朱雪超，何玉麟，鄔鶯鶯，黎斌，萬天意，唐辛，余秋月

作者單位：南昌大學第一附屬醫(yī)院放射科，南昌 330006

膠質(zhì)瘤是大腦神經(jīng)系統(tǒng)最常見的神經(jīng)上皮腫瘤，其中以膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma，GBM)WHOⅣ級惡性程度最高[1]。在眾多已報道的生物標志物中，組織學分級和Ki-67增殖指數(shù)是兩個重要的生物學行為標志物。Ki-67核抗原與細胞增殖密切相關，它存在于細胞周期的所有活躍期(細胞周期的Gap1期、合成期和Gap2期)和有絲分裂，但在靜止(Gap0)細胞中不存在[2]。Ki-67增殖指數(shù)由Ki-67免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)測定，與膠質(zhì)瘤的組織學惡性程度密切相關[3]，分化差的腫瘤其Ki-67表達水平也相應較高。臨床上，Ki-67增殖指數(shù)對腫瘤的診斷、治療及預后具有指導作用[4]。因此，高精度地術前預測腫瘤Ki-67表達水平有利于準確評估腫瘤生物學行為，為膠質(zhì)瘤患者的精確治療提供幫助[5]。影像組學是指從醫(yī)學圖像中提取和分析大量的人眼無法識別的定量成像特征，既往的研究證明了定量成像特征與醫(yī)學結果之間的預測或預后關系[6-7]。目前通過影像組學模型術前預測膠質(zhì)母細胞瘤Ki-67表達水平的研究較少，因此本研究擬通過T2WI建立預測膠質(zhì)母細胞瘤Ki-67表達水平的影像組學模型。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本回顧性研究經(jīng)南昌大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，免除受試者知情同意。收集我院2016年1月至2020年7月確診為膠質(zhì)母細胞瘤的患者。納入標準：(1)經(jīng)手術病理證實的GBM；(2)術前均在我院行常規(guī)MRI檢查，其中包括軸位T2WI；(3)術后病理學檢查包括Ki-67增殖指數(shù)；(4)磁共振圖像無明顯干擾分析的偽影；(5)患者術前無放化療史。

最終納入GBM患者96例，參考Beesley等[8]的研究將Ki-67表達水平根據(jù)陽性率分為4級：0～4%為0級，5%～24%為1級，25%～49%為2級，50%以上為3級。本研究根據(jù)Ki-67表達水平分為低表達組(0～2級，Ki-67表達水平＜50)和高表達組(3級，Ki-67表達水平≥50)，其中低表達組中0～4% 0例；5%～24% 25例；25%～49% 32例，具體分組見表1。

表1 患者臨床信息

1.2 檢查方法

所有患者軸位T2WI均在我院采集，具體設備及參數(shù)：德國Siemens Avanto 1.5 T磁共振掃描儀，掃描參數(shù)：TR 4200 ms，TE 109 ms，層厚5 mm，層間距1.5 mm，矩陣384×241，F(xiàn)OV 23 cm×23 cm；德國Siemens Trio Tim 3.0 T磁共振掃描儀，掃描參數(shù)：TR 4000 ms，TE 113 ms，層厚5 mm，層間距1.5 mm，矩陣256×256，F(xiàn)OV 22 cm×22 cm；德國Siemens Skyra(DE)3.0 T磁共振掃描儀，掃描參數(shù)：TR 4000 ms，TE 120 ms，層厚5 mm，層間距1.5 mm，矩陣384×384，F(xiàn)OV 24 cm×24 cm；美國GE Optima MR360 1.5 T磁共振掃描儀，掃描參數(shù)：TR 3800 ms，TE 100 ms，層厚5 mm，層間距1.5 mm，矩陣256×256，F(xiàn)OV 24 cm×24 cm。

1.3 機器學習模型構建

1.3.1 圖像分割和特征提取

本研究選取T2WI軸位圖像進行感興趣區(qū)(region of interest，ROI)勾畫，由1名經(jīng)驗豐富的放射科醫(yī)生使用開源的ITK-SNAP 3.8.0 (www.itksnap.org)軟件對圖像進行處理，在每個層面沿病灶邊緣人工勾畫二維ROI，得到感興趣體積(volume of interest，VOI)(圖1)，另一名高年資影像醫(yī)師檢查勾畫結果，遇到意見不一致的情況需經(jīng)二者協(xié)商，直到他們就每個軸向T2WI上瘤體區(qū)域達成一致，最后將得到的VOI圖像以nii.gz格式保存，以進行后續(xù)處理。

圖1 ITK-SNAP軟件對瘤體進行圖像分割圖2 63個特征的最小絕對收縮與選擇算子系數(shù)曲線，在最佳lambda時選定的7個系數(shù)不為0的特征圖3 基于T2WI篩選出的不同特征及其權重 圖4 基于T2WI的三種機器學習模型ROC曲線

在提取特征前，對所有圖像進行預處理，預處理包括圖像歸一化、重采樣和偏置場校正：灰度歸一化使所有MRI圖像像素的灰度值分布在0～255，避免因圖像對比度不足或像素亮度分布不平衡而對后續(xù)圖像處理的影響，將不同的掃描設備和參數(shù)造成的差異最小化，此外將所有患者的MRI圖像重新采樣為1 mm×1 mm×1 mm的均勻體素大小，以進行后續(xù)圖像處理；由于掃描儀本身以及掃描過程中的偏差等因素可導致MRI上的亮度存在差異，因此通過偏置場校正盡量減少由于不同掃描機器磁場的變化導致的強度不均勻性。

影像組學特征的提取通過Python的pyradiomics模塊實現(xiàn)，提取出的特征包括形態(tài)學特征、紋理參數(shù)和小波變換特征，紋理參數(shù)包括：一階特征、灰度共生矩陣參數(shù)、灰度游程長度矩陣參數(shù)、灰度尺寸區(qū)域矩陣、灰度依賴性矩陣參數(shù)。共計提取出806個影像組學參數(shù)，包括4個特征組：14個形態(tài)學特征、18個一階特征、70個高階特征和704個小波特征，小波變換特征為原始圖像進行8個方向的小波變換后(在三個維度中的每一個中應用高通或低通濾波器的所有可能組合)，對除形態(tài)學特征以外(形態(tài)特征只能在原始圖像提取)的特征重新提取，對腫瘤進行多維全面的量化，重新提取的特征參數(shù)與原始圖像提取的特征類別相同。

特征定義和計算算法可在PyRadiomics官網(wǎng)中找到(https://pyradiomics.readthedocs.io/en/latest/features.html)。

1.3.2 影像組學特征的篩選

所有數(shù)據(jù)按照70%∶30%的比例分為訓練組和測試組，訓練組用來進行特征篩選和建立影像組學模型，測試組的數(shù)據(jù)用來對建立的模型進行驗證。

特征篩選過程：將獲得自T2WI的所有影像組學特征導入Python 3.8軟件中，首先對數(shù)據(jù)組進行標記，Ki-67低表達組標記為“0”，高表達組標記為“1”，并對數(shù)據(jù)集中所有的特征變量進行標準化處理，然后通過t檢驗剔除兩組參數(shù)間差異無統(tǒng)計學意義的參數(shù)，最后通過最小絕對收縮與選擇算子(least absolute shrinkage and selection operator，LASSO)進行進一步的篩選。

1.3.3 影像組學模型訓練及驗證

影像組學模型的建立通過Python(3.8.0)和機器學習庫scikit-learn(23.0)實現(xiàn)，通過特征篩選后訓練組的數(shù)據(jù)分別對隨機森林(random forest，RF)、Logistic回歸和支持向量機(support vector machine，SVM)三種常用的機器學習算法進行訓練并建立相應的影像組學模型，測試組的數(shù)據(jù)用于對訓練好的模型進行驗證，最后的結果以準確度、敏感度、特異度、AUC表示。

1.3.4 統(tǒng)計學方法

臨床資料的統(tǒng)計學分析采用SPSS 24.0軟件，計量資料以(±s)表示，通過Kolmogorov-Smirnov test檢驗數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，組間比較采用t檢驗或Mann-Whitney檢驗，分類資料采用χ2檢驗。在所有統(tǒng)計結果中，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

ROC曲線分析評估影像組學模型的診斷效能，以準確度、敏感度、特異度和AUC值表示。0.5≤AUC值＜0.7時模型診斷價值較低，0.7≤AUC值＜0.9時模型診斷價值中等，AUC值≥0.9時模型診斷價值較高。

2 結果

2.1 一般臨床資料統(tǒng)計學分析

Ki-67低表達組和高表達組的年齡、性別差異均無統(tǒng)計學意義。

2.2 特征篩選結果

通過t檢驗共篩選出63個特征，進一步通過LASSO回歸篩選出7個特征(圖2)，經(jīng)過特征篩選后得到的7個特征包括一階特征2個，灰度共生矩陣(gray-level co-occurrence matrix，GLCM)特征1個，灰度相關矩陣(gray level dependence matrix，GLDM)特征3個，灰度區(qū)域大小矩陣(gray-level size zone matrix，GLSZM)特征1個，具體特征名、特征權重見圖3。wavelet-LHL_firstorder_InterquartileRange代表原始圖像經(jīng)過小波變換提取的一階特征中的InterquartileRange特征。

2.3 不同影像組學模型的診斷效能

三種影像組學模型的準確度、敏感度、特異度與AUC，具體數(shù)值見表2，繪制的ROC曲線見圖4。

表2 機器學習ROC分析結果Tab.2 ROC analysis of machine learning methods

3 討論

3.1 影像組學模型預測腫瘤Ki-67表達水平的依據(jù)

Ki-67是一種細胞增殖的生物標志物，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的常規(guī)分級和預后分析中應用廣泛[9]，隨著膠質(zhì)瘤分級的增高，Ki-67表達水平也明顯升高[10]，多項研究證實，不同Ki-67增殖指數(shù)表達水平的腫瘤在細胞增殖、細胞分化、亞克隆區(qū)組成等方面存在顯著差異[11-13]，這些差異隱含在醫(yī)學圖像中人眼無法識別的圖像紋理特征(如像素值、灰度和復雜性等)中。

自2012年影像組學的概念提出以來，高通量紋理分析作為一種新技術被應用到腫瘤診斷的研究中，既往的研究顯示了影像組學在預測不同類型腫瘤Ki-67表達水平的良好應用前景，Liang等[14]分別通過T2WI和增強掃描圖像建立預測乳腺癌Ki-67表達水平的影像組學模型，結果T2WI影像組學模型對Ki-67表達水平顯示出良好的識別力，AUC為0.74；Gu等[15]通過CT圖像建立了6種影像組學模型對非小細胞肺癌Ki-67表達水平進行預測，其中RF模型效能最高，AUC為0.78；Wu等[16]研究了CT圖像影像組學特征評估肝細胞癌Ki-67表達水平的能力，AUC為0.78～0.84。

3.2 研究結果分析

本研究基于T2WI建立了三種影像組學模型對膠質(zhì)母細胞瘤Ki-67表達水平進行預測，最后結果顯示RF模型的診斷能力最好，準確度、敏感度和AUC均最高，但整體診斷效能仍屬于中等；Logistic回歸模型的診斷效能在三種模型中最低，SVM模型的診斷效能介于RF和Logistic回歸之間；在本研究建立的不同類型的機器學習分類器中，不同的分類器表現(xiàn)出不同的預測性能，AUC在0.63～0.72之間，說明分類器模型類型的選擇對結果有影響。其中，RF分類器在準確度、特異度和AUC方面優(yōu)于其他類型的分類器。從方法論的角度看，RF是一組決策樹，決策樹的機制可以利用不同的特征進行補償，多個弱樹分類器可以組合成強分類器。因此，一組決策樹即使基于弱特征集也能產(chǎn)生很好的分類結果[15]。其他的一些研究[15，17-18]也表明，RF模型的性能優(yōu)于其他分類器，這與我們的結果是一致的。Logistic回歸是機器學習中常用的經(jīng)典分類方法之一，主要用于解決分類問題，結果容易受數(shù)據(jù)質(zhì)量的影響[19]，在本項研究中，診斷效能不及另外兩種模型，但其結果的可解釋性較好，因此也有一定的臨床應用價值。SVM是一種強大和有效的機器學習分類器，主要應用于神經(jīng)成像和分子生物學領域，在小樣本情況的機器學習問題中應用較廣泛，在劉哲等[19]鑒別膠質(zhì)瘤和腦轉(zhuǎn)移瘤的研究中，SVM模型的效果優(yōu)于Logistic回歸和樸素貝葉斯，但Ma等[20]在乳腺癌預測Ki-67表達水平的研究中，樸素貝葉斯模型優(yōu)于SVM模型，這可能與不同腫瘤的生物學行為及數(shù)據(jù)的選取有關。

3.3 本研究的臨床價值

3.3.1 無創(chuàng)性手段避免了臨床活檢

Ki-67表達水平對腫瘤的診斷、治療及預后具有重要指導作用，目前Ki-67指標的獲取依賴組織病理活檢，反復活檢不僅有創(chuàng)而且容易產(chǎn)生抽樣誤差，通過組學模型預測Ki-67表達水平彌補了傳統(tǒng)病理活檢有創(chuàng)性、存在抽樣誤差和臨床難以獲得滿意數(shù)據(jù)等局限性，同時可以作為腫瘤的長期隨訪手段為腫瘤的診治提供指導，雖然本研究中基于T2WI建立的影像組學模型的診斷效能中等，但提示了該方法的可行性，同時本研究也顯示了通過不同的機器學習模型構建的影像組學模型診斷效能的差異，之后通過其他機器學習方法，如神經(jīng)網(wǎng)絡等深度學習方法結合大樣本有可能得到更加有價值的結果，為無創(chuàng)性評估膠質(zhì)母細胞瘤患者Ki-67表達水平提供一種穩(wěn)定、可行的方法。

3.3.2 符合臨床實際需求

(1)本研究選擇了T2WI進行特征提取，T2WI作為常規(guī)MRI掃描序列廣泛應用中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的診斷中，避免了部分腎功能不全和過敏體質(zhì)患者使用增強掃描的限制，同時也方便部分缺少功能MRI掃描序列的醫(yī)療機構的應用。(2)T2WI對腫瘤內(nèi)部的壞死、囊變等更為敏感，有研究顯示T2WI可在一定程度上反映腫瘤的惡性程度，Schieda等[21]發(fā)現(xiàn)T2WI信號增強提示前列腺癌級別較高，此外，Jha等[22]的一項研究發(fā)現(xiàn)T2WI上信號強度的增強與肝細胞癌生長的增加有關，這可能預示著更具侵襲性的腫瘤生物學行為。(3)實際工作中，患者的檢查圖像大多由不同機器采集，因此本研究收集了不同掃描機器的MR圖像，通過偏置場校正、重采樣等預處理，提高了結果的泛化性。

3.4 本研究的局限性和未來研究方向

除回顧性研究的局限性以外，還有以下幾點不足：(1)目前多中心合作的驗證發(fā)展尚不完善，因此本研究缺少多中心對照試驗。(2)未對ROI的勾畫進行一致性檢驗，但勾畫結果由另一名高年資醫(yī)生進行了復核。(3)本次研究僅包含膠質(zhì)母細胞瘤，未對其他病理類型的膠質(zhì)瘤進行研究。未來研究方向：探究對不同級別的膠質(zhì)瘤Ki-67表達水平預測的可行性，以及對其他生物標志物的預測；此外，增加樣本量和外部驗證以提高結果的可信度也是未來研究的方向。

綜上所述，本次研究中雖然基于T2WI的影像組學模型對Ki-67表達水平預測效率中等，但與其他常規(guī)或功能性MRI序列相結合，可能會為評估腫瘤的增殖行為提供有價值的幫助。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。