周海銀 隆彩霞 羅 蘭 陳艷瑛 劉萍萍 肖政輝 張樹(shù)菊

1.湖南省兒童醫(yī)院急救中心，湖南長(zhǎng)沙 410007；2.湖南省兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南長(zhǎng)沙 410007

膿毒癥是一種由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致感染性休克，多器官功能障礙綜合征，是臨床危重患者最主要死亡原因之一[1-4]；甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）是甘草的活性成分之一，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和抑制多種癌細(xì)胞增殖的作用[5-9]。然而，GA 對(duì)膿毒癥致腎損傷的影響及其相關(guān)的分子機(jī)制尚未報(bào)道。因此本研究采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細(xì)胞（HBZY-1）和膿毒癥大鼠，觀察外源性GA 對(duì)膿毒癥大鼠腎損傷的改善作用，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

GA（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：50531）；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：PT520、AF7437、AF0195、PV951）；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved Caspase-3，Cl-Caspase-3）、抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax、血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）及p-ERK、ERK 多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz 公司，批號(hào)：SC-7271、SC-376861、SC-8418、SC-65496、SC-166943、SC-7480、SC-136960、SC-7383）；Hoechst33342（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：B2261）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年健康雄性SD 大鼠30 只，體重（200±20）g，購(gòu)于南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK（湘）2018-0002。將大鼠置于籠中適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后用于實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合南華大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)3R 標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 動(dòng)物分組與模型建立

SD 大鼠分為假手術(shù)組、GA 50 mg/kg 組、膿毒癥組、膿毒癥+GA 25 mg/kg 組、膿毒癥+GA 50 mg/kg 組，每組6 只。膿毒癥組大鼠腹腔注射LPS（5 mg/kg）[7]；GA 50 mg/kg 組大鼠腹腔注射GA 50 mg/kg；膿毒癥+GA 25 mg/kg 和膿毒癥+GA 50 mg/kg 組大鼠在LPS注射前1 h 腹腔注射GA 25 mg/kg 和50 mg/kg，假手術(shù)組和膿毒癥組腹腔注射10%等容二甲基亞砜。注射LPS 后24 h，處死動(dòng)物，采集腎組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

HBZY-1 細(xì)胞購(gòu)于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，DMEM 中添加10%胎牛血清、100 μg/ml 鏈霉素和100 U/ml 青霉素。

將HBZY-1 細(xì)胞分為5 組，分別為對(duì)照組、100μmol/L GA 組（用含100 μmol/L GA 的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h）、LPS 組（用含10 μg/ml LPS 的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 構(gòu)建腎炎模型）、LPS+GA 50 μmol/L 組和LPS+GA 100 μmol/L組[將HBZY-1 細(xì)胞用含10 μg/ml LPS 的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，分別用GA（50 μmol/L 和100 μmol/L）處理細(xì)胞1 h]。

1.5 HE 染色觀察各組大鼠腎組織病理學(xué)變化

腎組織用預(yù)冷生理鹽水沖洗，10%多聚甲醛固定，石蠟包埋5 μm 切片，所有切片行HE 染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察拍攝。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試法測(cè)定腎組織中炎癥相關(guān)因子水平

依據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)腎組織中TNF-α、MCP-1、ICAM-1 和VCAM-1 的含量。

1.7 Western blot 檢測(cè)凋亡、炎癥及氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)

采用RIPA 裂解緩沖液裂解，提取總蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度，采用SDS-PAGE 電泳分離樣品，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，加入一抗4℃下孵育過(guò)夜，洗滌，然后二抗室溫孵育2 h，ECL 顯色，曝光、洗片，采用Bio-Rad 成像系統(tǒng)照相。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎組織病理學(xué)改變情況

膿毒癥大鼠腎間質(zhì)、腎小球和腎小管有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分腎小管細(xì)胞腫脹和空泡變性等改變，GA 治療后膿毒癥大鼠腎組織上述病理改變明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理學(xué)改變情況（HE 染色，200×）

2.2 各組大鼠腎組織中TNF-α、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1 含量比較

膿毒癥組大鼠腎組織TNF-α、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1 水平高于假手術(shù)組（P ＜0.01）。膿毒癥+GA 25 mg/kg 組和膿毒癥+GA 50 mg/kg 組大鼠腎組織TNF-α、ICAM-1、VCAM-1 表達(dá)水平低于膿毒癥組（P ＜0.05）；膿毒癥+GA 50 mg/kg 組大鼠腎組織MCP-1 水平低于膿毒癥組（P ＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠腎組織中TNF-α、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1 含量比較（n=6）

2.3 GA 對(duì)HBZY-1 細(xì)胞中炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)影響

LPS 組HBZY-1 細(xì)胞iNOS、COX-2、NF-κB 蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組（P ＜0.01）。LPS+GA 50 μmol/L組和LPS+GA 100 μmol/L 組HBZY-1 細(xì)胞COX-2、NF-κB 蛋白表達(dá)水平低于LPS 組（P ＜0.05 或P ＜0.01）；LPS+GA 100 μmol/L 組iNOS 水平表達(dá)低于LPS 組（P ＜0.01）。見(jiàn)圖3～4。

圖3 各組HBZY-1 細(xì)胞中COX-2、iNOS、NF-κB 蛋白表達(dá)Western blot 圖

圖4 各組HBZY-1 細(xì)胞中iNOS、COX-2 和NF-κB 蛋白表達(dá)水平比較（n=6）

2.4 GA 對(duì)HBZY-1 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白影響

LPS 組HBZY-1 細(xì)胞Bcl-2/Bax 相對(duì)表達(dá)低于對(duì)照組，Cl-Caspase-3 高于對(duì)照組（P ＜0.01）。LPS+GA 100 μmol/L 組HBZY-1 細(xì)胞Bcl-2/Bax 相對(duì)表達(dá)高于LPS 組（P ＜0.01）；LPS+GA 50 μmol/L 組和LPS+GA 100 μmol/L 組HBZY-1 細(xì)胞Cl-Caspase-3 蛋白表達(dá)低于LPS 組（P ＜0.01）。見(jiàn)圖5～6。

圖5 各組HBZY-1 細(xì)胞Bcl-2、Bax、Cl-Caspase-3蛋白表達(dá)Western blot 圖

圖6 各組HBZY-1 細(xì)胞Bcl-2/Bax、Cl-Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較（n=6）

2.5 GA 對(duì)HBZY-1 細(xì)胞中氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)影響

LPS 組HO-1 蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組（P ＜0.05）。LPS+GA 50 μmol/L 組和LPS+GA 100 μmol/L組HO-1 蛋白表達(dá)水平高于LPS 組（P ＜0.01）；LPS+GA 100 μmol/L 組p-ERK 蛋白表達(dá)水平高于LPS 組（P ＜0.01）。見(jiàn)圖7～8。

圖7 各組HBZY-1 細(xì)胞中HO-1、p-ERK、ERK 蛋白表達(dá)Western blot 圖

圖8 各組HBZY-1 細(xì)胞中HO-1、p-ERK 蛋白表達(dá)比較（n=6）

3 討論

GA 對(duì)膿毒癥引起的急性肺損傷和急性腎損傷具有保護(hù)作用[10-12]。HE 染色觀察，膿毒癥+GA 組大鼠腎組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，說(shuō)明GA 對(duì)膿毒癥所致腎損傷具有治療作用。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)GA 治療后，膿毒癥大鼠腎組織中TNF-α、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1 表達(dá)下降，說(shuō)明GA 可能通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路，從而下調(diào)炎癥及趨化因子表達(dá)，起到減輕腎組織中炎癥反應(yīng)的作用。

NF-κB 可調(diào)節(jié)許多參與早期免疫及炎癥反應(yīng)的分子，包括TNF-α、白細(xì)胞介素-2、iNOS、COX-2 等，是目前公認(rèn)的介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要信號(hào)通路[13-17]。在膿毒癥中LPS 促進(jìn)iNOS 在各種細(xì)胞中的表達(dá)，導(dǎo)致大量一氧化氮（nitric oxide，NO）釋放，最終引起炎癥反應(yīng)和組織損傷[18]。COX-2 屬于NO 下游靶點(diǎn)，在正常組織中幾乎沒(méi)有表達(dá)，但在NO 刺激下細(xì)胞中大量表達(dá)[19-20]。經(jīng)GA 治療后，HBZY-1 細(xì)胞中NF-κB、iNOS、COX-2 蛋白表達(dá)水平降低，提示GA 可抑制LPS刺激 的HBZY-1 細(xì) 胞NF-κB 信 號(hào) 通 路，iNOS 表 達(dá)下降，減少NO 釋放，進(jìn)而下調(diào)COX-2 表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。

Bcl-2 家族是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，其中促凋亡蛋白Bax 和抗凋亡蛋白Bcl-2 通過(guò)在線粒體外膜上形成不同的孔來(lái)調(diào)節(jié)膜通透性[21]。Bcl-2/Bax 比值可決定Caspase-3 的激活狀況和細(xì)胞凋亡的嚴(yán)重程度[22]。經(jīng)GA 治療后，HBZY-1 細(xì)胞中Cl-Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低，Bcl-2/Bax 比值升高，提示GA 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有較強(qiáng)的保護(hù)作用。

HO-1 是一種由刺激誘導(dǎo)的應(yīng)激蛋白，具有明顯的抗氧化活性[23]。ERK 是MAPK 家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員，MAPK 和HO-1 都能被刺激激活，HO-1 的表達(dá)受酪氨酸磷酸化的調(diào)控，因此MAPK 與HO-1 之間存在一定的關(guān)系[24]。經(jīng)GA 治療后，HBZY-1 細(xì)胞中HO-1、p-ERK 蛋白表達(dá)水平升高，提示GA 可通過(guò)進(jìn)一步激活ERK 信號(hào)通路，促進(jìn)HO-1 表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，與文獻(xiàn)[25]報(bào)道基本一致。

綜上所述，GA 可抑制NF-κB 信號(hào)通路，對(duì)LPS誘導(dǎo)的HBZY-1 細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)具有保護(hù)作用。