于釗江

（安陽師范學院，河南 安陽 455000）

黑色素瘤是黑色素細胞異常增生引發(fā)的惡性腫瘤, 每年全世界有超過28 萬新發(fā)患者,6 萬多死亡病例[1]。黑色素瘤具有高度侵襲性,易廣泛轉(zhuǎn)移到淋巴系統(tǒng)和其他重要器官,近1/3 的患者最終發(fā)展為轉(zhuǎn)移性疾病[2]。然而,黑色素瘤的生長和轉(zhuǎn)移機制仍不清楚,需要進一步的研究。

LncRNA 是一類無蛋白質(zhì)編碼潛能的生物大分子[3]。研究表明,lncRNA 廣泛參與腫瘤細胞生長、分化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等[4],進而促進或抑制腫瘤的進展。因此,闡明lncRNA 在黑色素瘤中的功能有望為病人的診斷、預(yù)后判定和靶向治療奠定基礎(chǔ)。本研究從TCGA 數(shù)據(jù)庫中篩選所需數(shù)據(jù), 篩選轉(zhuǎn)移性黑色素瘤相關(guān)lncRNA 及mRNA 基因,進行生物信息學分析,旨在為轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)采集

從TCGA 數(shù)據(jù)庫中下載471 例黑色素瘤樣本RNA-seq 和miRNA-seq 數(shù)據(jù)。將下載數(shù)據(jù)生成基因表達矩陣文件,分為原位黑色素瘤組(103 例)和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤組(368 例)。

1.2 差異表達mRNA、miRNA、lncRNA 數(shù)據(jù)分析

基于R 包edgeR 進行差異分析, 得到差異表達的mRNA、miRNA、lncRNA 數(shù)據(jù)。其中,利用GENCODE 的gtf基因注釋文件定義RNAseq 中的lncRNA 基因, 利用R 提取lncRNA,生成表達矩陣。

1.3 ceRNA 調(diào)控網(wǎng)構(gòu)建

miRcode 數(shù)據(jù)庫預(yù)測lncRNA 與miRNA 的相互作用。利用Targetscan、miRBD、miRwalk 數(shù)據(jù)庫檢索miRNA 的靶向mRNA。調(diào)控網(wǎng)絡(luò)結(jié)果用Cytoscape3.8.1 軟件生成。

1.4 差異表達miRNA 靶基因功能注釋、通路分析

采用線上分析工具DAVID 與KOBAS 對lncRNA 靶向mRNA 進行基因本體論數(shù)據(jù)庫(GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(KEGG)通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 差異表達lncRNA

根據(jù)log2FoldChange≥2 和P<0.01 的標準過濾數(shù)據(jù),利用R對原位和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤樣本進行分類比較,共篩選出39 個差異表達lncRNA,上調(diào)8 個,下調(diào)31 個(見圖1a);31 個差異表達miRNA,上調(diào)13 個,下調(diào)18 個(見圖1b);469 個差異表達mRNA,上調(diào)279 個,下調(diào)190 個(見圖1c)。

2.2 ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

基于線上平臺構(gòu)建的ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 進一步闡明差異表達的lncRNA 的作用。利用miRcode 數(shù)據(jù)庫搜索差異表達的lncRNA 的靶向miRNA, 結(jié)果顯示MIR250HG,SOX21-AS1,WT1-AS,OSTN-AS1,MDS2 有明顯的lncRNA-miRNA 相互關(guān)系,獲得的160 個靶向miRNA 與TCGA 數(shù)據(jù)庫獲得的差異miRNA進行比對, 篩選出7 個差異靶向miRNA, 分別是hsa-miR-150,hsa-miR-205,hsa-miR-129-5p,hsa-miR-141,hsa-miR-203,hsamiR-217,hsa-miR-26。利用Targetscan、miRBD、miRwalk 數(shù)據(jù)庫搜索miRNA 的靶向mRNA,取交集獲得靶向mRNA,再與TCGA數(shù)據(jù)庫獲得的差異mRNA 進行比對, 最終獲得被差異表達的miRNA 所靶向的50 個mRNA, 其ceRNA 網(wǎng)絡(luò)使用Cytoscape3.8.1 軟件構(gòu)建,如圖2 所示。

2.3 差異表達的mRNA 功能注釋及通路分析

通過DAVID 與KOBAS 在線分析軟件對ceRNA 調(diào)控網(wǎng)中miRNA 靶向的50 個差異mRNA 進行GO 分析和KEGG 通路分析。GO 分析發(fā)現(xiàn),生物學過程主要集中在生物調(diào)控,多細胞過程,刺激反應(yīng)過程,細胞組分在細胞膜區(qū)域富集,分子功能集中在蛋白質(zhì)結(jié)合,離子結(jié)合,核酸結(jié)合(見圖3)。KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)其主要集中在Salivary secretion,cAMP signaling pathway 等通路(見表1)。

圖3 ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中差異mRNA 的GO 分析

3 討論

人類癌癥轉(zhuǎn)錄組的全基因組已經(jīng)表明,lncRNA 表達是癌癥中最普遍的轉(zhuǎn)錄變化之一[5]。LncRNA 可通過組蛋白修飾、NDA 甲基化、轉(zhuǎn)錄因子活性調(diào)控、剪切調(diào)控[6]等多種途徑來參與腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。本文通過挖掘TCGA 數(shù)據(jù)庫,得到MIR205HG、SOX21-AS1、WT1-AS、OSTN-AS1、MDS2 五lncRNA。研究顯示SOX21-AS1 的異常表達可促進肺腺癌和乳腺癌的增殖、侵襲、遷移[8];過表達WT1-AS 可抑制細胞增殖,減少細胞遷移和侵襲[9];OSTN-AS1 是一種新的基于ceRNA 網(wǎng)絡(luò)的三陰性乳腺癌免疫相關(guān)預(yù)后標志物[10];受體樣激酶MDS2 促進SUMM2 介導的免疫[11]。

ceRNA 調(diào)控網(wǎng)失調(diào)可以引起癌癥的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。通過ceRNA 調(diào)控網(wǎng)、GO、KEGG 分析發(fā)現(xiàn)lncRNA 與miRNA相互作用,進而調(diào)控差異mRNA 的表達,對信號通路產(chǎn)生影響,最終影響黑色素瘤的發(fā)生,轉(zhuǎn)移及遷徙。