楊彬彬 崔 寧 張亞楠 趙文曉 王世軍

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)健康學(xué)院，山東濟南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東濟南 250355；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)護理學(xué)院，山東濟南 250355

現(xiàn)代研究認為中醫(yī)“脾”是涉及消化吸收、能量轉(zhuǎn)化、水鹽代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等的綜合功能單位，脾虛證主要表現(xiàn)為以消化系統(tǒng)為主的多系統(tǒng)多器官的功能低下。胃腸黏膜損傷是脾虛證常見病變之一，益氣健脾中藥對脾虛證患者胃腸道病變有改善作用。黃芪味甘，微溫；入脾、肺經(jīng)；補中益氣、固表利水、托膿毒和生肌[1]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)黃芪具有抗腫瘤、保護腸功能等作用[2]。黃芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）作為黃芪的主要化學(xué)成分之一，可以作用于人體多個系統(tǒng)，具有增強免疫系統(tǒng)功能、抗衰老、抗腫瘤、抗氧化等作用[3-4]。

Wnt 信號通路作為人體較為保守的信號途徑，對生命體的大多數(shù)生物學(xué)現(xiàn)象都有調(diào)控作用[5]，包含多種信號傳導(dǎo)途徑，Wnt/β-連環(huán)蛋白（Wnt/β-catenin）信號通路是Wnt 經(jīng)典途徑，已經(jīng)被證明與很多疾病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，該信號通路激活后會促使人體包括腫瘤細胞在內(nèi)的多細胞不斷增殖，形成增生性、炎癥性和腫瘤性病變。本實驗通過研究APS 調(diào)控Wnt 信號通路對大鼠腸道吸收功能及小腸黏膜損傷的影響，初步探討APS 修復(fù)腸道黏膜損傷機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar 雄性大鼠50 只，4 周齡，體重（150±10）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司購（實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0006，合格證號：1100111911015209）。SPF 級環(huán)境喂養(yǎng)。按照國家部屬實驗動物管理委員會制訂的標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，并經(jīng)本單位實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。動物房溫度23～25℃，相對濕度40%～50%，光照時間7∶00～19∶00。

1.2 藥物

APS，購于Solarbio 公司，批號：716D032，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑及儀器

大鼠淀粉酶酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked im munoadsordent assay，ELISA）試劑盒（批號：200107KE5）、大鼠胃泌素ELISA 試劑盒（批號：200107KE8）、大鼠胃動素ELISA 試劑盒（批號：200107KE9）、大鼠D-木糖ELISA 試劑盒（批號：200107KE10）、大鼠琥珀酸脫氫酶ELISA 試劑盒（批號：200107KE11）均購自江蘇晶美生物科技有限公司。Wnt1（貨號：PAB40578）、βcatenin 抗體（貨號：PAB30671）均購自Bioswamp 武漢貝茵萊生物科技有限公司；TG16W 微量高速離心機（湘儀集團）；GNP-9080 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏）；AC8 洗板機（芬蘭熱電）；352 型酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystems Multiskan MS）。

1.4 研究方法

1.4.1 造模 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，按照隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、APS 高劑量組、APS 中劑量組、APS 低劑量組，每組10 只。除對照組（不作任何處理，正常飼養(yǎng)）外，其余各組按照前期本課題組模型制備方法造模，具體造模方法為：大鼠每日飼以高脂低蛋白飼料加力竭游泳，連續(xù)8 周，建立脾虛濕困大鼠模型[6]。對照組飼以AIN-76A 純化飼料。各組均自由進食、飲水。

1.4.2 給藥 造模成功后，于造模結(jié)束后次日APS 高劑量組按照900 mg/（kg·d）、APS 中劑量組按照600 mg/（kg·d）、APS 低劑量組按照300 mg/（kg·d）灌胃，1 次/d，每次1 ml/100 g，連續(xù)2 周，對照組和模型組給予同體積生理鹽水，灌胃。觀察大鼠一般狀況并記錄大鼠體重變化情況。

1.4.3 標(biāo)本采集 各組大鼠麻醉后，腹主動脈采血，室溫靜置2 h 后低溫離心（4℃，3000 r/min，10 min，離心半徑10 cm），將血清放置于-20℃低溫冰箱中，備用。取小腸組織，置于4%多聚甲醛液中固定。

1.4.4 血清D-木糖、胃泌素、胃動素、琥珀酸脫氫酶、淀粉酶檢測 按照試劑盒說明，采用雙抗體夾心ELISA檢測各組大鼠血清淀粉酶、D-木糖、胃動素、胃泌素、琥珀酸脫氫酶水平。

1.4.5 小腸黏膜病理學(xué)及免疫組織化學(xué)檢測 小腸組織常規(guī)石蠟包埋，制作3～4 μm 石蠟切片，取各組大鼠小腸組織在10%中性甲醛中固定24 h 后進行脫水、透明處理，石蠟包埋，3～4 μm 切片，行常規(guī)HE 染色，于顯微鏡下觀察病理改變。

將包埋好的組織進行切片，厚度為3 μm；水浴展片，撈片，烤片，常規(guī)脫蠟水化；檸檬酸鈉緩沖溶液中高壓抗原修復(fù)；10%山羊血清中封閉；滴加Wnt1、βcatenin 一抗（1∶50 稀釋），4℃孵育過夜，次日放置室溫下復(fù)溫，滴加二抗（1∶50 稀釋），濕盒孵育，37℃孵育60 min。DAB 染色，蘇木精復(fù)染，樣本經(jīng)75%酒精、85%酒精、95%酒精、100%酒精Ⅰ、100%酒精Ⅱ分別浸泡5 min 脫水，封片。在200 倍顯微鏡下觀察Wnt1、β-catenin 蛋白的表達，使用Mantra 圖像分析軟件對兩種目標(biāo)蛋白進行光密度（optical density，OD）半定量分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

對照組一般狀況穩(wěn)定，進食正常，體重穩(wěn)定上升，活潑好動，大小便正常，毛色光澤。與對照組比較，模型組逐漸出現(xiàn)食欲不振、神倦懶動、瞇眼、被毛無光等狀況。

2.2 APS 對脾虛濕困大鼠血清淀粉酶、D-木糖水平的影響

與對照組比較，模型組血清淀粉酶、D-木糖水平顯著降低，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）；與模型組比較，APS 高、中、低劑量組血清淀粉酶水平升高，APS 高劑量組D-木糖水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表1。

表1 APS 對脾虛濕困大鼠血清淀粉酶、D-木糖水平的影響（）

表1 APS 對脾虛濕困大鼠血清淀粉酶、D-木糖水平的影響（）

注：與對照組比較，aaP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01。APS：黃芪多糖

2.3 APS 對脾虛濕困大鼠血清胃動素、胃泌素的影響

與對照組比較，模型組血清胃動素、胃泌素水平均顯著降低，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。與模型組比較，APS 高劑量組血清胃泌素水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），APS 低劑量組、中劑量組血清胃動素水平顯著升高，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。見表2。

表2 APS 對脾虛濕困大鼠血清胃泌素、胃動素水平的影響（pg/ml，）

表2 APS 對脾虛濕困大鼠血清胃泌素、胃動素水平的影響（pg/ml，）

注：與對照組比較，aaP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01。APS：黃芪多糖

2.4 APS 對脾虛濕困大鼠小腸黏膜病理形態(tài)學(xué)的影響

對照組小腸黏膜完整，絨毛表皮較完整，細胞排列整齊，黏膜層上皮細胞排列整齊，固有層內(nèi)無或有少量炎癥細胞浸潤，間質(zhì)未見明顯水腫，見圖1A。與對照組比較，模型組小腸絨毛排列紊亂、變短，表皮細胞出現(xiàn)明顯凋亡與壞死，固有層毛細血管擴張充血明顯，間質(zhì)有少量中性粒細胞浸潤，見圖1B；與模型組比較，APS 各組小腸絨毛相對完整，細胞排列相對整齊，黏膜上層細胞排列相對整齊，固有層有少量炎癥細胞浸潤，間質(zhì)未見明顯水腫，見圖1C～E。

圖1 APS 對脾虛濕困大鼠病理形態(tài)學(xué)影響（HE 染色，200×）

2.5 APS 對脾虛濕困大鼠小腸黏膜損傷相關(guān)蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組Wnt1、β-catenin 蛋白表達顯著升高，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。與模型組比較，APS 高、中、低劑量組Wnt1、β-catenin 蛋白水平均顯著降低，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。見圖2～3，表3。

表3 APS 對脾虛濕困大鼠小腸黏膜蛋白Wnt1、β-catenin 水平影響（）

表3 APS 對脾虛濕困大鼠小腸黏膜蛋白Wnt1、β-catenin 水平影響（）

注：與對照組比較，aaP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01。APS：黃芪多糖

圖2 APS 對脾虛濕困大鼠腸黏膜Wnt1 蛋白表達的影響（免疫組化，200×）

圖3 APS 對脾虛濕困大鼠腸黏膜β-catenin 蛋白表達的影響（免疫組化，200×）

3 討論

脾虛濕困是中醫(yī)常見證型，是主要以消化系統(tǒng)功能障礙為主的一種全身性綜合病理狀態(tài)[7-8]，大量研究表明脾虛證患者及動物易出現(xiàn)腸黏膜上皮細胞損傷及吸收障礙[9-10]。張介賓《類經(jīng)·藏象類》曰“小腸居胃之下，受盛胃中水谷而分清濁，水液由此而滲于前，糟粕由此而歸于后，脾氣化而上升，小腸化而下降”?？梢娢改c功能紊亂尤其是小腸的吸收功能下降在脾虛濕困發(fā)病機制中起到重要作用，而腸黏膜損傷導(dǎo)致通透性增高，引起腸道細菌和毒素移位，消化吸收功能下降，可能是脾虛濕困的發(fā)病機制。

黃芪性溫，補脾和胃，補氣生血，溫升，利水[11-12]。APS 作為其主要活性成分，具有保肝、降血糖、抗病毒、抗氧化延緩衰老等作用[13-18]，有研究顯示APS 可加速胃腸黏膜損傷早期修復(fù)過程[19]。

血清淀粉酶活性的強弱是消化酶分泌功能的特異性指標(biāo)[20]。胃動素主要生理活性是誘發(fā)胃強烈收縮和小腸的分節(jié)運動，刺激胃蛋白酶和胰液的分泌[21]。本實驗中，APS 低、中劑量組血清淀粉酶及胃動素水平均較模型組升高，提示APS 能夠提高消化酶分泌，促進腸蠕動。胃泌素、D-木糖濃度可以間接反映脾氣虛證的嚴重程度及治療后的恢復(fù)情況[22]。本研究中，脾虛濕困大鼠血清胃泌素分泌減少、D-木糖水平下降，反映小腸吸收功能障礙，APS 干預(yù)后，APS 高劑量組胃泌素及D-木糖水平均較模型組顯著升高，提示APS 可以在一定程度上改善脾虛癥狀，使消化道黏膜得以修復(fù)，提高吸收功能。

Wnt 信號通路是在后生動物細胞內(nèi)高度保守的關(guān)鍵信號通路，Wnt/β-catenin 信號通路是上世紀80 年代最先在動物研究中被發(fā)現(xiàn)[23]。其參與調(diào)控胚胎的早期發(fā)育、成體的組織穩(wěn)態(tài)維持、干細胞自我更新、細胞命運決定、細胞分裂及腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種生物學(xué)過程[24-29]。

Wnt 通路的組成主要包括細胞外因子、跨膜受體Frizzled、β-catenin 及T 細胞趨化因子4 等一系列蛋白。Wnt/β-catenin 通路是Wnt 通路中最為經(jīng)典的信號通路。當(dāng)Wnt/β-catenin 通路異常激活時，多種因子可與β-catenin 相互作用，使得β-catenin 由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，競爭性結(jié)合T 細胞趨化因子4，抑制T 細胞趨化因子4 的轉(zhuǎn)錄激活，從而誘導(dǎo)細胞發(fā)生增生性、炎癥性或者腫瘤性病變[30-31]。本實驗條件下，脾虛濕困大鼠小腸黏膜損傷、Wnt1、β-catenin 蛋白表達異常升高，APS 通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路，下調(diào)了Wnt1 及β-catenin 的表達，改善了腸黏膜損傷及胃腸功能，發(fā)揮其益氣健脾祛濕的功效。

本實驗對APS 高、中、低3 個劑量在提高脾虛濕困大鼠胃腸功能及修復(fù)腸道黏膜損傷機制方面進行深入研究。本實驗以前期研究為基礎(chǔ)，以大鼠血清淀粉酶、D-木糖、胃泌素、胃動素等指標(biāo)變化反映脾虛濕困大鼠胃腸消化吸收功能的下降，小腸黏膜病理學(xué)形態(tài)結(jié)果及Wnt1、β-catenin 蛋白表達的變化提示這可能與腸黏膜損傷有關(guān)。APS 干預(yù)后，結(jié)果顯示腸黏膜損傷及胃腸功能紊亂得到一定程度改善，提示其機制可能與調(diào)節(jié)Wnt 信號通路有關(guān)。課題組將進一步就APS 如何通過Wnt 信號通路修復(fù)腸道黏膜損傷從而發(fā)揮健脾祛濕機制進行深入研究。