限公司);樣品D:紐西之謎南極冰藻清爽保濕面膜(批號LC082201BB,上海利萊日化有限公司);樣品E:歐束夢幻臻顏修護面膜(批號20190902,廣東巧巧生物科技有限公司)。以上樣品均來自2021年國家監(jiān)督抽檢。

        1.3 菌株 枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]、大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]均來源于中國食品藥品檢定研究院。

        1.4 培養(yǎng)基與試劑 卵磷脂-吐溫80營養(yǎng)瓊脂(批號1090181),孟加拉紅(虎紅)瓊脂(批號1096661)、SCDLP液體培養(yǎng)基(批號1087061),雙倍乳糖膽鹽(含中和劑)培養(yǎng)基(批號1080131)、Baird-Parker瓊脂基礎(批號1092405)、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基(批號1081171)、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基(批號1091601),以上培養(yǎng)基規(guī)格均為250 g,均來源于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;卵黃亞碲酸鉀增菌液(批號6108128),廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。無菌氯化鈉注射液(250 ml∶2.25 g,批號200514 2C),江蘇淮安雙鶴藥業(yè)有限責任公司。

        2 方法

        2.1 菌液制備 選取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的三代新鮮培養(yǎng)物,用無菌氯化鈉注射液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液。

        2.2 供試液制備 按照2015年版《化妝品安全技術規(guī)范》[3]進行供試液(1∶10和1∶100)制備。

        2.3 微生物計數(shù)方法適用性試驗

        2.3.1 常規(guī)法 ①試驗組:取供試液1 ml加入“2.1”項下制備的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌懸液,混勻,傾注卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,待瓊脂凝固后,翻轉平皿,置36℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48 h,霉菌和酵母菌傾注虎紅培養(yǎng)基,置28℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)5 d,同時均設空白對照。②菌液組:取稀釋液代替供試液,按試驗組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。③供試品對照組:取制備好的供試液,以稀釋液代替菌液同試驗組操作。參考《中國藥典》2020年版四部,5種試驗菌回收率在50%~200%,符合方法適用性試驗要求。若試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值小于菌液對照組菌落數(shù)的50%,可采用稀釋法、薄膜過濾法等方法。

        2.3.2 培養(yǎng)基稀釋法 試驗組:分別取1∶10供試液0.5 ml/皿和1∶100供試液1 ml/皿加入5種試驗菌液,混勻,其余操作同常規(guī)法。

        2.4 控制菌方法適用性試驗

        2.4.1 常規(guī)法 ①耐熱大腸菌群(10 ml/管):取1∶10樣品供試液10 ml,分別接種于2管10 ml雙倍乳糖膽鹽(含中和劑)培養(yǎng)基,其中一管不加菌作為陰性對照組,另一管加入不大于100 cfu的大腸埃希菌作為試驗組。②銅綠假單胞菌(90 ml/瓶):取1∶10樣品供試液10 ml,分別接種于90 ml的SCDLP培養(yǎng)基中,其中一瓶不加菌作為陰性對照組,另一管加入不大于100 cfu的銅綠假單胞菌作為試驗組。③金黃色葡萄球菌(90 ml/瓶):取1∶10樣品供試液10 ml,分別接種于90 ml的SCDLP培養(yǎng)基中,其中一瓶不加菌作為陰性對照組,另一瓶加入不大于100 cfu的金黃色葡萄球菌作為試驗組。

        2.4.2 稀釋法 銅綠假單胞菌(200 ml/瓶):取1∶10樣品供試液10 ml,分別接種于200 ml的SCDLP培養(yǎng)基中,其中一瓶不加菌作為陰性對照組,另一瓶加入不大于100 cfu的銅綠假單胞菌作為試驗組,置36℃培養(yǎng)24 h,劃線于十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基,置36℃培養(yǎng)24 h,觀察結果。

        3 結果與分析

        3.1 微生物限度回收率 以《中國藥典》2020年版中各試驗菌回收率在50%~200%為參考標準,樣品C采用常規(guī)法檢驗的枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌均小于50%,采用1∶100供試液1 ml/皿稀釋法時,枯草芽孢桿菌回收率達到60%,銅綠假單胞菌達到83%,采用1∶10供試液0.5 ml/皿稀釋法時,白色念珠菌回收率達到77%。樣品D采用常規(guī)法檢驗時銅綠假單胞菌小于50%,直到采用1∶100供試液1 ml/皿稀釋法時,回收率達到62%。樣品A、B、E采用常規(guī)法檢驗時各試驗菌回收率均達到要求(大于50%),結果見表1。

        表1 計數(shù)方法適用性試驗回收率 %

        3.2 控制菌檢查方法適用性 Dr.magic黑金備長炭控油凈致面膜(樣品A)、SKIN Advanced卓沿白金水耀肌光感晶潤煥采面膜(樣品B)、御泥坊清爽平衡泥漿面膜(樣品C)和歐束夢幻臻顏修護面膜(樣品E)采用常規(guī)法進行控制菌(耐熱大腸菌群10 ml/管、金黃色葡萄球菌90 ml/瓶、銅綠假單胞菌90 ml/瓶)方法學驗證時,試驗菌均可檢出,陰性對照組均無菌生長,可見樣品A、B、C和E可采用常規(guī)法進行試驗。紐西之謎南極冰藻清爽保濕面膜(樣品D)采用90 ml/瓶進行銅綠假單胞菌進行試驗時,試驗菌未生長,培養(yǎng)基體積增加至200 ml/瓶時,檢出銅綠假單胞菌,陰性對照組均未長菌??梢姌悠稤可采用培養(yǎng)基稀釋法進行試驗。見表2-4。

        表2 耐熱大腸菌群方法學研究結果

        表3 金黃色葡萄球菌方法學研究結果

        表4 銅綠假單胞菌方法學研究結果

        4 討論

        4.1 包文君[4]對臺州市1 978份化妝品進行微生物檢查,合格率為98.43%。李海芳等[5]對新疆2016—2018年度進行541批化妝品微生物指標檢測,總合格率為95.7%。由此可見,化妝品微生物合格率存在普遍偏高的現(xiàn)象,論其原因:一方面是生產廠家對產品質量把控嚴格,產品質量過硬。另一方面就是產品內存在抑制微生物生長的成分,使得產品基質不適合微生物生長,導致微生物生長的概率很小或者完全不生長?;瘖y品中防腐劑可以抑制微生物的生長繁殖,雖然化妝品培養(yǎng)基中吐溫80和卵磷脂起到一定的中和作用,但是不能完全中和產品內所有的抑菌成分,故建議對現(xiàn)有化妝品微生物檢驗方法進行改進,增加供試品陽性對照。面膜類化妝品尤其是需要長期開口的面膜,開口使用之后應注意存放條件,以免因儲存不當造成微生物的入侵,引起皮膚感染。

        4.2 對于霉菌和酵母菌檢測,因考慮到霉菌孢子的生長特點,建議放培養(yǎng)箱之后逐天觀察,以免按規(guī)定溫度培養(yǎng)之后出現(xiàn)霉菌成片狀生長、無法計數(shù)或者造成計數(shù)減少的情況;對于測定耐熱大腸菌群的雙倍乳糖膽鹽(含中和劑)發(fā)酵管,由于部分面膜類化妝品基質黏稠,與培養(yǎng)基液體不融合甚至出現(xiàn)分層的現(xiàn)象,化妝品基質沉淀覆蓋住產氣的小導管,進而導致觀察發(fā)酵管產酸產氣較為困難,因此檢測耐熱大腸的培養(yǎng)基以及檢測方法有待改進。

        4.3 5種面膜類化妝品采用常規(guī)法檢驗時,一部分試驗菌回收率低于50%,如御泥坊清爽平衡泥漿面膜(樣品C)和紐西之謎南極冰藻清爽保濕面膜(樣品D),若參照現(xiàn)行化妝品安全技術規(guī)范中微生物檢查法進行檢驗,則會出現(xiàn)假陰性的結果,這樣很容易給市場監(jiān)管起到誤導的作用。在微生物方法適用性檢查中,對抑菌含量低的供試品,可通過培養(yǎng)基稀釋法減少供試品抑菌物質的濃度,從而消除其對微生物生長的影響[6]。御泥坊清爽平衡泥漿面膜(樣品C)采用稀釋法(1∶100供試液1 ml/皿)進行需氧菌試驗,稀釋法(1∶10供試液0.5 ml/皿)進行酵母菌試驗,可以真實反應樣品的微生物污染情況,使之更符合化妝品質量控制的要求。

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