王 進(jìn) 陳夢(mèng)祎 龔 碩 胡晞江, #

抗繆勒管激素(Anti-Müllerian Hormone，AMH)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族中的一種二聚體糖蛋白，由睪丸未成熟支持細(xì)胞和卵巢竇前卵泡與小竇卵泡的顆粒細(xì)胞分泌[1]。作為與兩性發(fā)育密切相關(guān)的生殖激素，AMH具有輔助區(qū)分兩性畸形患兒的性別、輔助診斷兒童中樞性性早熟、協(xié)助早期診斷青春期延遲和性腺功能減退癥、評(píng)估腫瘤患兒化療后卵巢功能[2，3]等作用。但兒童血清AMH參考范圍的缺乏，阻礙了其在兒科的廣泛臨床應(yīng)用，而且不同種族人群，AMH水平存在一定差異[4]，因此，迫切需要建立適用于我國(guó)兒童的參考區(qū)間。本文擬采用橫斷面研究，建立湖北地區(qū)0-12歲兒童AMH參考區(qū)間，旨在為血清AMH在兒科領(lǐng)域廣泛應(yīng)用提供參考標(biāo)準(zhǔn)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2018-03-2021-01在武漢兒童醫(yī)院體檢和門診的健康兒童，依據(jù)CLSI C28-A3指南，所有被招募的兒童均接受標(biāo)準(zhǔn)的身體和醫(yī)學(xué)檢查。納入標(biāo)準(zhǔn)：0-12歲，身體健康，男女不限，血常規(guī)、肝、腎功能正常，血糖正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有特納氏綜合癥，可疑的性發(fā)育異常，多囊卵巢綜合癥，卵巢早衰，單側(cè)或雙側(cè)隱睪，內(nèi)分泌疾病，遺傳性代謝疾病，肝功能不全，腎臟功能不全，循環(huán)系統(tǒng)疾病，手術(shù)史，急性或慢性感染的患者，肥胖者[5]。共納入男童645例，女童633例，依據(jù)Tanner分期和AMH分泌特點(diǎn)[6]，將男女童按年齡段分別分為五組， 1天-364天組、365天-1歲11個(gè)月組、2-4歲組、5-8歲組、9-12歲組。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核同意。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及處理: 根據(jù)CLSI C56-A文件中的建議[7]，建立兒童血清學(xué)AMH參考區(qū)間。用不含抗凝劑的干燥真空管采集研究對(duì)象靜脈血1.5ml，靜置30min后，以3 500rpm離心15min分離血清。如果存在溶血，黃疸或血脂異常，則剔除樣品。將合格的血清樣品存儲(chǔ)于-80℃下。

1.2.2 血清AMH的檢測(cè): 依據(jù)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行，采用美國(guó)貝克曼Access 2型全自動(dòng)免疫分析儀和配套的試劑、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品，檢測(cè)血清AMH水平。

1.2.3 離群值的處理: 按照CLSI C28-A3文件要求，采用Dixon法(即D/R比值)判斷離群值(D值為某數(shù)據(jù)與鄰近數(shù)據(jù)的差值，R值為數(shù)據(jù)全距)。D/R≥1/3的數(shù)據(jù)判為離群值，舍去；D/R<1/3者保留。

1.2.5 不同年齡段AMH百分位數(shù): 采用LMS法構(gòu)建不同年齡段AMH百分位數(shù)，包括P2.5、P5、P10、P25、P50、P75、P90、P95、P97.5共9個(gè)百分位點(diǎn)。LMS法是用中位數(shù)曲線(M)、變異系數(shù)曲線(S)和不對(duì)稱曲線(L)全面描述研究AMH水平在各個(gè)年齡段的分布。采用LMS法擬合百分位數(shù)曲線時(shí)，需選擇適宜的Box-cox轉(zhuǎn)換值(L)、中位數(shù)(M)及變異系數(shù)(S)的自由度值及其他相關(guān)參數(shù)。

1.2.6 參考區(qū)間的驗(yàn)證: 按照CLSI C28-A3文件的要求，隨機(jī)選取1天-364天、365天-1歲11個(gè)月、2-4歲、5-8歲、9-12歲年齡段健康女孩各20例，及選取1天-364天、365天-1歲11個(gè)月、2-4歲、5-8歲、9-12歲年齡段健康男孩各20例，采用相同的儀器及試劑進(jìn)行血清AMH檢測(cè)，驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果是否在所建立的參考區(qū)間內(nèi)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各年齡組男女童血清AMH參考區(qū)間

因不同年齡段男童和女童血清 AMH 水平的頻數(shù)均呈非正態(tài)分布，采用雙側(cè)限值(P2.5，P97.5)，即95%的置信區(qū)間建立湖北地區(qū)健康男孩和女孩AMH的參考區(qū)間(見表1)，健康男童出生時(shí)，血清AMH水平較高，出生后略有增加，從2歲起持續(xù)下降至12歲。健康女童出生時(shí)，血清AMH濃度較低，出生后逐漸增加，在9歲時(shí)達(dá)到峰值，然后逐漸降低至12歲。

表1 各年齡段男、女童血清 AMH 參考區(qū)間(ng/ml)

2.2 各年齡組男女童血清AMH百分位數(shù)值

采用LMS法計(jì)算男童和女童不同年齡段血清AMH第2.5、5、10、25、50、75、90、95、97.5 百分位數(shù)見表2和表3。

表2 各年齡段男童血清 AMH百分位數(shù)值(ng/ml)

表3 各年齡段女童血清 AMH百分位數(shù)值(ng/ml)

2.3 參考區(qū)間驗(yàn)證

在隨機(jī)選擇的1天-364天、365天-1歲11個(gè)月、2-4歲、5-8歲、9-12歲各年齡段健康女童和男童中，女童每組各有19、20、20、19、19例受檢者血清AMH水平在所建的參考區(qū)間內(nèi)，男童每組各有20、19、19、19、20例受檢者血清AMH水平在所建的參考區(qū)間內(nèi)，符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理要求。

3 討 論

兒童性發(fā)育相關(guān)疾病，種類繁多，病因復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)室評(píng)估指標(biāo)少，導(dǎo)致診斷困難。AMH參與下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)控的兒童性發(fā)育過程，并在男胎繆勒管退化及性腺發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用[8]，AMH水平的異常變化可提示兒童性發(fā)育相關(guān)疾病的發(fā)生，作為兒科評(píng)估卵巢與睪丸發(fā)育及病理狀況的生物標(biāo)志物[9]，AMH將在兒科內(nèi)分泌疾病診治及療效評(píng)估中具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究發(fā)現(xiàn)，健康男童出生時(shí)，血清AMH水平較高，出生后略有增加，從2歲起持續(xù)下降至12歲，女童AMH分泌水平與男童顯著不同，女童出生時(shí)，血清AMH濃度較低，從出生開始持續(xù)增加，至9歲時(shí)達(dá)到峰值，從9歲到12歲，AMH的水平下降，提示健康兒童血清AMH水平在性腺發(fā)育不同時(shí)期有不同的表達(dá)，與Jopling等[10]報(bào)道結(jié)論一致。

全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光平臺(tái)為臨床開展AMH檢測(cè)提供技術(shù)支持。本研究采用全自動(dòng)Access AMH系統(tǒng)檢測(cè)AMH，批內(nèi)CV為1.58-2.60%，批間CV為2.07-3.27%。而Aksglaede[11]采用Gen Ⅱ ELISA方法報(bào)告的男性AMH的參考區(qū)間，批內(nèi)CV為6-8%，批間CV為10-12%，本研究所采用的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)的批內(nèi)和批間CV明顯低于Gen Ⅱ ELISA方法。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，血清AMH水平的測(cè)定方法不斷改進(jìn)，過去運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)檢測(cè)技術(shù)，存在AMH檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，重復(fù)性差，速度慢等問題[12]。全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光Access AMH檢測(cè)系統(tǒng)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)好，速度快等優(yōu)勢(shì)，將逐步取代ELISA方法，因此采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光法建立的血清AMH參考區(qū)間更具有應(yīng)用前景[13]。

AMH的深入研究及兒科廣泛臨床應(yīng)用依賴于AMH參考區(qū)間的建立。本研究建立的湖北地區(qū)0-12歲男童和女童AMH參考區(qū)間，比Yates等報(bào)道[6]的英國(guó)男童和女童的AMH參考范圍略高，進(jìn)步一步證實(shí)不同種族人群，AMH水平存在一定差異[4]，Yates等報(bào)道[6]的兒童參考區(qū)間，每個(gè)亞組人數(shù)約為40例左右，其例數(shù)未達(dá)到美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)CLSI C28-A3 文件的要求，該文件指出，使用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目參考區(qū)間時(shí)，亞組例數(shù)不少于120例，此參考范圍是否可靠有待進(jìn)一步驗(yàn)證。近年來(lái)，西方國(guó)家、北京協(xié)和醫(yī)院及湖北省人民醫(yī)院均建立了19-50歲成年女性AMH參考區(qū)間[14，15]，并已在卵巢早衰、多囊卵巢綜合征、卵巢顆粒細(xì)胞瘤、輔助生殖等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[16]。我國(guó)兒童AMH參考范圍的建立，有利于在兒科領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

綜上所述，本研究采用橫斷面研究，運(yùn)用Beckman Access2全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析法，建立了湖北地區(qū)兒童0-12歲AMH參考區(qū)間，為AMH深入研究提供理論基礎(chǔ)，也為AMH在兒科領(lǐng)域廣泛應(yīng)用提供參考。

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