楊千元 滕爽爽 蔡逸龍 肖國強(qiáng)① 蔡西栗

哈維氏弧菌浸泡感染下泥蚶()不同組織弧菌載量的變化規(guī)律分析*

楊千元1, 2滕爽爽2蔡逸龍2肖國強(qiáng)1, 2①蔡西栗3

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 上海 201306; 2. 浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所 浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 溫州市海洋生物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 溫州 325005; 3. 浙江省平陽縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 平陽 325499)

為明確哈維氏弧菌感染下, 泥蚶()不同組織弧菌載量的變化規(guī)律, 通過哈維氏弧菌浸泡感染泥蚶的方法, 建立弧菌濃度計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線, 記錄攻毒水體和泥蚶組織中的哈維氏弧菌含量的動(dòng)態(tài)變化及相關(guān)關(guān)系。結(jié)果顯示, 弧菌感染濃度為1×107CFU/mL, 泥蚶血液中弧菌載量顯著高于鰓、閉殼肌、外套膜和肝胰腺, 各組織中的弧菌載量呈現(xiàn)先上升, 后下降, 最后維持較低水平的變化規(guī)律。持續(xù)感染6 d, 泥蚶血液中弧菌載量降至102—104CFU/mL, 其他組織中弧菌載量降至100—102CFU/mg。檢測(cè)不同濃度弧菌(1×105, 1×106, 1×107, 5×107CFU/mL)浸泡感染后泥蚶肝胰腺的弧菌載量變化, 結(jié)果顯示, 1 d時(shí)各感染組肝胰腺弧菌載量均較對(duì)照組顯著增加(81.0—667.8倍), 且與浸泡水體中弧菌濃度呈顯著正相關(guān)(Spearman’s=0.762,<0.001), 5 d時(shí)各侵染組肝胰腺弧菌載量均較1 d明顯降低, 但仍然高于對(duì)照組。研究結(jié)果為泥蚶感染弧菌發(fā)病過程中, 免疫識(shí)別及免疫響應(yīng)機(jī)制的研究提供了參考。

泥蚶(); 哈維氏弧菌(); 弧菌載量; 免疫抗性

泥蚶(), 俗稱“血蛤”, 隸屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibranchia)、列齒目(Taxodonta)、蚶科(Arcidae)、泥蚶屬(), 是一種典型的廣溫、廣鹽性灘涂貝類, 廣泛分布于印度洋和西太平洋地區(qū), 在我國主要分布于山東半島以南沿海地區(qū), 是我國四大經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類之一, 并在沿海生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的生態(tài)作用(李太武等, 2003; Shao, 2016; Shi, 2016)。近年來養(yǎng)殖泥蚶的流行性疾病和大規(guī)模死亡時(shí)有發(fā)生(金珊等, 2002), 其中, 弧菌性疾病最為常見, 并且導(dǎo)致的死亡最為嚴(yán)重, 已然成為制約泥蚶養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸問題之一(陳愛平, 2005; 陳愛平等, 2007)?；【毡榉植加诤涌?、海灣、近岸海域的海水和海洋動(dòng)物體內(nèi), 截至目前弧菌科共發(fā)現(xiàn)8個(gè)屬, 159個(gè)種, 其中主要致病菌有副溶血弧菌()、哈維氏弧菌()、鰻弧菌()、創(chuàng)傷弧菌()、溶藻弧菌()等(張曉華等, 2018)。目前關(guān)于泥蚶致病弧菌的研究主要集中在副溶血弧菌(劉文偉等, 2010; 汪青, 2012; Bao, 2013a, b; Yang, 2020b)、鰻弧菌(鐘愛華等, 2020)、溶藻弧菌(Yang, 2020a)和哈維氏弧菌(Song, 2017; Zha, 2017)等。其中, 有關(guān)泥蚶感染哈維氏弧菌后, 機(jī)體免疫響應(yīng)的研究報(bào)道較少。

細(xì)菌性疾病的暴發(fā)主要取決于宿主的體質(zhì)、病原菌的數(shù)量和宿主與病原菌之間的相互作用(Asplund, 2014)。當(dāng)外來病原微生物入侵宿主機(jī)體時(shí), 宿主的免疫系統(tǒng)被激活, 主要通過識(shí)別和消除的方式, 來保護(hù)自身避免受到病原體侵害。為了避免病原微生物侵害, 維持機(jī)體各項(xiàng)功能正常運(yùn)行, 宿主必須控制病原菌在體內(nèi)的荷載(Howick, 2017)。宿主的免疫系統(tǒng)通過消化、降解、吞噬等方式來控制靶組織中病原體的增殖, 以此來降低體內(nèi)病原菌的數(shù)量, 這種宿主抵御病原微生物的能力被稱為免疫抗性(Boots, 1999; Roy, 2000)。因此, 免疫抗性常以感染后宿主體內(nèi)靶組織中病原體數(shù)量來衡量(Murphy, 1987)。宿主體內(nèi)菌載量的變化規(guī)律反映了外來病原菌入侵后, 宿主與病原菌之間的相互作用, 是一種重要的衡量免疫抗性的指標(biāo)。

本研究采用浸泡感染實(shí)驗(yàn)?zāi)M泥蚶在自然環(huán)境下遭受哈維氏弧菌脅迫的環(huán)境。通過繪制哈維氏弧菌的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線, 檢測(cè)攻毒水體中24 h內(nèi)哈維氏弧菌的濃度變化, 分析感染后不同時(shí)間點(diǎn)泥蚶組織弧菌載量的變化趨勢(shì), 進(jìn)而研究在不同濃度弧菌感染下, 攻毒水體的弧菌濃度與泥蚶肝胰腺的弧菌載量的變化及相關(guān)性, 以期為泥蚶感染弧菌發(fā)病過程中, 免疫識(shí)別及免疫響應(yīng)機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的泥蚶[殼長(28.67±1.97) mm, 總重(9.08±1.61) g]取自浙江省溫州市樂清灣(121°E, 28°N), 小心沖洗除去殼表污物后, 用濃度為5 mg/L的高錳酸鉀溶液浸泡5—10 min, 將泥蚶置于室內(nèi)500 L大桶中暫養(yǎng)一周[砂濾海水的pH 8.3±0.1, 鹽度22.5±0.1, 溫度(28.0±2.0) °C]。暫養(yǎng)期間, 桶內(nèi)海水保持連續(xù)充氣, 每24 h換水一次, 每日早晚定時(shí)各投喂硅藻(密度為5×104個(gè)/mL) 1次。

實(shí)驗(yàn)所用的哈維氏弧菌菌株是本實(shí)驗(yàn)室2014年從浙江灘涂發(fā)生規(guī)模性死亡的泥蚶中分離、鑒定并于–80 °C冰箱中長期保存。將菌株劃線于2216E固體培養(yǎng)基上, 28 °C培養(yǎng)24 h后挑取單菌落于5 mL的2216E液體培養(yǎng)基試管中, 28 °C搖床中培養(yǎng)12 h, 搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min, 然后將其接種于大體積的2216E液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 弧菌計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將哈維氏弧菌接種至50 mL 2216E液體培養(yǎng)基中, 在28 °C搖床中培養(yǎng)12 h。用無菌PBS溶液稀釋成不同濃度的菌懸液。具體操作為: 以無菌PBS溶液二次重懸弧菌培養(yǎng)液, 分別吸取10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、200 μL、0.5 mL、1 mL、2 mL加PBS至終體積10 mL, 稀釋成8個(gè)不同濃度的菌懸液。以分光光度計(jì)測(cè)定的8個(gè)菌液的OD560值為橫坐標(biāo), 用硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖(TCBS)瓊脂培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)法得到的相應(yīng)的弧菌濃度為縱坐標(biāo), 建立弧菌數(shù)與OD560值關(guān)系曲線, 獲得直線回歸方程(沈錦玉等, 2009)。

1.2.2 哈維氏弧菌感染實(shí)驗(yàn)

(1) 哈維氏弧菌感染水體中, 哈維氏弧菌含量的日變化。將已知濃度的哈維氏弧菌, 按照設(shè)定濃度1×107CFU/mL添加至砂濾海水中。20 L海水中放入30顆泥蚶, 感染期間海水溫度保持(28.5±0.5) °C, 持續(xù)充氣, 每天早晚定時(shí)投喂硅藻一次。分別在弧菌添加前和添加后0、3、6、12、18、24 h對(duì)實(shí)驗(yàn)水體進(jìn)行取樣, 每次在不同位置、不同深度隨機(jī)取3個(gè)水樣檢測(cè)水體中的哈維氏弧菌數(shù)量。24 h后更換實(shí)驗(yàn)海水并重新添加弧菌, 所有設(shè)置和取樣時(shí)間同第一次實(shí)驗(yàn), 連續(xù)三天檢測(cè)水體中哈維氏弧菌的數(shù)量變化, 取平均值。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)感染組, 同時(shí)設(shè)置對(duì)照組, 即不放置泥蚶, 其他操作同感染組。采用SPSS22.0單因子方差分析(Analysis of variance, ANOVA), 檢驗(yàn)不同處理組間海水中哈維氏弧菌濃度日變化, 顯著性水平設(shè)定為<0.05。

(2) 哈維氏弧菌感染過程中, 泥蚶組織弧菌載量變化。設(shè)置感染濃度為1×107CFU/mL, 對(duì)400只泥蚶進(jìn)行連續(xù)7 d的哈維氏弧菌浸泡感染, 期間海水溫度保持(28.5±0.5) °C, 持續(xù)充氣, 每24 h更換海水和弧菌。分別在感染實(shí)驗(yàn)前和感染實(shí)驗(yàn)后1、3、6 d, 每次取50顆泥蚶, 解剖取鰓、外套膜、閉殼肌、肝胰腺、血液用于弧菌載量檢測(cè)。攻毒前后同一時(shí)間點(diǎn)泥蚶不同組織、同一組織不同個(gè)體間弧菌載量差異顯著性檢驗(yàn)采用One-way ANOVA方法, 顯著性水平設(shè)定為<0.05。

(3) 泥蚶體內(nèi)弧菌載量與弧菌感染強(qiáng)度的相關(guān)性分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)置1×105、1×106、1×107、5×107CFU/mL四個(gè)不同強(qiáng)度的哈維氏弧菌刺激, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置6個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)50顆泥蚶, 以不添加哈維氏弧菌的砂濾海水為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行15 d, 浸泡感染7 d, 后8 d停止添加弧菌, 實(shí)驗(yàn)期間保持海水溫度(28.5±0.5) °C, 每24 h全換水并重新添加弧菌。在感染實(shí)驗(yàn)開始后的1 d和5 d, 在3個(gè)重復(fù)組中隨機(jī)各取10顆泥蚶用于檢測(cè)泥蚶肝胰腺的弧菌載量。同時(shí), 每天觀察記錄另外3個(gè)重復(fù)組泥蚶的死亡情況。采用SPSS22.0 Spearman秩相關(guān)性分析泥蚶肝胰腺與實(shí)驗(yàn)水體中弧菌含量的相關(guān)關(guān)系; 感染后1 d和5 d在不同濃度下泥蚶體內(nèi)弧菌載量差異顯著性檢驗(yàn)采用One-way ANOVA方法, 顯著性水平設(shè)定為<0.05。

1.2.3 哈維氏弧菌數(shù)量檢測(cè) 通過涂板計(jì)數(shù)的方式檢測(cè)海水中弧菌總數(shù)和泥蚶組織中的弧菌載量。泥蚶組織先用無菌生理鹽水沖洗, 定性濾紙吸干表面水分, 經(jīng)分析天平稱重后, 按1︰9 (質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))加無菌生理鹽水稀釋, 用眼科剪破碎, 將組織原液和血液梯度稀釋10×、100×、1 000×, 分別吸取100 μL涂于TCBS瓊脂培養(yǎng)基平板上。28 °C培養(yǎng)20—24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù), 組織弧菌載量根據(jù)稀釋倍數(shù)和組織重?fù)Q算成CFU/mg, 血液弧菌載量根據(jù)稀釋倍數(shù)換算成CFU/mL。數(shù)據(jù)經(jīng)過lg值轉(zhuǎn)換后進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 弧菌計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線

以不同濃度菌懸液在OD=560 nm處的吸光值為橫坐標(biāo), TCBS平板計(jì)數(shù)值為縱坐標(biāo), 擬合得到一條直線, 其回歸方程為=(95.64+0.291 3)×107(為菌液濃度,為OD560值),2=0.992 6, 表明OD560值在0.01—0.60之間, 菌液含菌量呈良好的線性關(guān)系(圖1)。利用該標(biāo)準(zhǔn)曲線能快速檢測(cè)本研究培養(yǎng)的哈維氏弧菌濃度, 為后續(xù)感染實(shí)驗(yàn)中弧菌濃度的快速測(cè)定提供依據(jù)。

圖1 哈維氏弧菌數(shù)與OD560值關(guān)系曲線

2.2 攻毒水體中哈維氏弧菌含量的日變化趨勢(shì)

為了檢測(cè)哈維氏弧菌浸泡感染實(shí)驗(yàn)中, 海水中弧菌濃度能否達(dá)到預(yù)設(shè)濃度要求, 我們監(jiān)測(cè)了感染過程中弧菌在水體中的動(dòng)態(tài)變化過程。結(jié)果表明, 砂濾海水中弧菌濃度為(32.25±5.14) CFU/mL, 按照設(shè)定的1×107CFU/mL的濃度添加哈維氏弧菌后, 0 h弧菌感染組海水中活菌初始濃度為(1.06±0.08)×107CFU/mL, 對(duì)照組活菌初始濃度為(1.07±0.04)×107CFU/mL, 均能夠達(dá)到預(yù)期的弧菌濃度?；【腥窘M6 h和12 h活菌濃度與0 h無顯著差異, 隨后海水中活菌濃度逐漸下降, 24 h最低為(7.83±0.15)×106CFU/mL。對(duì)照組活菌濃度在弧菌加入后, 逐漸上升, 在12 h達(dá)到最大, 為(1.54±0.93)×107CFU/mL, 之后緩慢下降至(1.20±0.05)×107CFU/mL (圖2)。24 h內(nèi)弧菌感染組有約1/2的時(shí)間里海水中的弧菌濃度維持在1×107CFU/mL, 對(duì)照組海水中的有效濃度基本維持在1×107CFU/mL以上; 并且對(duì)照組的弧菌濃度高于感染組。

圖2 攻毒水體中哈維氏弧菌數(shù)量的日變化(h)

注: 圖中同一曲線中標(biāo)有不同字母表示組間差異顯著(<0.05), 標(biāo)相同字母表示組間差異不顯著(>0.05)

2.3 弧菌攻毒過程中泥蚶不同組織弧菌載量變化

哈維氏弧菌浸泡感染過程中, 對(duì)泥蚶不同組織弧菌載量的變化趨勢(shì)進(jìn)行分析, 結(jié)果顯示(表1), 哈維氏弧菌感染前, 50顆泥蚶鰓、外套膜、閉殼肌、肝胰腺、血液中哈維氏弧菌的檢出率分別為34.0%、28.0%、30.0%、30.0%、36.0%, 血液弧菌載量顯著高于其他4個(gè)組織。感染后1 d泥蚶組織中哈維氏弧菌載量較感染前有顯著增加, 其中血液弧菌載量最高為(31 946.00±19 633.84) CFU/mL, 增加了591倍, 絕對(duì)弧菌載量和相對(duì)增加倍數(shù)均顯著高于其他各組織。在持續(xù)感染的3 d, 泥蚶各組織的弧菌載量較1 d顯著下降(<0.05); 除肝胰腺組織外, 感染后6 d其他組織的弧菌載量均處于與3 d相當(dāng)?shù)乃?>0.05)。

表1 哈維氏弧菌感染前后泥蚶組織中的弧菌載量

Tab.1 The Vibrio load in clam T. granosa under V. harveyi challenge

注: 表中數(shù)據(jù)不同小寫字母表示相同時(shí)間下不同組織弧菌載量之間的差異顯著(<0.05); 不同大寫字母表示相同組織下不同時(shí)間弧菌載量之間的差異顯著(<0.05)

攻毒后泥蚶同一組織不同個(gè)體弧菌載量存在較大差異(圖3)。感染前泥蚶鰓、外套膜、閉殼肌和肝胰腺有90%的個(gè)體弧菌載量處于100CFU/mg數(shù)量級(jí)。感染1 d, 鰓組織的弧菌載量為(53.19±76.90) CFU/mg, 16%的泥蚶處于100CFU/mg數(shù)量級(jí), 72%處于101CFU/mg數(shù)量級(jí), 12%處于102CFU/mg數(shù)量級(jí); 外套膜的弧菌載量為(116.51±184.63) CFU/mg, 16%的泥蚶處于100CFU/mg數(shù)量級(jí), 60%處于101CFU/mg數(shù)量級(jí), 24%處于102CFU/mg數(shù)量級(jí); 閉殼肌的弧菌載量為(90.56±114.65) CFU/mg, 16%的泥蚶處于100CFU/mg數(shù)量級(jí), 58%處于101CFU/mg數(shù)量級(jí), 26%處于102CFU/mg數(shù)量級(jí); 肝胰腺的弧菌載量為(125.21±123.07) CFU/mg, 12%的泥蚶處于100CFU/mg數(shù)量級(jí), 44%處于101CFU/mg數(shù)量級(jí), 44%處于102CFU/mg數(shù)量級(jí); 血液的弧菌載量為(31 946.00±19 633.84) CFU/mL, 14%的泥蚶處于103CFU/mL數(shù)量級(jí), 86%處于104CFU/mL數(shù)量級(jí)。在感染后3 d, 泥蚶體內(nèi)弧菌載量下降, 鰓、外套膜、閉殼肌的弧菌載量主要分布在100CFU/mg數(shù)量級(jí), 分別占比82.0%、72.0%和68.0%; 肝胰腺弧菌載量主要在101CFU/mg數(shù)量級(jí), 占比62.0%; 血液中弧菌載量在102CFU/mL數(shù)量級(jí)占比26.0%, 在103CFU/mL數(shù)量級(jí)占比58.0%。在感染后6 d, 鰓、閉殼肌、外套膜的弧菌載量在100CFU/mg較多, 分別占比74.0%、58.0%、72.0%; 肝胰腺的弧菌載量在101較多, 占比68.0%; 血液的弧菌載量在103較多, 占比64.0%。

圖3 哈維氏弧菌攻毒過程中泥蚶組織中弧菌載量的分布

注: a. 鰓, b. 外套膜, c. 閉殼肌, d. 肝胰腺, e. 血液

2.4 泥蚶體內(nèi)弧菌載量與弧菌感染濃度的相關(guān)性分析

不同濃度的哈維氏弧菌感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在感染1 d, 隨著弧菌感染濃度的增加, 泥蚶肝胰腺中弧菌載量也呈現(xiàn)出升高的趨勢(shì), 與對(duì)照組相比, 感染組肝胰腺弧菌載量增加了81.0—667.8倍, 顯著高于對(duì)照組, 且與水體中的弧菌含量呈顯著的正相關(guān)(Spearman’s=0.762,<0.001)。在感染5 d, 四個(gè)弧菌濃度感染組泥蚶肝胰腺弧菌載量較1 d均明顯減少, 除1×105CFU/mL感染組外, 其余感染組泥蚶肝胰腺弧菌載量仍然顯著高于對(duì)照組(<0.05), 1×105CFU/mL濃度組1 d的弧菌載量是5 d的16.2倍, 5×107CFU/mL濃度組1 d則為5 d的7.0倍(圖4)。同時(shí)我們統(tǒng)計(jì)了不同濃度哈維氏弧菌感染過程中泥蚶的死亡情況(圖 5), 發(fā)現(xiàn)在1×105CFU/mL感染濃度下, 泥蚶未出現(xiàn)死亡; 在1×107CFU/mL條件下泥蚶累計(jì)死亡率為(6.67±2.31)%; 在5×107CFU/mL條件下泥蚶累計(jì)死亡率高達(dá)100%。以上結(jié)果表明弧菌感染導(dǎo)致泥蚶死亡是一個(gè)閾值性狀, 泥蚶健康或死亡與其體內(nèi)弧菌載量之間的關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。

圖4 不同濃度哈維氏弧菌感染后1 d和5 d泥蚶肝胰腺哈維氏弧菌載量變化

注: 圖中含有不同字母表示在同一天弧菌載量之間的差異顯著(<0.05)

圖5 不同濃度哈維氏弧菌感染下泥蚶存活率

3 討論

3.1 攻毒水體中哈維氏弧菌含量的日變化分析

目前, 在水產(chǎn)動(dòng)物的免疫學(xué)研究中, 常常利用外界病原菌刺激的方法來模擬宿主在自然條件下的脅迫環(huán)境, 然而宿主體內(nèi)的病原菌及其含量閾值是激活宿主機(jī)體免疫系統(tǒng)的前提條件(王瑞等, 2019)。本研究通過人工浸泡感染的方法模擬自然條件下哈維氏弧菌的感染過程, 獲得泥蚶在自然環(huán)境死亡相同的癥狀。為了明確弧菌添加到水體后的生長繁殖規(guī)律, 及能否達(dá)到預(yù)期設(shè)定的濃度。本研究采用TCBS瓊脂培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)法, 對(duì)實(shí)驗(yàn)水體中的哈維氏弧菌活菌數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)?；【砑拥胶Ｋ髮?shí)測(cè)的初始濃度與設(shè)定濃度基本一致, 證明了弧菌計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性。感染組在0—3 h弧菌數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì), 推測(cè)可能是泥蚶通過濾食作用, 同時(shí)攝食了單胞藻和哈維氏弧菌。經(jīng)過一段時(shí)間的適應(yīng), 弧菌開始繁殖, 海水中出現(xiàn)大量泡沫, 水體變得渾濁, 臭味變濃, 因此, 海水中弧菌濃度在3—6 h呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。6 h后攻毒水體的的弧菌數(shù)量下降, 可能由于水體中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗以及泥蚶的濾食作用導(dǎo)致。實(shí)驗(yàn)過程中, 感染組至少有1/2的時(shí)間弧菌濃度維持在1×107CFU/mL, 表明人工浸泡感染實(shí)驗(yàn)?zāi)芎芎玫哪M泥蚶在自然環(huán)境中的弧菌脅迫, 為進(jìn)一步研究弧菌載量提供了可能。

3.2 弧菌攻毒過程泥蚶不同組織中弧菌載量變化分析

弧菌持續(xù)感染泥蚶過程中, 弧菌與宿主細(xì)胞間的相互作用, 包括體表吸附、侵襲、體內(nèi)增殖、產(chǎn)生毒素等(Elston, 1980), 會(huì)激發(fā)宿主的一系列免疫反應(yīng)。泥蚶不同組織中弧菌載量檢測(cè)結(jié)果, 顯示了弧菌在泥蚶體內(nèi)增殖、死亡的過程。與感染前泥蚶相比, 感染后1 d弧菌在各組織中數(shù)量顯著上升。隨著泥蚶細(xì)胞免疫和體液免疫系統(tǒng)被激活, 吞噬作用、溶酶體降解作用、抗菌肽抑菌作用啟動(dòng), 體內(nèi)大多數(shù)病原弧菌被殺死, 因此, 感染后3 d檢測(cè)到的弧菌數(shù)量迅速下降, 后期維持較低水平。王瑞等(2019)在對(duì)文蛤()進(jìn)行副溶血弧菌感染的實(shí)驗(yàn)中, 也發(fā)現(xiàn)了文蛤體內(nèi)弧菌載量總體變化趨勢(shì)表現(xiàn)為先急劇上升, 后迅速下降, 并在后期維持一個(gè)較低的水平。Wang等(2010)利用副溶血弧菌人工感染長牡蠣(), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)牡蠣各組織的副溶血載量的變化趨勢(shì)也與本文一致。

貝類致病弧菌的特異性富集組織仍然沒有統(tǒng)一的認(rèn)識(shí), 有研究表明副溶血弧菌可在牡蠣()消化腺(包括腸胃和消化盲囊)和鰓組織中高效富集(Cabello, 2005), 創(chuàng)傷弧菌可在美洲牡蠣()淋巴、閉殼肌和外套膜中大量增殖(Tamplin, 1992)。本研究發(fā)現(xiàn)在哈維氏弧菌感染下, 泥蚶鰓、閉殼肌、外套膜、肝胰腺和血液中均能檢出弧菌, 血液中弧菌載量最高, 且顯著高于其他組織, 不同組織呈現(xiàn)弧菌載量的富集差異性。在感染過程中, 泥蚶處于開口狀態(tài), 外界高濃度的弧菌與泥蚶血竇直接接觸, 弧菌可能通過擴(kuò)散作用進(jìn)入血液中, 導(dǎo)致血液中弧菌載量大量富集。外套膜直接接觸外界環(huán)境, 是泥蚶過濾防御細(xì)菌、病毒等第一道屏障(周永燦等, 1997); 鰓是泥蚶的呼吸攝食器官, 直接與水環(huán)境接觸, 具有氣體交換與濾食水中顆粒物的作用(陳彩芳等, 2012), 在此過程中可能伴隨弧菌的侵入。肝胰腺的主要功能是餌料消化, 弧菌會(huì)隨餌料一同被泥蚶攝食, 導(dǎo)致肝胰腺中有大量的弧菌累積。閉殼肌的功能是控制泥蚶兩殼開合, 在外套膜的免疫防線之內(nèi)(趙丹等, 2020), 推測(cè)弧菌隨體液循環(huán)導(dǎo)致閉殼肌中有弧菌被檢測(cè)到。貝類的細(xì)胞免疫和體液免疫協(xié)同作用, 共同保護(hù)機(jī)體免受病原體的損害。因此, 我們推測(cè)泥蚶體內(nèi)弧菌載量的迅速降低以及弧菌載量的個(gè)體差異, 可能與機(jī)體的免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱有關(guān), 這種泥蚶個(gè)體水平和不同組織的載菌差異為我們進(jìn)行免疫抗病性狀指標(biāo)的篩選提供了素材。

3.3 泥蚶體內(nèi)弧菌載量與弧菌感染濃度的相關(guān)性分析

無脊椎動(dòng)物的免疫防御主要依賴于其先天免疫系統(tǒng), 其中肝胰腺是一個(gè)重要的免疫器官(R?szer, 2014)。本研究發(fā)現(xiàn)在感染早期, 隨著水體中弧菌濃度的升高, 泥蚶肝胰腺的弧菌載量也隨之變高。王瑞等(2019)在副溶血弧菌感染文蛤的研究中發(fā)現(xiàn)與本文相一致的結(jié)果, 即攻毒前期, 文蛤肝胰腺的弧菌載量隨攻毒水體中弧菌濃度的升高而升高。不同強(qiáng)度的弧菌對(duì)泥蚶的死亡率有極大影響, 高濃度組會(huì)提前宿主的死亡時(shí)間, 且導(dǎo)致高死亡率。同樣在哈維氏弧菌感染皺紋盤鮑()的研究中也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果(何婷婷, 2018)。不同強(qiáng)度的病原菌感染導(dǎo)致宿主產(chǎn)生不同程度的免疫響應(yīng)。例如, 用不同濃度燦爛弧菌()感染厚殼貽貝()能引起宿主體內(nèi)免疫相關(guān)因子發(fā)生不同程度的變化, 導(dǎo)致宿主體內(nèi)免疫機(jī)制響應(yīng)的差異(梁簫等, 2018)。不同強(qiáng)度的弧菌感染造成泥蚶體內(nèi)弧菌載量的差異, 可能會(huì)引起泥蚶免疫系統(tǒng)產(chǎn)生不同程度的響應(yīng), 最終導(dǎo)致死亡率差異。受到病原侵染的宿主會(huì)產(chǎn)生一系列免疫反應(yīng), 通過水解ATP, 消耗機(jī)體能量, 產(chǎn)生大量活性氧, 免疫反應(yīng)過強(qiáng)的個(gè)體, 其活性氧分子在清除外來入侵的病原菌的同時(shí)也會(huì)對(duì)宿主的細(xì)胞、組織和器官造成損傷, 從而導(dǎo)致宿主生理功能的損傷和免疫系統(tǒng)的破壞, 這可能是除了高濃度致病菌對(duì)宿主的傷害外, 另一個(gè)造成宿主高死亡率的原因(Yu, 1994)。

4 結(jié)論

本研究通過哈維氏弧菌浸泡感染來模擬泥蚶在自然界的弧菌脅迫環(huán)境。采用比濁法獲得了哈維氏弧菌的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過TCBS平板計(jì)數(shù)對(duì)攻毒水體中24 h內(nèi)哈維氏弧菌的濃度進(jìn)行檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)24 h內(nèi)濃度為1×107CFU/mL的弧菌感染組有約1/2的時(shí)間里海水中的弧菌濃度維持在預(yù)設(shè)濃度。分析了弧菌感染前后不同時(shí)間點(diǎn)泥蚶組織中弧菌載量的變化規(guī)律, 發(fā)現(xiàn)泥蚶組織中的弧菌載量呈現(xiàn)先上升, 再下降, 最后維持較低水平的變化趨勢(shì), 其中血液中的弧菌載量顯著高于其他4個(gè)組織。采用不同濃度的哈維氏弧菌浸泡感染實(shí)驗(yàn), 分析攻毒水體中的弧菌濃度與泥蚶體內(nèi)肝胰腺弧菌載量的相關(guān)性分析, 發(fā)現(xiàn)1 d時(shí)各感染組肝胰腺弧菌載量均較對(duì)照組顯著增加, 且與浸泡水體中弧菌濃度呈顯著正相關(guān), 5 d時(shí)各侵染組肝胰腺弧菌載量均較1 d明顯降低, 但仍然高于對(duì)照組。研究結(jié)果為泥蚶感染弧菌發(fā)病過程中免疫識(shí)別及免疫響應(yīng)機(jī)制的研究提供了參考。

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LOAD VARIATION OFIN THE BLOOD CLAM

YANG Qian-Yuan1, 2, TENG Shuang-Shuang2, CAI Yi-Long2, XIAO Guo-Qiang1, 2, CAI Xi-Li3

(1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Zhejiang Mariculture Research Institute; Zhejiang Key Laboratory of Exploitation and Preservation of Coastal Bioresource; Wenzhou Key Laboratory of Marine Biological Genetics and Breeding, Wenzhou 325005, China; 3. Pingyang Agriculture and Rural Bureau of Zhejiang Province, Pingyang 325499, China)

To understand the variation detail of bacterial load in different tissues of the blood clam(including gill, mantle, adductor, hepatopancreas, and blood) underchallenge, aimmersion experiment was conducted and the standard curve ofconcentration was established by turbidimetric method, from which the dynamic relationship between the bacterial growth and reproduction in seawater underchallenge in 24 h was described, the bacterial load of the blood clam tissues was calculated, and the relationship between theload in hepatopancreas and the immersion different concentrations (1×105, 1×106, 1×107, 5×107CFU/mL) ofin seawater was specified. The results showed that theload in the clam blood was significantly higher than in other tissues under the concentration of 1×107CFU/mL. The bacterial load in the tissues was increased at first, then decreased, and finally stayed at a low level. Theload in the blood was decreased to 102—104CFU/mL, and theload in other tissues was decreased to 100—102CFU/mg. Under differentconcentrations, theload in the hepatopancreas increased significantly on Day 1, which was 81.0—667.8 times of that of the control. Correlation between the bacterial load and thedose in the seawater was significantly positive (Spearman’s=0.762,<0.001). The bacterial load in the hepatopancreas was obviously decreased on Day 5, which was still higher than that of the control. This study provided a reference for the immune recognition and response during pathogenesis byinfection in.

;;load; immune resistance

* 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目, 31902358號(hào); 國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目, 2018YFD0901405-2號(hào), 2020YFD0900802號(hào); 浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目, 2019C02045號(hào), 2018C02039號(hào); 財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部: 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助; 溫州市農(nóng)業(yè)新品種選育協(xié)作組項(xiàng)目, 2019ZX001-1號(hào)。楊千元, 碩士研究生, E-mail: 1595380471@qq.com

肖國強(qiáng), 研究員, E-mail: xiaogq1978@163.com

2021-03-30,

2021-05-18

S944.3

10.11693/hyhz20210300074