關(guān)瑩，薛敏，王偉

(1.大連海洋大學(xué)，遼寧省北方魚類應(yīng)用生物學(xué)與增養(yǎng)殖重點(diǎn)實驗室， 遼寧 大連 116023；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，國家水產(chǎn)飼料安全評價基地；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室:北京 100081)

隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展和集約化養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖水環(huán)境惡化、魚類疾病暴發(fā)現(xiàn)象難以避免，進(jìn)而造成了因抗生素使用而導(dǎo)致的環(huán)境污染等問題[1-3]。近年來，人民對水產(chǎn)品質(zhì)量的追求不斷提高，養(yǎng)殖業(yè)涉及的飼料安全成為重要問題，并且當(dāng)前飼料資源也呈現(xiàn)日益緊缺的態(tài)勢，所以飼料行業(yè)所面臨的問題主要是提高飼料資源的利用率和保障飼料安全。綠色飼料添加劑是一種對動物不產(chǎn)生毒害作用、在動物產(chǎn)品中不產(chǎn)生有害殘留和動物養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的排泄物不污染環(huán)境的飼料添加劑[4]。為了提高飼料安全和水產(chǎn)品質(zhì)量安全，綠色飼料添加劑的研發(fā)和應(yīng)用是尤為重要的。隨著飼料工業(yè)和酶制劑工業(yè)的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了酶制劑這種具有提高配合飼料質(zhì)量穩(wěn)定性、提高飼料利用率和降低環(huán)境污染等作用的飼料添加劑，其能在一定程度上緩解目前飼料資源緊缺的現(xiàn)狀。酶制劑是綠色飼料添加劑中的一種，指酶經(jīng)過提純、加工而成的具有高度專一性的生物催化劑，其在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用已有廣泛研究，但在生產(chǎn)實踐中受熱敏性限制，并未被廣泛應(yīng)用。近年來，隨著多道真空后噴涂技術(shù)在水產(chǎn)飼料企業(yè)中的應(yīng)用，使得液體酶制劑在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用成為可能。

1 飼用酶制劑的種類和應(yīng)用

飼用酶制劑的種類繁多，主要包括：蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、β-甘露聚糖酶、纖維素酶、脂肪酶、麥芽糖酶、淀粉酶、果膠酶、角蛋白酶、木聚糖酶和植酸酶等[5]。按照其所含酶種類的多少，可將飼用酶制劑分為單一酶制劑和復(fù)合酶制劑2種[6]。單一酶制劑包括植酸酶、淀粉酶、非淀粉多糖酶、蛋白酶和脂肪酶等。復(fù)合酶制劑是由一種或幾種單一酶制劑與其他單一酶制劑混合配制而成，或者是經(jīng)過一種或幾種微生物發(fā)酵而成。

1.1 非淀粉多糖酶

非淀粉多糖(NSP)是主要存在于玉米芯、甘蔗渣、麥麩和秸稈中的多聚體，抗?fàn)I養(yǎng)作用較強(qiáng)，并且可以使消化道食糜黏度提高，從而使動物對飼料養(yǎng)分的消化利用率降低[7]。非淀粉多糖酶主要包括纖維素酶、β-葡聚糖酶、果膠酶和木聚糖酶等，可以降解飼料中NSP的多聚體、使NSP的抗?fàn)I養(yǎng)性降低，進(jìn)而使飼料利用率提高[8]。NSP水解后，可以被有益的微生物利用而產(chǎn)生乳酸和有機(jī)酸，減少氨的產(chǎn)生，使揮發(fā)性脂肪酸的濃度提高，從而促進(jìn)動物機(jī)體的健康，提高生產(chǎn)性能[9-10]。對大菱鲆(Scophthalmusmaximus)幼魚、赤眼鱒(Squaliobarbuscurriculus)、黃斑藍(lán)子魚(Siganuscanaliculatus)和花鱸(Lateolabraxjaponicus)的研究結(jié)果表明，飼料中添加非淀粉多糖酶可以顯著提高生長性能、魚體肥滿度、腸道和胃的淀粉酶活性,并且降低飼料系數(shù)。最新研究表明，在大菱鲆幼魚和赤眼鱒飼料中添加非淀粉多糖酶，可以提高營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率、飼料干物質(zhì)消化率和抗氧化能力[11-14]。

1.2 植酸酶

植酸酶，又稱為肌醇六磷酸水解酶，大多在植物的果實和籽粒中存在，是植物性飼料中磷元素的主要儲存形式[15]。植酸酶是一種由微生物發(fā)酵而產(chǎn)生的酶制劑，可以將植物中的植酸及其鹽類催化降解為肌醇和無機(jī)磷，從而提高動物機(jī)體對飼料中磷的利用率，減少磷的排泄量，減少環(huán)境污染[16]。對雜交鱘、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)、異育銀鯽(Carassiusauratusgibeli)、建鯉(Cyprinuscarpiovar.Jian)、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)和花鱸的研究結(jié)果表明，飼料中添加植酸酶可以顯著提高生長性能和磷的消化率，并減少磷的排放量。同時表明，在中華絨螯蟹和建鯉飼料中添加植酸酶，可以提高消化酶活力和抗氧化能力，并降低魚體粗脂肪含量[17-22]。在魚類飼料使用中，植酸酶需結(jié)合魚類腸道pH特點(diǎn)來應(yīng)用：有胃魚的消化道pH較低，胃液可以分泌鹽酸，因此對酸性植酸酶比較適用；而無胃魚的消化道pH為6.8～7.3，所以中性植酸酶適合應(yīng)用于無胃魚的飼料中，酸性植酸酶在異育銀鯽體內(nèi)幾乎不發(fā)揮作用[23-24]。

1.3 蛋白酶

蛋白酶是催化分解肽鍵的一類酶的總稱，可以將蛋白質(zhì)降解為小分子的蛋白胨、肽和氨基酸，補(bǔ)充動物體內(nèi)源酶的不足，從而提高動物對蛋白質(zhì)的消化利用率,減輕水體污染。將蛋白酶按照最適pH值分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶3種[25]；將蛋白酶按不同來源分為動物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋白酶3種。胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶等來源于動物；木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和無花果蛋白酶等來源于植物；堿性蛋白酶Alcalase、復(fù)合蛋白酶Protamex、中性蛋白酶Neutrase以及放線菌I66、酸性蛋白酶黑曲霉3350等來源于微生物。在對吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)、羅非魚、鯉魚(Cyprinuscarpio)、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)和虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的研究中表明，飼料中添加蛋白酶可以顯著提高生長性能、肝胰臟和腸道消化酶活性、改善腸道組織結(jié)構(gòu)，并降低飼料系數(shù)。研究結(jié)果表明，在吉富羅非魚、凡納濱對蝦和虹鱒的飼料中添加蛋白酶，可以減少腸道菌群中弧菌屬的數(shù)量，并顯著提高干物質(zhì)利用率[26-30]。

1.4 淀粉酶

淀粉酶是一種由動物機(jī)體分泌并幫助其自身消化的活性物質(zhì)，可以分解各種淀粉糖苷鍵，對淀粉有專門水解作用的一類酶的總稱[31]。按照淀粉水解形式的不同，可分為α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和脫支酶：α-淀粉酶存在于植物、動物及微生物中，主要由枯草桿菌、芽孢桿菌、吸水鏈霉菌、米曲霉、黑曲霉及擴(kuò)展青霉等微生物產(chǎn)生；β-淀粉酶存在于植物和微生物中，主要由曲霉、根霉和內(nèi)孢霉等微生物產(chǎn)生；糖化酶存在于動物、細(xì)菌和霉菌中，主要由根霉、黑曲霉、擬內(nèi)孢酶和紅曲霉等霉菌產(chǎn)生[32-33]。由于動物本身發(fā)育的不完善，特別是幼齡動物，消化系統(tǒng)發(fā)育還不完善，導(dǎo)致腸道無法分泌足夠的內(nèi)源淀粉酶，從而降低動物機(jī)體對淀粉酶的利用率[34]，外源添加淀粉酶可彌補(bǔ)動物腸道內(nèi)源淀粉酶的不足，提高其對淀粉的消化能力、表觀代謝能和養(yǎng)分消化率，從而提高動物的生長性能[35]。黃燕華等[36]研究表明，飼料中添加150 mg/kg的淀粉酶對凡納濱對蝦的生長性能無顯著影響。近幾年，單一淀粉酶在畜禽動物上的應(yīng)用較多，但在水產(chǎn)動物上研究較少，大多是作為復(fù)合酶制劑的一種酶成分添加到飼料中使用。

1.5 脂肪酶

脂肪酶能夠催化長鏈脂肪酸甘油酯并將其水解，在動物機(jī)體脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要作用。脂肪酶將飼料中的甘油三酯水解后，生成的脂肪酸、甘油二酯和甘油單酯才可以被動物體機(jī)體所吸收[37]。脂肪酶有動物、植物和微生物3種來源，微生物脂肪酶因其穩(wěn)定性、選擇性和廣泛的底物專一性而受到特別關(guān)注[38-39]。在飼料中添加脂肪酶，可以有效補(bǔ)充水產(chǎn)動物內(nèi)源消化酶的不足，提高水產(chǎn)動物生長過程中對于脂肪的吸收和利用，補(bǔ)充動物所需的必需脂肪酸，提高消化酶活性[40]。Fei等[41]研究表明，日糧中添加外源性脂肪酶YLL2能顯著改善雜交鱘的生長性能，增加DHA和EPA的含量，有助于維持腸道的物理屏障，提高其免疫能力。王國霞等[42]研究表明，在低蛋白質(zhì)高脂肪飼料中添加脂肪酶,可以降低花鱸的臟體比和脂體比，提高機(jī)體抗氧化能力，但花鱸生長性能、粗脂肪和部分脂肪酸表觀消化率有所下降。Liu等[43]研究表明，飼料中添加1 193 U/kg脂肪酶，可以提高草魚(Ctenopharyngodonidella)幼魚的生長性能，并改善其腸道功能和健康狀況。目前，由于脂肪酶多樣性、穩(wěn)定性和對酸的耐受性較差，并且外源性脂肪酶分解生成的游離脂肪酸易被氧化，會對水產(chǎn)動物產(chǎn)生副作用，在水產(chǎn)飼料中的理論和應(yīng)用研究中難度較高，所以還需對脂肪酶在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用進(jìn)行深入探索和研究。

1.6 復(fù)合酶制劑

復(fù)合酶制劑能將飼料中多種抗?fàn)I養(yǎng)因子及多種養(yǎng)分同時降解，從而提高飼料的營養(yǎng)價值，其作用效果優(yōu)于單一酶制劑[44]。按飼用酶制劑的功能特點(diǎn)可以將其分為4類：以蛋白酶和淀粉酶為主的復(fù)合酶，可以補(bǔ)充動物內(nèi)源酶的不足；以β-葡聚糖酶為主的復(fù)合酶，主要用于谷物日糧飼料；以纖維素酶、果膠酶為主的復(fù)合酶，可以將植物性飼料中多種抗?fàn)I養(yǎng)因子消除；以纖維素酶、糖化酶、果膠酶、蛋白質(zhì)酶、淀粉酶和葡聚糖酶為主的復(fù)合酶；復(fù)合酶制劑可以更好地促進(jìn)動物對蛋白質(zhì)、淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[45-46]。Huang等[47]研究表明，日糧中添加復(fù)合酶制劑(中性蛋白酶、酸性蛋白酶、木聚糖酶、纖維素酶、葡聚糖酶和甘露酶)可以提高花鱸的生長性能、消化酶活性和非特異性免疫功能。楊航等[48]研究表明，在低磷低脂飼料和無魚粉低磷低脂飼料中添加復(fù)合酶制劑(植酸酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果膠酶和淀粉酶)可以提高草魚的生長性能和對營養(yǎng)物質(zhì)的利用率。竇勇等[49]研究表明，在黃顙魚膨化飼料中添加復(fù)合酶制劑(蛋白酶、木聚糖酶、β-甘露聚糖酶和纖維素酶)，可以提高黃顙魚生長性能和粗蛋白質(zhì)利用率，減少環(huán)境中氮排放量，從而減少環(huán)境污染。

2 飼用酶制劑的作用機(jī)理

2.1 補(bǔ)充動物內(nèi)源酶的不足

作為飼料行業(yè)的一種綠色添加劑，酶制劑可以促進(jìn)動物消化過程、調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝平衡和提高養(yǎng)分降解率，在預(yù)防動物疾病、保護(hù)生態(tài)環(huán)境和促進(jìn)動物健康等方面也起著重要的作用[50]。正常的成年動物在適宜條件下，可以充分分泌降解飼料中某些營養(yǎng)物質(zhì)的酶，但當(dāng)動物處于幼年或者處于高溫、寒冷和疾病等應(yīng)激狀態(tài)時，就會出現(xiàn)對酶的分泌能力下降和消化紊亂的狀況[51]。因此，在動物飼料中添加外源酶制劑，可以補(bǔ)充動物內(nèi)源消化酶的不足，從而促進(jìn)動物對飼料中蛋白質(zhì)、淀粉及脂類等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，提高飼料利用率[52-53]。

2.2 直接分解營養(yǎng)物質(zhì)，供給機(jī)體營養(yǎng)

水產(chǎn)動物飼料中大多為植物性原料，其中的植物細(xì)胞壁和底物營養(yǎng)物質(zhì)中的大分子生物多聚體嚴(yán)重影響了動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。酶作為一種生物催化劑，在常溫常壓下高效地催化專一的底物是其主要特點(diǎn)。通過在飼料中添加外源消化酶，動物便可以將大分子生物多聚體消化成可以直接吸收的營養(yǎng)物質(zhì)，或者分解為小片段營養(yǎng)物質(zhì)供動物體吸收利用[54]。

2.3 消除抗?fàn)I養(yǎng)因子，促進(jìn)消化吸收

植物性飼料原料中常常含有一些非淀粉多糖(NSP)、果膠和纖維素等聚合物，尤其是具有較強(qiáng)的抗?fàn)I養(yǎng)作用的水溶性非淀粉多糖(SNSP)，溶于水后產(chǎn)生較強(qiáng)的粘性和持水性，能夠提高動物機(jī)體消化道食糜黏度、降低飼料養(yǎng)分的消化利用率[55-57]。在飼料中添加纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶和果膠酶等酶制劑，可以降解飼料中SNSP的多聚體，將其分解為小分子物質(zhì)，使NSP的抗?fàn)I養(yǎng)性和食糜黏度降低，提高飼料利用率及其動物對飼料營養(yǎng)的消化和吸收，改善動物消化機(jī)能，進(jìn)而提高其生長性能[58-59]。如纖維素酶由葡聚糖外切酶、葡聚糖內(nèi)切酶和β-葡聚糖苷酶組成，這3種酶結(jié)合在一起后相互作用，可以將植物性原料中的植物纖維分解成葡萄糖，將植物細(xì)胞壁破壞后釋放出其中的內(nèi)容物，從而提高飼料利用率[60]。

2.4 提高機(jī)體免疫力

植物性飼料原料中NSP的存在，提高了動物機(jī)體消化道食糜黏度，為病原微生物的定植和繁殖提供了有利條件，從而影響腸道健康，容易引起動物的消化道疾病[61-62]。飼料中添加的非淀粉多糖酶可以降解飼料中的NSP, 在NSP被降解的過程中還會產(chǎn)生低聚木糖等寡聚糖。有研究表明，低聚木糖一方面可以減少大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙氏門菌(Salmonella)、鏈球菌(Streptococcus)等有害菌定植在動物腸道內(nèi)，從而減輕病原菌對動物機(jī)體的危害；另一方面還能促進(jìn)動物腸道內(nèi)有益菌的增殖，保持良好的腸道內(nèi)環(huán)境[63-64]；此外，低聚木糖可以通過在細(xì)菌和病毒的表面結(jié)合來減緩抗原吸收，增加抗原效價，從而增強(qiáng)動物機(jī)體免疫力[65]。因此，在飼料中添加非淀粉多糖酶，可以改善動物腸道健康，提高機(jī)體免疫力，進(jìn)而提高動物的生長性能。

3 限制飼用酶制劑在水產(chǎn)動物中應(yīng)用的主要因素

3.1 缺乏精準(zhǔn)能量需求和原料消化率數(shù)據(jù)，影響酶制劑作用效果

有研究表明，動物飼糧的能量水平會直接影響酶制劑的作用效果，并且與能量較高的飼料相比，在能量較低的飼糧中添加酶制劑的作用效果更好[66]。張依量[67]的研究表明，在能量水平為11.1 MJ/kg玉米-豆粕型日糧中添加復(fù)合酶1(木聚糖酶11.0×106U/kg、甘露聚糖酶5.0×105U/kg、β-葡聚糖酶12.0×105U/kg、纖維素酶5.0×105U/kg和果膠酶9.0×105U/kg)可以顯著提高蛋雞粗蛋白、鈣表觀消化率；添加復(fù)合酶2(木聚糖酶22.0×106U/kg、甘露聚糖酶6.0×105U/kg、β-葡聚糖酶2.2×106U/kg、纖維素酶1.0×106U/kg和果膠酶1.0×106U/kg)可以顯著提高蛋雞鈣、磷表觀消化率；添加復(fù)合酶3(木聚糖酶11.0×106U/kg、甘露聚糖酶1.0×106U/kg、β-葡聚糖酶1.5×106U/kg、纖維素酶8.0×105U/kg、果膠酶1.0×106U/kg)可以顯著提高蛋雞能量、粗蛋白表觀消化率。但目前在水產(chǎn)動物的大部分養(yǎng)殖品種中，都缺乏此類精準(zhǔn)的能量需求和原料消化率數(shù)據(jù)，制約底物與外源酶的準(zhǔn)確匹配，從而影響酶制劑的作用效果。

3.2 缺乏在水生變溫動物適溫下的酶活性，影響酶功能發(fā)揮

絕大多數(shù)酶是一種對pH和溫度較為敏感的蛋白質(zhì)，飼用酶制劑在水產(chǎn)動物體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用，與工業(yè)酶制劑相比，其作用環(huán)境較復(fù)雜[68]。飼用酶制劑在其耐受溫度范圍內(nèi)，溫度升高，其作用效果會增強(qiáng)，但隨著溫度的降低作用效果會下降[69]。水產(chǎn)動物是一種體溫會隨著水溫變化而變化的變溫動物，15～32 ℃為其適宜的生長溫度，從動物消化的生理特點(diǎn)來看，在水產(chǎn)動物體溫較低時，飼用酶制劑便達(dá)不到其最適溫度，影響酶制劑在動物體內(nèi)的作用效果，從而影響酶功能的正常發(fā)揮。

3.3 缺乏針對魚類復(fù)雜多變的消化道環(huán)境的酶制劑研發(fā)

魚類的消化道環(huán)境比其他門類動物復(fù)雜的多，根據(jù)魚類消化道的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)特征可以將其分為4類：Y狀胃的肉食性魚類、袋狀胃的雜食偏肉食性魚類、無胃的雜食偏草食性魚類和管狀胃的濾食浮游生物魚類[70]。有研究表明，飼料中添加酸性植酸酶對南亞野鯪(Labeorohita)的生長性能無顯著影響[71]，但在異育銀鯽飼料中添加中性植酸酶卻可以顯著提高其生長性能和對營養(yǎng)物質(zhì)的消化率[72]。目前大部分植酸酶添加劑為酸性植酸酶，仍然缺乏針對魚類復(fù)雜多變消化道環(huán)境的酶制劑的研究，限制了無胃魚對植酸酶的應(yīng)用，在此方面還需進(jìn)行對酶制劑的深入研究。

4 展望

隨著水產(chǎn)飼料行業(yè)“無抗”時代的到來，酶制劑作為一種安全、高效、無污染的環(huán)保型綠色飼料添加劑，在水產(chǎn)飼料上的應(yīng)用將會越來越普遍。中國飼料資源缺乏，飼料原料來源復(fù)雜，除玉米、豆粕之外，還有多種雜粕，包括棉粕、菜粕，乃至高粱、大麥等非常規(guī)原料，由于這些植物性飼料原料中含有一些抗?fàn)I養(yǎng)因子，使得酶制劑在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用率得到提高。在飼料中添加外源酶制劑可以使飼料的消化利用率提高，促進(jìn)動物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，可以將這些含有抗?fàn)I養(yǎng)因子的飼料原料充分利用，提高飼料利用率，促進(jìn)非常規(guī)飼料原料的高效利用，從而在一定程度上緩解中國飼料資源的不足，還可以促進(jìn)綠色養(yǎng)殖環(huán)境的發(fā)展。目前，淀粉酶、脂肪酶等單一酶制劑在水產(chǎn)動物上的應(yīng)用還很少，隨著符合水產(chǎn)動物生理特點(diǎn)的酶制劑得到更多研究和開發(fā)，在酶活性和生產(chǎn)工藝及穩(wěn)定化技術(shù)上的提高，酶制劑在水產(chǎn)動物上的應(yīng)用也將會取得進(jìn)一步的成效。