李偉民 田小菲 田棟安 劉子巖 田亞汀 李美玉 張國徽

遲發(fā)型腦病(Delayed Neuropathological Sequelae, DNS)是CO中毒后常見的并發(fā)癥,臨床癥狀表現(xiàn)為患者認知功能發(fā)生障礙及精神疾病等，其發(fā)病機制尚不明確，目前認為，CO中毒后腦組織大范圍缺氧，并導致血流速度減慢，血液粘滯度增加，腦微循環(huán)發(fā)生障礙，導致腦白質(zhì)發(fā)生廣泛性脫髓鞘[1，2]。脫髓鞘，其特征是髓鞘的丟失和少突膠質(zhì)細胞的死亡[3]。少突膠質(zhì)細胞是合成髓鞘堿性蛋白(Myelin Basic Protein, MBP)的主要場所，在腦白質(zhì)內(nèi)呈彌散分布，本小組前期研究顯示，少突膠質(zhì)細胞對于CO的耐受性較其它膠質(zhì)細胞弱[4]，特別容易受到CO中毒的影響[5]。少突膠質(zhì)細胞死亡會導致MBP合成障礙，進而引起腦白質(zhì)部位脫髓鞘病變，使大腦出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。

雌激素是一種常見的類固醇激素，具有多種作用，包括抗氧化應(yīng)激、抑制細胞凋亡、調(diào)節(jié)線粒體功能等[6]。雌激素主要分為E1(Estrone)、E2(Estradiol)和E3(Estriol)，其中作用最強的雌激素為E2，又名17β-雌二醇，具有重要的神經(jīng)保護作用[7-10]。E2能使大腦損傷后的少突膠質(zhì)細胞快速成熟，對少突膠質(zhì)細胞促進髓鞘形成起保護作用[11]。E2還可減輕CO中毒后的脫髓鞘損傷，維持髓鞘結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定，在一定程度上阻斷了DNS的發(fā)生[12]。且雄性體內(nèi)的睪酮及其轉(zhuǎn)化成的雌激素并不影響外源性雌激素的神經(jīng)保護作用[13]。

B細胞淋巴瘤/白血病-2和腺病毒E1B19 000相互作用蛋白3(B Cell Lymphoma/leukemia-2 and Adenovirus E1B19 000 Interacting Protein 3, BNIP3)屬于 B細胞淋巴瘤/白血病-2(B Cell Lymphoma/leukemia-2, Bcl-2)家族成員之一，是一種線粒體促凋亡蛋白。正常情況下，組織細胞缺氧缺血時BNIP3的表達明顯增加[14]。實驗證實，CO中毒可引起腦白質(zhì)部位發(fā)生脫髓鞘并且激活BNIP3介導的Caspase依賴性線粒體凋亡途徑[3]。雌激素可通過抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cysteinyl Aspartate Specific Proteinase 3, Caspase-3)的活性，進而阻斷凋亡信號的級聯(lián)反應(yīng)，抑制細胞凋亡[15]。

CO中毒會引起腦白質(zhì)部位脫髓鞘病變，造成神經(jīng)系統(tǒng)受損。且目前基礎(chǔ)研究的有關(guān)結(jié)果均揭示了雌激素對神經(jīng)系統(tǒng)具有保護作用，但對其內(nèi)在機制尚不明確，同時在雌激素作用方式的選擇上也沒有較好的參照標準。因此，本研究小組建立CO中毒小鼠模型，分析雌激素的最佳作用方式，并進一步分析雌激素是否通過BNIP3介導的Caspase依賴性線粒體凋亡途徑對腦白質(zhì)脫髓鞘發(fā)揮保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性C57BL/6小鼠30只，由北京斯貝福生物科技股份有限公司提供(體重25±2g，批號：1103241911014839)，飼喂環(huán)境：溫度28℃，濕度50%。遵照國家實驗動物管理條例以及國家實驗動物管理與使用指南飼喂及處置。

1.2 主要試劑

SDS-PAGE凝膠制備試劑盒和彩虹180廣譜蛋白marker(PR1910)購自Solarbio；5×蛋白上樣緩沖液(ZS306)購自ZOMANBIO；RIPA裂解液(P0013B)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010)、辣根過氧化酶標記山羊抗小鼠IgG(A0216)和辣根過氧化酶標記山羊抗兔IgG(A0208)均購自上海碧云天公司；ECL化學發(fā)光試劑盒(BB-3510)購自BestBio；免疫組化染色試劑盒(SP-0023)購自Bioss；17β-Estradiol(E2758)購自Sigma；BNIP3抗體(ab109362)購自Abcam；MBP抗體(sc-66064)、Bcl-2抗體(sc-492)、Caspase-3抗體(sc-98785)和β-actin抗體(sc-47778)均購自Santa Cruz公司；其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 CO染毒小鼠模型制作[16]: 適應(yīng)環(huán)境一周后，將小鼠置于密閉的廣口瓶中，瓶內(nèi)加入鈉石灰(吸收小鼠呼出的二氧化碳和水分)，再給予(2 500-3 000)×10-6mg/L的CO氣體40min至小鼠昏迷，整個過程中確保CO濃度穩(wěn)定(每隔10min采集瓶內(nèi)氣體，測定CO濃度)，小鼠染毒后即刻采集眶血，測COHb濃度，達45-60%之間視為染毒成功，之后再將小鼠放回正常飼養(yǎng)環(huán)境。本實驗CO 染毒小鼠模型全部造模成功。

1.3.2 動物分組及處理: 將30只小鼠用隨機數(shù)字表法分為6組(n均=5)：正常對照組(Control組，密閉在瓶子里，沒有給予CO)、CO染毒組(CO組，按1.3.1中CO染毒模型進行處理)、雌激素預防組(E2+CO組，小鼠每日頸背部皮下注射雌激素，持續(xù)7天，之后再行CO染毒模型處理)、雌激素治療組(CO+E2組，CO染毒模型制備成功后小鼠每日頸背部皮下注射雌激素，持續(xù)7天)、雌激素預防加治療組(E2+CO+E2組，CO染毒前和染毒后小鼠每日頸背部皮下注射雌激素，各持續(xù)7天)。溶劑組(B+CO+B組，CO染毒前和染毒后小鼠每日頸背部皮下注射緩沖液，各持續(xù)7天)。本小組所采用的雌激素給予方法與劑量參考了Cheng等[17]實驗，先用無水乙醇將雌激素稀釋為50μg/ml的濃度，再用芝麻油稀釋至5μg/ml的終濃度。雌激素給藥量為30μg/kg/天。

1.3.3 取材: 治療7天后，所有小鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.05ml/10g體重)，仰臥固定，暴露心臟，灌注針插入左心室，開始灌注生理鹽水，同時剪開右心耳放血，待右心耳流出清亮液體后斷頭，迅速剝離出大腦組織，冰上操作，一半腦組織放入4%多聚甲醛固定液中4℃固定48h，另一半將剝離出的胼胝體部位提取總蛋白，并采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白濃度測定，備用。

1.3.4 免疫組織化學染色觀察髓鞘結(jié)構(gòu):取多聚甲醛固定液中的腦組織制作石蠟塊，蠟塊冠狀位切片暴露出胼胝體部位，70℃烤片2h，脫蠟至水；PBS洗5min×1次；枸櫞酸修復液進行抗原修復；PBS洗5min×1次；3%雙氧水孵育20min；封閉用正常山羊血清工作液孵育20min；滴加I抗稀釋液(MBP抗體1∶50稀釋)，4℃孵育過夜；37℃復溫1h；PBS洗3min×3次；滴加生物素標記山羊抗小鼠IgG二抗工作液，室溫孵育20min；PBS洗3min×3次；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育20min；PBS洗3min×3次；DAB顯色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察棕黃色染色為MBP蛋白陽性區(qū)域，即髓鞘結(jié)構(gòu)。

1.3.5 蛋白免疫印跡檢測蛋白含量：使用RIPA裂解液從小鼠腦胼胝體中提取總蛋白；根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后制樣；按照各自計算的上樣量上樣，SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；脫脂奶粉封閉2h；I抗按比例稀釋(MBP抗體1∶500稀釋、BNIP3抗體1∶600稀釋、Bcl-2抗體1∶500稀釋、Caspase-3抗體1∶500稀釋和β-actin抗體1∶1 000稀釋)，4℃條件下孵育過夜；洗滌后，用辣根過氧化酶標記的II抗(1∶1 000稀釋)室溫孵育2h；經(jīng)洗滌后，用ECL化學發(fā)光試劑盒顯影，利用圖像分析軟件Image J對條帶進行分析，用目的條帶灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值表示各目的蛋白的相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 小鼠腦胼胝體髓鞘結(jié)構(gòu)

如圖1所示，Control組髓鞘質(zhì)地緊密，結(jié)構(gòu)正常，CO組的髓鞘結(jié)構(gòu)明顯脫失，E2+CO組的髓鞘脫失現(xiàn)象較CO組有所改善，但仍與Control組有較大差別，CO+E2組和E2+CO+E2組的髓鞘脫失現(xiàn)象較CO組有明顯改善，接近于Control組，B+CO+B組的髓鞘脫失現(xiàn)象與CO組相接近。

2.2 小鼠腦胼胝體MBP蛋白表達

與Control組比較，CO組MBP表達明顯降低(t=32.511,P<0.05)，E2+CO組MBP表達較CO組有所回升(t=-12.895,P<0.05)，但仍低于Control組，CO+E2組和E2+CO+E2組MBP表達較CO組明顯回升(t分別為-53.085、-79.948,P<0.05)，均接近于Control組(t分別為2.523、2.470,P>0.05)。見表1和圖2。

2.3 各組小鼠腦胼胝體中BNIP3及其它凋亡蛋白表達水平比較

各組小鼠腦胼胝體中BNIP3水平差異有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。與Control組比較，CO組BNIP3表達明顯升高(t=-22.150,P<0.05)，E2+CO組BNIP3表達較CO組有所降低(t=8.953,P<0.05)，但仍高于Control組，CO+E2組和E2+CO+E2組BNIP3表達較CO組明顯降低(t分別為16.059、14.086,P<0.05)，接近于Control組(t分別為-2.335、-2.365,P>0.05)。見表1和圖2。

蛋白免疫印跡法進一步進行CO染毒后cleaved-Caspase-3和Bcl-2的表達檢測，結(jié)果顯示，與Control組比較，CO組cleaved-Caspase-3表達明顯升高(t=-30.008P<0.05)，E2+CO組cleaved-Caspase-3表達較CO組有所降低(t=12.766,P<0.05)，但仍高于Control組， CO+E2組和E2+CO+E2組cleaved-Caspase-3表達較CO組明顯降低(t分別為25.405、26.025,P<0.05)，接近于Control組(t分別為-1.477、-1.247,P>0.05)。同時，與Control組比較，CO組Bcl-2表達明顯降低(t=21.031,P<0.05)，E2+CO組Bcl-2表達較CO組有所升高(t=-5.437,P<0.05)，但仍低于Control組， CO+E2組和E2+CO+E2組Bcl-2表達較CO組明顯升高(t分別為-14.150、-13.197,P<0.05)，接近于Control組(t分別為1.296、1.179,P>0.05)。見表1和圖2。

表1 蛋白免疫印記檢測各組小鼠腦胼胝體相關(guān)蛋白的表達情況

3 討 論

DNS是CO中毒常見的并發(fā)癥，其最主要的病理改變是腦白質(zhì)部位發(fā)生脫髓鞘。MBP是重要的髓鞘蛋白質(zhì)之一， 約占髓鞘總蛋白的40%， 其能夠保證髓鞘結(jié)構(gòu)的完整性和功能的穩(wěn)定性，檢測MBP表達的改變是反映髓鞘脫失及再生程度的一種重要手段[18]，本研究小組前期研究結(jié)果顯示，CO中毒會引起腦白質(zhì)部位脫髓鞘病變，并伴隨MBP的表達降低。本研究主要分析雌激素對于CO中毒引起的腦白質(zhì)脫髓鞘病變的保護作用。

注：A，各組小鼠腦胼胝體中各蛋白免疫印跡電泳；B-E，各組小鼠腦胼胝體中BNIP3、MBP、cleaved-Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平直方圖；與Control組比較，*P<0.05；與 CO組比較，#P<0.05圖2 各組小鼠腦胼胝體中各蛋白表達

本研究通過免疫組織化學和蛋白免疫印跡的方法對不同分組處理的C57BL/6小鼠腦白質(zhì)進行MBP表達檢測，發(fā)現(xiàn)CO中毒小鼠腦組織中MBP的表達降低，雌激素對于CO中毒引起的小鼠腦組織中MBP的表達降低有保護作用。本文結(jié)果還顯示，CO+E2組和E2+CO+E2組的保護作用相似，均比E2+CO組的保護效果更好。故治療組和預防+治療組的效果優(yōu)于預防組，由于預防+治療組需要給藥次數(shù)更多，每次給藥注射對實驗動物也會造成一定傷害，且效果又與單純治療組幾乎相同，故本研究在分析雌激素對于CO中毒引起的脫髓鞘病變保護作用時，發(fā)現(xiàn)單純給予雌激素治療效果等同于既預防又治療的效果，并且此給藥方式更加符合對臨床患者的治療情況。

雌激素的保護機制復雜，本研究小組前期發(fā)現(xiàn)CO中毒會引起少突膠質(zhì)細胞發(fā)生凋亡[4]。為了進一步分析雌激素是否通過抑制CO中毒引起的細胞凋亡發(fā)揮保護作用，對細胞凋亡相關(guān)蛋白BNIP3進行了檢測。BNIP3屬于Bcl-2家族成員之一，是一種線粒體促凋亡蛋白，正常情況下，BNIP3的表達量非常低，當組織細胞發(fā)生缺氧缺血時可以使BNIP3的表達明顯增強。蛋白印跡實驗結(jié)果顯示，BNIP3在CO中毒后呈現(xiàn)出明顯升高的趨勢，在給予雌激素治療后，BNIP3的表達降低，提示雌激素能夠抑制CO中毒引起的BNIP3的表達變化。

Caspase-3是BNIP3凋亡通路中的蛋白之一，BNIP3又屬于Bcl-2家族成員，本實驗結(jié)果顯示，CO中毒引起了Caspase-3的活化，同時Bcl-2表達降低，當給予雌激素作用后，Caspase-3的活化受到抑制，Bcl-2的表達趨勢變化也受到抑制。這些結(jié)果均提示，CO中毒后，可使腦白質(zhì)部位發(fā)生脫髓鞘并且激活了BNIP3介導的Caspase依賴性線粒體凋亡途徑。據(jù)此推測，雌激素是通過抑制凋亡蛋白BNIP3的表達，調(diào)控Bcl-2和Caspase-3介導的凋亡通路，抑制細胞凋亡，進而起到了保護髓鞘的作用。

綜上所述，雌激素通過抑制BNIP3介導的Caspase依賴性線粒體凋亡途徑對CO中毒所導致的腦白質(zhì)脫髓鞘病變起到了保護作用，并且本研究發(fā)現(xiàn)，雌激素的給予方式中，單純給予治療措施的給予方式不僅減少了對實驗動物的損傷，同時減少了實驗過程中的操作，而且其治療效果不低于既給予雌激素預防又給予雌激素治療實驗組，因此本研究得出單純給予雌激素治療為其最佳作用方式，為CO中毒患者的治療及研究提供了新思路。

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