牛德云，李吉玲

(1.云南警官學(xué)院，云南 昆明 650233；2.昆明市第一人民醫(yī)院，云南 昆明 650034)

1 引言

滇重樓主要分布于云貴川三省，而盛產(chǎn)于云南，生長(zhǎng)在海拔較高的山區(qū)闊葉林、坡地、松林中。滇重樓自古以來(lái)就是民間重要的草藥，也是著名中成藥云南白藥、宮血寧膠囊等藥品的主要原料[1,2]。近年來(lái)，隨著新型中成藥市場(chǎng)的開(kāi)拓，對(duì)重樓原材料的需求量逐年劇增，傳統(tǒng)重樓種植已經(jīng)滿(mǎn)足不了市場(chǎng)的需求。研究者們另辟蹊徑，轉(zhuǎn)為研究重樓內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物來(lái)應(yīng)對(duì)中藥材資源短缺的問(wèn)題，滇重樓內(nèi)生菌分為內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌，這些內(nèi)生菌通過(guò)寄生的方式產(chǎn)生各類(lèi)活性成分，如抑制其他微生物活性、抗腫瘤細(xì)胞活性等作用[3]。另外，滇重樓內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物對(duì)抑菌、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗細(xì)胞毒素有一定作用，臨床上還嘗試用于治療部分腫瘤，具有顯著的療效[4,5]。

目前對(duì)滇重樓內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的研究居多，通過(guò)研究其代謝產(chǎn)物，分離鑒定出大批活性物質(zhì)，其中口山酮類(lèi)化合物是其中的一種，課題組前期對(duì)一株滇重樓內(nèi)生真菌(與本研究所選菌株YNCY0884屬同一批次分離鑒定所得)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，分離得到多個(gè)口山酮類(lèi)化合物，這些化合物在本次所選菌株的代謝產(chǎn)物中也出現(xiàn)，說(shuō)明同一植物的不同內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物有一定的相似性。

本文旨在發(fā)現(xiàn)滇重樓內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中口山酮類(lèi)化合物，對(duì)比前期研究過(guò)的同一批次分離所得的菌株代謝產(chǎn)物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者代謝產(chǎn)物中均存在口山酮類(lèi)化合物，前期對(duì)口山酮類(lèi)新化合物做細(xì)胞毒活性檢測(cè)，結(jié)果表明該類(lèi)物質(zhì)具有良好的活性。鑒于此，為進(jìn)一步深入研究該類(lèi)物質(zhì)，挖掘其背后的藥用信息，本研究有針對(duì)性的開(kāi)展分離工作，初步分離便獲得目標(biāo)化合物，預(yù)計(jì)下一步的分離中會(huì)發(fā)現(xiàn)新穎口山酮類(lèi)化合物。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

紫外分光光度計(jì) (Spectrumlab 24)，紅外分光光度計(jì) (Bio-Rad FTS-135)，旋光儀 (JASCO DIP-370)，半制備高效液相色 (Agilent-1200)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (EYELA-N-1100D)，核磁共振儀 (Bruker AM-500)，質(zhì)譜儀(VG AUTO Spec-3000)，半制備色譜柱 (Venusil XBP-C18) ，LDZX-40B1型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋，隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海恒科學(xué)儀器有限公司)，LRH-150-G光照培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠)，LRH-250-G光照培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠)，ZHWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智成分析儀器制造有限公司)，恒溫?fù)u床，超凈工作臺(tái)，500 mL罐裝瓶, 電子天平。

2.2 材料

菌株經(jīng)鑒定為滇重樓內(nèi)生真菌，菌株編號(hào)為YNCY0884。菌株篩選完成后進(jìn)行培養(yǎng)，然后進(jìn)行放大發(fā)酵。

2.3 提取和分離

固體發(fā)酵產(chǎn)物收集于50 L工業(yè)塑料桶中，用大于提取物2.5倍質(zhì)量的工業(yè)乙醇浸泡3～5 d，超聲處理3次，濃縮除去乙醇，共提取3次，合并提取液并濃縮；所得濃縮產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯相減壓濃縮得到浸膏。所得浸膏520g，浸膏用甲醇溶解后用硅膠拌樣，樣品裝填大型硅膠(100-200目)柱層析初分劃段，用不同比例的氯仿-甲醇流動(dòng)相分為6個(gè)極性段 20∶1(Ⅰ)、9∶1(Ⅱ)、4∶1(Ⅲ)、7∶3(Ⅳ)、3∶2(Ⅴ)、1∶1(Ⅵ))。

用前期分離完成的一個(gè)菌株的目標(biāo)單體化合物為對(duì)照，經(jīng)TLC監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)口山酮化合物主要分布于Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ三個(gè)組分。選?、?、Ⅳ組分分別經(jīng)甲醇溶解，采用0.45 μm 微孔過(guò)濾膜過(guò)濾后，用C18反相柱，以 60% (乙腈：水)作流動(dòng)相，流速為 3 mL/min分別劃分為6段和4段。用半制備高效液相對(duì)劃分后的Ⅱ、Ⅳ段組分進(jìn)行細(xì)分、純化得到化合物1(15.2 mg)、化合物2(10.4 mg)、化合物3(9.6 mg)、化合物4(20.4 mg)、化合物5(7.6 mg)、化合物6(14.8 mg)、化合物7(17.1 mg)、化合物8(6.7 mg)、化合物9(9.8 mg)、化合物10(25.4 mg)、化合物11(10.3 mg)、化合物12(19.6 mg)。

3 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1,C18H16O8；黃色膠體;ESIMS m/z(positive ion mode)383 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm:6.69(1H,s,h-2),7.28(1H,d,J=8.8 Hz,H-6),7.70(1H,d,J=8.8 Hz,H-7),2.58(2H,t,J=7.2 Hz,H-1′),3.64(2H,t,J=7.2 Hz,H-2′),3.82(3H,s,1-OMe),4.12(3H,s,3′-OMe),12.29(1H,s,Ar-OH-4),12.67(1H,s,Ar-OH-5);13C NMR data (C5D5N,125 MHz)δppm: 154.0(s,C-1),107.0(d,C-2),140.0(s,C-3),140.2(s,C-4),156.8(s,C-5),120.9(d,C-6),124.9(d,C-7),127.0(s,C-8),182.0(s,C-9),146.3(s,C-4a),120.3(s,C-8a),110.0(s,C-9a),148.5(s,C-10a),37.3(t,C-1′),64.0(t,C-2′),170.0(s,C-3′),60.0(s,1-OMe),52.2(q,3′-OMe).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為4,5-二羥基-3-羥乙基-1-甲氧基-8-甲酯基口山酮。

化合物2,C16H14O6; 黃色膠體; ESIMS m/z (positive ion mode) 325 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.39(1H,d,J=8.3 Hz,H-6),6.90(1H,d,J=8.3 Hz,H-5),6.62(1H,d,J=8.3 Hz,H-7),6.65(1H,s,H-2),3.54(2H,t,J=7.2 Hz,H-2′),2.60(2H,t,J=7.2 Hz,H-1′),3.96(3H,s,1-OMe),13.75(1H,s,Ar-OH-8),12.68(1H,s,Ar-OH-1);13C NMR data (C5D5N,125 MHz)δ ppm: 163.2(s,C-1),99.4(d,C-2),161.5(s,C-3),109.8(s,C-4),110.9(d,C-5),137.2(d,C-6),107.5(d,C-7),162.9(s,C-8),181.8(s,C-9),155.8(s,C-4a),108.7(s,C-8a),104.6(s,C-9a),158.3(s,C-10a),34.8(t,C-1′),64.5(t,C-2′),56.2(s,1-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為1,8-二羥基-4-羥乙基-3-甲氧基口山酮。

化合物3,C17H14O7;黃色膠體；ESIMS m/z (positive ion mode) 353 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.57(1H,d,J=8.2 Hz,H-7),7.55(1H,d,J=8.2 Hz,H-8),7.32(1H,d,J=1.8 Hz,H-4),7.21(1H,d,J=1.8 Hz,H-2),3.75(2H,t,J=7.2 Hz,H-2′),2.45(2H,t,J=7.2 Hz,H-1′),4.27(3H,s,3′-OMe),12.46(1H,s,Ar-OH-5),12.46(1H,s,Ar-OH-1);13C NMR data (C5D5N,125 MHz)δ ppm: 164.2(s,C-1),107.5(d,C-2),148.6(s,C-3),104.5(d,C-4),155.0(s,C-5),120.0(s,C-6),125.4(d,C-7),120.8(d,C-8),181.8(s,C-9),156.2(s,C-4a),124.4(s,C-8a),118.3(s,C-9a),152.6(s,C-10a),36.4(t,C-1′),63.6(t,C-2′),168.2(s,C-3′),52.4(s,3′-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為1,5-二羥基-3-羥乙基-6-甲酯基口山酮。

化合物4,C18H16O7；黃色膠體,ESIMS m/z367.0802[M+Na]+(calcdC18H16NaO7for367.0794);1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.72(1H,d,J=8.2 Hz,H-7),7.63(1H,d,J=8.2 Hz,H-8),7.46(1H,d,J=1.8 Hz,H-4),7.53(1H,d,J=1.8 Hz,H-2),3.82(2H,t,J=7.2 Hz,H-2′),2.67(2H,t,J=7.2 Hz,H-1′),4.23(3H,s,3′-OMe),3.75(3H,s,1-OMe),12.75(1H,s,Ar-OH-5);13C NMR data(C5D5N,125 MHz)δppm: 164.1(s,C-1),107.0(d,C-2),148.5(s,C-3),104.2(d,C-4),154.7(s,C-5),119.0(s,C-6),126.0(d,C-7),120.0(d,C-8),182.8(s,C-9),155.4(s,C-4a),124.6(s,C-8a),118.0(s,C-9a),152.8(s,C-10a),36.0(t,C-1′),63.8(t,C-2′),168.0(s,C-3′),56.0(q,1-OMe),52.8(q,3′-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為1-羥基-5-甲氧基-3-羥乙基-6-甲酯基口山酮。

化合物5,C17H14O6；黃色膠體,ESIMS m/z (positive ion mode) 337 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.84(1H,d,J=8.2 Hz,H-7),7.62(1H,t,J=8.2 Hz,H-6),7.39(1H,d,J=8.2 Hz,H-5),7.22(1H,d,J=1.8 Hz,H-4),7.09(1H,d,J=1.8 Hz,H-2),3.69(2H,t,J=7.2 Hz,H-2′),2.68(2H,t,J=7.2 Hz,H-1′),4.14(3H,s,3′-OMe),12.41(1H,s,Ar-OH-5);13C NMR data(C5D5N,125 MHz)δppm: 161.9(s,C-1),109.5(d,C-2),148.7(s,C-3),104.4(d,C-4),119.5(d,C-5),130.6(d,C-6),122.7(d,C-7),134.6(s,C-8),181.9(s,C-9),156.8(s,C-4a),117.9(s,C-8a),109.0(s,C-9a),154.9(s,C-10a),36.7(t,C-1′),64.2(t,C-2′),170.3(s,C-3′),53.4(q,3′-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為1-羥基-3-羥乙基-8-甲酯基口山酮。

化合物6,C18H14O6；黃色膠體; ESIMS m/z (positive ion mode) 365 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.51(1H,d,J=8.2 Hz,H-7),7.39(1H,d,J=8.2 Hz,H-8),7.00(1H,d,J=2.2 Hz,H-4),6.98(1H,d,J=2.2 Hz,H-2),1.38(3H,s,H-3′),2.47(2H,s,H-1′),4.43(3H,s,4′-OMe),12.62(1H,s,Ar-OH-5),12.09(1H,s,Ar-OH-1);13C NMR data (C5D5N,125 MHz)δppm: 163.8(s,C-1),108.8(d,C-2),144.5(s,C-3),106.2(d,C-4),155.0(s,C-5),119.0(s,C-6),126.4(d,C-7),120.0(d,C-8),182.0(s,C-9),156.6(s,C-4a),125.0(s,C-8a),119.0(s,C-9a),152.0(s,C-10a),49.0(t,C-1′),205.9(s,C-2′),30.4(q,C-3′),169.2(s,C-4′),52.1(q,4′-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為1,5-二羥基-3-乙酸甲酯基-6-甲酯基口山酮。

化合物7,C18H14O6; 黃色膠體; ESIMS m/z (positive ion mode) 353[M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.69(1H,d,J=8.2 Hz,H-7),7.56(1H,t,J=8.2 Hz,H-6),7.43(1H,d,J=8.2 Hz,H-5),7.09(1H,d,J=2.2 Hz,H-4),6.89(1H,d,J=2.2 Hz,H-2),2.24(2H,s,H-1′),1.46(3H,s,H-3′),4.24(3H,q,4′-OMe),12.36(1H,s,Ar-OH-1);13C NMR data(C5D5N,125 MHz)δppm: 163.0(s,C-1),110.2(d,C-2),144.1(s,C-3),105.9(d,C-4),120.2(d,C-5),130.1(d,C-6),122.0(d,C-7),133.9(s,C-8),180.0(s,C-9),157.0(s,C-4a),116.9(s,C-8a),108.1(s,C-9a),155.0(s,C-10a),50.1(t,C-1′),206.0(s,C-2′),30.5(q,C-3′),170.2(s,C-4′),53.0(q,4′-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為1-羥基-3-乙酸甲酯基-8-甲酯基口山酮。

化合物8,C18H18O9;黃色膠體,ESIMS (positive ion mode):m/z401 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.33(1H,d,J=8.8 Hz,H-6),6.62(1H,d,J=8.8 Hz,H-7),6.42(1H,s,H-2),4.53(1H,m,H-2′),4.20,4.30(2H,m,H-4′),3.91(1H,m,H-1′),3.39,3.42(2H,m,H-3′),3.89(3H,s,OMe-3);13C NMR data(C5D5N,125 MHz)δppm: 155.4(s,C-1),100.1(d,C-2),160.2(s,C-3),130.0(s,C-4),123.1(s,C-5),135.0(d,C-6),110.1(d,C-7),161.9(s,C-8),181.9(s,C-9),153.1(s,C-4a),109.8(s,C-8a),106.1(s,C-9a),155.0(s,C-10a),43.1(d,C-1′),73.5(d,C-2′),69.3(t,C-3′),63.5(t,C-4′),56.4(q,OMe-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為1,4,8-三羥基-3-甲氧基-5-丁三醇基口山酮。

化合物9,C18H18O9；黃色膠體,ESIMS (positive ion mode):m/z401 [M+Na]+;1HNMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.52(1H,d,J=8.8 Hz,H-6),6.95(1H,d,J=8.8 Hz,H-7),6.53(1H,s,H-2),4.84(1H,m,H-2′),4.19,4.36(2H,m,H-4′),4.20(1H,m,H-1′),3.46,3.51(2H,m,H-3′),3.83(3H,s,OMe-3),14.27(1H,s,Ar-OH-4),13.94(1H,s,Ar-OH-1),13.73(1H,s,Ar-OH-3);13CNMR data(C5D5N,125 MHz)δppm: 156.2(s,C-1),101.2(d,C-2),157.3(s,C-3),131.2(s,C-4),121.0(s,C-5),135.0(d,C-6),106.9(d,C-7),166.2(s,C-8),182.1(s,C-9),153.2(s,C-4a),111.2(s,C-8a),106.1(s,C-9a),156.2(s,C-10a),42.3(d,C-1′),73.1(d,C-2′),66.2(t,C-3′),61.0(t,C-4′),60.9(q,OMe-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為1,3,4-三羥基-8-甲氧基-5-丁三醇基口山酮。

化合物10,C20H20O9; 黃色膠體; ESIMS m/z (positive ion mode) 427 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 6.89(1H,s,H-4),6.76(1H,s,H-5),6.72(1H,s,H-7),6.64(1H,s,H-2),5.13(1H,m,H-2′),4.54,4.59(2H,m,H-3′),4.40(1H,m,H-1′),4.10,4.21(2H,m,H-4′),3.78(3H,s,OMe-1),4.3(3H,s,OMe-5′),12.79(1H,s,Ar-OH-6);13CNMR data(C5D5N,125 MHz)δppm: 163.8(s,C-1),109.0(d,C-2),150.2(s,C-3),104.4(d,C-4),103.8(d,C-5),165.6(s,C-6),114.1(d,C-7),137.5(s,C-8),182.4(s,C-9),156.4(s,C-4a),110.2(s,C-8a),108.2(s,C-9a),159.1(s,C-10a),42.8(d,C-1′),72.9(d,C-2′),67.1(t,C-3′),63.4(t,C-4′),170.2(s,C-5′),56.3(q,OMe-1),53.0(q,OMe-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為6-羥基-1-甲氧基-8-甲酯基-3-丁三醇基口山酮。

化合物11,C21H22O10;黃色膠體; ESIMS m/z (positive ion mode) 457 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.32(1H,s,H-7),6.98(1H,s,H-4),6.54(1H,s,H-2),5.26(1H,m,H-2′),4.74,4.82(2H,m,H-3′),4.53(1H,m,H-1′),4.21,4.26(2H,m,H-4′),3.80(3H,s,OMe-1),4.2(3H,s,OMe-5′),3.84(3H,s,OMe-6),3.76(3H,s,OMe-5),13.4(1H,s,Ar-OH-1);13CNMR data (C5D5N,125 MHz)δppm: 162.2(s,C-1),107.9(d,C-2),148.6(s,C-3),105.8(d,C-4),147.2(s,C-5),152.5(s,C-6),106.4(d,C-7),130.5(s,C-8),182.5(s,C-9),155.2(s,C-4a),111.0(s,C-8a),108.0(s,C-9a),145.5(s,C-10a),42.9(d,C-1′),72.5(d,C-2′),66.2(t,C-3′),63.4(t,C-4′),171.1(s,C-5′),61.0(q,OMe-5),56.5(q,OMe-6),52.8(q,OMe-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為1-羥基-5,6-二甲氧基-8-甲酯基-3-丁三醇基口山酮。

化合物12,C21H22O10;黃色膠體; ESIMS m/z (positive ion mode) 457 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.76(1H,d,J=8.8,H-7),7.44(1H,d,J=8.8,H-6),6.82(1H,s,H-2),5.31(1H,m,H-2′),4.64,4.78(2H,m,H-3′),4.39(1H,m,H-1′),4.26,4.18(2H,m,H-4′),3.71(3H,s,OMe-1),3.82(3H,s,OMe-4),4.52(3H,s,OMe-5′),13.17(1H,s,Ar-OH-5);13CNMR data (C5D5N,125 MHz)δppm: 155.0(s,C-1),106.4(d,C-2),130.1(s,C-3),145.2(s,C-4),155.0(s,C-5),122.0(d,C-6),125.3(d,C-7),126.0(s,C-8),182.1(s,C-9),147.1(s,C-4a),120.0(s,C-8a),108.2(s,C-9a),148.0(s,C-10a),41.5(d,C-1′),72.8(d,C-2′),66.0(t,C-3′),62.0(t,C-4′),170.1(s,C-5′),56.0(q,OMe-1),61.5(q,OMe-4),53.2(q,OMe-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為5-羥基-1,4-二甲氧基-8-甲酯基-3-丁三醇基口山酮。

4 結(jié)果與討論

(1)從滇重樓內(nèi)生真菌YNCY0884菌株分離得到12個(gè)口山酮類(lèi)化合物，分別為：4,5-二羥基-3-羥乙基-1-甲氧基-8-甲酯基口山酮、1,8-二羥基-4-羥乙基-3-甲氧基口山酮、1,5-二羥基-3-羥乙基-6-甲酯基口山酮、1-羥基-5-甲氧基-3-羥乙基-6-甲酯基口山酮、1-羥基-3-羥乙基-8-甲酯基口山酮、1,5-二羥基-3-乙酸甲酯基-6-甲酯基

口山酮、1-羥基-3-乙酸甲酯基-8-甲酯基口山酮、1,4,8-三羥基-3-甲氧基-5-丁三醇基口山酮、1,3,4-三羥基-8-甲氧基-5-丁三醇基口山酮、6-羥基-1-甲氧基-8-甲酯基-3-丁三醇基口山酮、1-羥基-5,6-二甲氧基-8-甲酯基-3-丁三醇基口山酮、5-羥基-1,4-二甲氧基-8-甲酯基-3-丁三醇基口山酮。

(2)從化合物鑒定結(jié)果可知滇重樓內(nèi)生真菌不同菌株中含有相同代謝產(chǎn)物，這可能跟寄生同一宿主有關(guān)，相同的宿主植物能為內(nèi)生菌提供相同的生存環(huán)境。

(3)本實(shí)驗(yàn)采取固體發(fā)酵，固體發(fā)酵具有發(fā)酵周期短，代謝物常量高，發(fā)酵成本低、易操作等特點(diǎn)。