楊丙曄 李 瑩 陳仲巍

廈門醫(yī)學(xué)院廈門市海洋藥用天然產(chǎn)物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361000

牡蠣屬于軟體動(dòng)物門、雙殼綱、珍珠貝目、牡蠣科，是一類非常重要的海洋經(jīng)濟(jì)物種，其蛋白含量豐富，肉質(zhì)鮮美，是人們非常喜愛的海洋食物之一，素有“海中牛奶”的美稱[1-2]。牡蠣地理分布廣泛，沿海的國(guó)家、地區(qū)幾乎都有牡蠣的分布，且生長(zhǎng)迅速，產(chǎn)量高和經(jīng)濟(jì)效益好，是世界各國(guó)重要的海水養(yǎng)殖種類[3]。中國(guó)是世界第一海水養(yǎng)殖大國(guó)，牡蠣的養(yǎng)殖產(chǎn)量也位居世界首位[4]。到2007 年，牡蠣養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到海洋養(yǎng)殖總產(chǎn)量的1/3，是中國(guó)海水養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的種類。但近幾年牡蠣的養(yǎng)殖也出現(xiàn)了種質(zhì)退化的問題[5]，其中主要的問題就是生長(zhǎng)慢、成熟個(gè)體小型化、品質(zhì)下降[6-7]，解決這一問題除了培育新品種，近年來有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)體外添加胰島素樣生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)雙殼類軟件生物的生長(zhǎng)[8]。

在哺乳動(dòng)物中，胰島素超家族在生長(zhǎng)發(fā)育、代謝和壽命等方面具有重要的調(diào)節(jié)控制作用[9-11]。胰島素超家族主要包括四類：胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin growth factor，IGF）、松弛素和胰島素相關(guān)多肽（insulin-related polypeptides，IRP）。胰島素超家族相對(duì)比較保守，研究發(fā)現(xiàn)胰島素超家族對(duì)生物體的多種生理過程都有重要調(diào)節(jié)作用[12]。IGF 主要在脊椎動(dòng)物中起調(diào)節(jié)作用[13]，IRP 主要在無脊椎動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)起作用。利用大腸埃希菌表達(dá)脊椎動(dòng)物的IGF 已經(jīng)有很多報(bào)道[14-15]，使用大腸埃希菌表達(dá)海洋無脊椎動(dòng)物的胰島素相關(guān)多肽還未見報(bào)道。本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)純化牡蠣I(yíng)RP3 蛋白，為IRP3 蛋白的抗體制備和體外作為生長(zhǎng)因子添加劑的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

質(zhì)粒提取試劑盒（Plasmid DNA extraction kit，DP1103）和DNA 膠回收試劑盒（DNA gel Extraction Kit，DP209）購(gòu)自天根生化科技有限公司；T4 DNA 連接酶（T4 DNA Ligase，M0202L）和Taq DNA 聚合酶（Taq DNA Ploymerase，C11304-011）來自寶生物工程有限公司；ECL 顯色試劑盒（Enhanced chemiluminescent detection reagent kit，SW2020）購(gòu)自泰德生物科技有限公司；質(zhì)粒pET30a 和菌株E.coli BL21 實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 IRP3 基因克隆構(gòu)建和篩選

利用全基因合成技術(shù)合成IRP3 基因，并在IRP3基因兩端加入限制性酶切位點(diǎn)Nde Ⅰ和Hind Ⅲ，利用雙酶切和連接技術(shù)將IRP3 基因克隆構(gòu)建到載體pET30a 中，然后轉(zhuǎn)化Top10 感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素（Kanarnycin，Kan）的LB 平板培養(yǎng)基上篩選長(zhǎng)出的陽(yáng)性菌落，分別利用雙酶切和測(cè)序的方法確認(rèn)構(gòu)建載體的準(zhǔn)確性，提取陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）表達(dá)菌株。

1.3 IRP3 蛋白表達(dá)及鑒定

挑取BL21（DE3）陽(yáng)性表達(dá)菌株單克隆，接種到4 ml的含有Kan LB 液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4 h，菌液OD600 達(dá)到0.8 時(shí)，向菌液中加入IPTG 使之終濃度為0.1 mmol/L，之后分別于15℃和37℃誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)。收集誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液，12 000 r/min 離心5 min，去除上清液，加入PBS 液重懸菌液沉淀，最后加入上樣緩沖液，于沸水浴中加熱樣品10 min，將樣品12 000 r/min離心10 min，將上清液加入SDS-PAGE 凝膠中，電泳分離蛋白。分離好蛋白的凝膠考馬斯亮藍(lán)染色液染色，隨后加入脫色液脫色直至凝膠沒有蛋白的地方透明清晰。

1.4 IRP3 蛋白純化

將所有菌液收集，加入含有20 mmol/L PBS（pH7.2），300 mmol/L NaCl，20 mmol/L Imidazole（含1% Triton X-100，1 μg/mL Pepstatin A，1 μg/ml Leupeptin）裂解液，利用超聲儀器（JY92-IdII，寧波新芝生物科技股份有限公司）進(jìn)行超聲破碎菌液，離心機(jī)離心收集上清液，利用Ni-IDA 親和層析柱純化表達(dá)的蛋白，利用SDS-PAGE 對(duì)純化蛋白進(jìn)行檢測(cè)分析。用含有20 mmol/L PBS（pH7.2），300 mmol/L NaCl，8 mol/L Urea，20 mmol/L Imidazole 的緩沖液溶解包涵體，利用Ni-IDA親和層析柱純化包涵體裂解上清蛋白，利用SDS-PAGE對(duì)純化蛋白進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.5 IRP3 蛋白的鑒定

利用SDS-PAGE 電泳和Western blot 技術(shù)，以BSA 作為對(duì)照，對(duì)純化透析后的樣品分別進(jìn)行鑒定分析，SDS-PAGE 電泳后，一塊膠用于考馬斯亮藍(lán)的染色，一塊膠繼續(xù)以恒電壓100 V 轉(zhuǎn)移60 min 進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作，將電泳凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，然后經(jīng)過膜封閉和6HIS 抗體的孵育結(jié)合，最后通過ECL 試劑盒顯色，用儀器熒光觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 IRP3 基因質(zhì)?？寺〉臋z測(cè)結(jié)果

IRP3 基因序列長(zhǎng)度為1818 bp，開放閱讀框長(zhǎng)度為483 bp，編碼161 個(gè)氨基酸，NCBI 序列號(hào)為XM_011456859.3。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過雙酶切的樣品泳道只有兩個(gè)條帶（圖1），大小與pET-30a 和IRP3目的基因片段大小相符。顯示pET-30a 和IRP3目的基因片段已成功進(jìn)行了克隆構(gòu)建。

圖1 雙酶切瓊脂糖凝膠電泳

2.2 IRP3 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

SDS-PAGE 電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)樣品2 和3 都有目的蛋白表達(dá)，且表達(dá)量基本一致。但15℃過夜表達(dá)樣品的蛋白條帶更少，提示菌體內(nèi)表達(dá)的雜蛋白相對(duì)較少（圖2），15℃過夜培養(yǎng)表達(dá)更優(yōu)。

圖2 IRP3 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

2.3 IRP3 蛋白的純化

SDS-PAGE 電泳結(jié)果顯示菌液普通裂解上清樣品沒有發(fā)現(xiàn)目的蛋白IRP3（圖3）。包涵體溶解離心的上清及上清液純化后的蛋白含有大量的目的蛋白IRP3，提示利用鎳柱親和層析的方法從包涵體裂解液中獲得了較純的IRP3 融合（圖4）。

圖3 上清純化樣品電泳

圖4 包涵體純化樣品電泳分析

2.4 IRP3 純化蛋白的鑒定分析

SDS-PAGE 電泳和Western blot 結(jié)果顯示純化的IRP3 蛋白樣品條帶單一且分子量與電泳指示一致（圖5），說明純化獲得蛋白樣品確實(shí)是IRP3 蛋白，與BSA 比較發(fā)現(xiàn)純化的IRP3 蛋白樣品純度更高。

圖5 IRP3 純化樣品的SDS-PAGE 和Western blot 分析

3 討論

經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)IRP 在貝類中也廣泛存在，貝類中的第一個(gè)類胰島素家族基因是在腹足綱的靜水椎實(shí)螺（Lymnaea stagnalis）中發(fā)現(xiàn)的，并有7 個(gè)貝類IRP 基因被發(fā)現(xiàn)且在神經(jīng)節(jié)中表達(dá)[16]。至今已在多種無脊椎動(dòng)物中證實(shí)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控與環(huán)境應(yīng)激適應(yīng)力有關(guān)[17]。目前普遍認(rèn)為IRP 基因參與貝類的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖調(diào)控過程[18]。同時(shí)在長(zhǎng)牡蠣中發(fā)現(xiàn)IRP 基因表達(dá)量增長(zhǎng)期與長(zhǎng)牡蠣的快速生長(zhǎng)期和繁殖期時(shí)間是一致的[19-20]，這提示了IRP 基因可能對(duì)長(zhǎng)牡蠣的生長(zhǎng)和繁殖調(diào)控有重要作用[21]。

無脊椎動(dòng)物中IRP 通過IRP 受體/胰島素受體，激活MAPK 和PI3K/PKB 信號(hào)通路，調(diào)節(jié)生物的生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝、免疫和繁殖等各種生理過程。IRP 與胰島素的結(jié)構(gòu)有很大相似性，包括了信號(hào)肽，和A、B、C 三鏈。在蛋白表達(dá)修飾工程中，C 鏈會(huì)被剪切，這樣由A 和B 鏈形成成熟結(jié)構(gòu)，在生理過程調(diào)節(jié)中，一個(gè)存在于A 鏈內(nèi)部的二硫鍵和A 鏈和B 鏈之間的二硫鍵起了至關(guān)重要的作用[22]，并且A 鏈和B 鏈內(nèi)形成二硫鍵的半胱氨酸在生物進(jìn)化過程中高度保守[23]。胰島素相關(guān)多肽在無脊椎動(dòng)物中廣泛存在，其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)繁多且比較復(fù)雜，一般認(rèn)為是由PI3K/PKB 通路和MAPK通路這兩條信號(hào)通路組成，在這些通路組成上的各種因子會(huì)進(jìn)行各種轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾水平的調(diào)控[24-25]，由此調(diào)節(jié)無脊椎動(dòng)物各種生長(zhǎng)發(fā)育及新陳代謝生理過程[26]。本研究成功克隆獲得含有IRP3-pET30a 質(zhì)粒的BL21 表達(dá)菌株，從包涵體裂解上清液中獲得了純化的IRP3/HIS 融合蛋白，為IRP3 蛋白的抗體制備和作為體外生長(zhǎng)因子添加劑的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。