胡澤斌，孫彬裕，劉湘，蘭更欣，孫晶，于婷，黃杰

1. 中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所，北京 100050；2. 北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司，北京 101111

目前，人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）分型技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域，如造血干細(xì)胞捐獻者建庫、HLA 群體遺傳多態(tài)性、HLA 生物學(xué)功能、實體器官和造血干細(xì)胞移植供受者組織相容性配型等［1-3］。HLA 基因配型可直接判別供受者之間的相容性，在DNA 水平上區(qū)分同源異源性。對于實體器官及造血干細(xì)胞移植，供受者雙方的HLA基因型匹配程度顯著影響移植受體的長期存活率，匹配程度越高，長期存活率越高，HLA 基因型主要是指HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 5 個位點［4-5］。腎臟、肝臟等實體器官移植對HLA 基因型匹配程度要求低于造血干細(xì)胞移植，因此，一般可使用低中分辨率的HLA 基因分型檢測試劑；骨髓移植或造血干細(xì)胞移植必須采用高分辨的HLA 分型檢測，避免發(fā)生嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)，導(dǎo)致移植失?。?-7］。近年，中華骨髓庫正在積極倡導(dǎo)高分入庫，即對HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 等5 個基因座位進行4 位高分辨率分型檢測，以期從根本上提高HLA 配型效率。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是具有準(zhǔn)確量值的測量標(biāo)準(zhǔn)，其定值是對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值賦值的過程［8］。測定特性值有許多有效技術(shù)途徑［9］，包括通過一個或多個實驗室采用一種或多種方法進行測量。具體選擇的方法取決于該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的類型、預(yù)期用途、參加實驗室的資質(zhì)、所用方法的質(zhì)量及評估特性值的試劑能力。中國食品藥品檢定研究院研制的HLA 組織配型基因分型國家參考品為定性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，本研究采用多家具有良好資質(zhì)的實驗室通過PCR-SSO 法、PCR-SBT 測序法、NGS 測序法進行協(xié)作標(biāo)定的方式對其進行定值，其中PCR-SBT 測序方法是目前世界衛(wèi)生組織推薦的HLA 分型方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

1 材料與方法

1. 1 參考品 HLA 組織配型基因分型國家參考品（編號1 ～38）由中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所提供。

1. 2 主要試劑 One Lambda-All Type NGS 11 位點擴增試劑（NGS 測序法）、One Lambda-SeCore A、B、C、DQB1、DRB1 Locus Sequencing Kit（PCR-SBT 測序法）由賽默飛世爾科技（中國）有限公司提供；HLA-A、B、C、DQB1、DRB1 位點基因高分辨分型試劑盒（PCR-SBT 測序法）由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司提供；Lifecodes A、B、C、DQB1、DRB1 typing kit（PCR-SSO 法）由北京博富瑞基因診斷技術(shù)有限公司提供；HLA-A、B、C、DQB1、DRB1 核酸分型檢測試劑盒（PCR-SBT 法）由德必碁生物科技（廈門）有限公司提供；國際HLA 質(zhì)控盤IHWG-SP Reference Pannel由中國食品藥品檢定研究院提供。

1. 3 HLA 組織配型基因分型國家參考品協(xié)作標(biāo)定方法 選擇德必碁生物科技（廈門）有限公司、賽默飛世爾科技（中國）有限公司、北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司、北京博富瑞基因診斷技術(shù)有限公司4家實驗室進行協(xié)作標(biāo)定。每家實驗室分發(fā)3 套HLA組織配型基因分型國家參考品，干冰運輸，2 ～8 ℃保存在5 d 內(nèi)進行檢測，-20 ℃保存在15 d 內(nèi)進行檢測。各試驗均采用各自的HLA 分型檢測試劑檢測，在各自的檢測平臺上進行獨立數(shù)據(jù)分析。共檢測38 支國家參考品，PCR-SBT 測序法和NGS 測序法對每個樣本測定1 次，PCR-SSO 法對每個樣本測定3 次。

1. 4 HLA 組織配型基因分型國家參考品協(xié)作標(biāo)定的實驗質(zhì)量控制 將國際組織相容性工作組的HLA 質(zhì)控盤（IHWG-SP Reference Pannel）干冰運輸至北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司，采用PCR-SBT測序法同步檢測HLA 組織配型基因分型國家參考品和IHWG-SP Reference Pannel 的51 個樣本，作為實驗的質(zhì)量控制。

2 結(jié) 果

2. 1 協(xié)作標(biāo)定實驗 4 家協(xié)作單位分別檢測38 支HLA 組織配型基因分型國家參考品樣本，HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 5 個位點均全部檢出。北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司PCR-SBT 測序法分型結(jié)果見表1，德必碁生物科技（廈門）有限公司和賽默飛世爾科技（中國）有限公司的PCR-SBT 測序法分型結(jié)果、賽默飛世爾科技（中國）有限公司的NGS 測序法分型的前4 位高分辨分型結(jié)果均與表1 中的前4 位高分辨分型結(jié)果一致；北京博富瑞基因診斷技術(shù)有限公司PCR-SSO 法的前2 或4 位中高分辨分型結(jié)果與表1 的前2 位或4 位結(jié)果一致。最終取HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 的PCR-SBT 測序法前4位高分辨分型結(jié)果作為HLA 組織配型基因分型國家參考品的協(xié)作標(biāo)定結(jié)果。

表1 北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司PCR-SBT 測序法的分型結(jié)果Tab. 1 Typing result by PCR-SBT sequencing by Beijing CapitalBio Technology Co.，Ltd

2. 2 國際質(zhì)控盤的檢測 北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司采用PCR-SBT 測序法檢測38 支HLA 組織配型基因分型國家參考品，可全部檢出，結(jié)果同2. 1項；IHWG-SP Reference Pannel 的51 份樣本全部檢出，且HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 分型結(jié)果與IHWG公布結(jié)果一致，表明北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司采用PCR-SBT 測序法對HLA 組織配型基因分型國家參考品協(xié)作標(biāo)定具有良好的準(zhǔn)確性和可靠性。

3 討 論

本研究中協(xié)作標(biāo)定實驗室均為HLA 分型檢測領(lǐng)域有較大影響力的國內(nèi)外生產(chǎn)企業(yè)，其相應(yīng)試劑均具有良好的準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性，為HLA 組織配型基因分型國家參考品協(xié)作標(biāo)定提供了保障。PCR-SSO法常用于臨床肝臟腎臟等器官移植中的HLA 分型，可報告2 或4 位HLA 中高分辨HLA 分型信息。PCR-SBT 測序法是目前世界衛(wèi)生組織及國際組織相容性工作組（International Histocompatibility Working-Group，IHWG）共同推薦的HLA 分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”，可直接測得序列，報告4 或6 位HLA 高分辨分型信息，但僅能檢測部分外顯子，如Class-Ⅰ，大部分廠家試劑僅是檢測外顯子2、3、4，部分會單獨提供5、6外顯子測序，其他部分無法檢測，對2、3、4 外顯子的多態(tài)性的檢測也是有限的。NGS 測序法可報告4、6或8 位的HLA 高分辨分型信息，NGS 法不僅能夠測全長，還能夠較好地區(qū)分等位基因，在罕見基因和新基因的檢測上具有較大優(yōu)勢［10-13］。因此，在HLA 分型檢測方法上，本研究不僅選擇了1 家實驗室采用PCR-SSO 分型法對38 支國家參考品進行檢測，還聯(lián)合2 家實驗室采用金標(biāo)準(zhǔn)PCR-SBT 測序法對38 支國家參考品中臨床檢測中要求的部分外顯子進行直接測序，且聯(lián)合2 家實驗室采用NGS 測序法對38支國家參考品的全部外顯子進行測序，研究結(jié)果表明，PCR-SSO、PCR-SBT、NGS 3 種方法對38 支國家參考品的分型結(jié)果完全相符，進一步保障了國家參考品定值的準(zhǔn)確性。

IHWG 發(fā)布了一套HLA 序列多態(tài)性參考品質(zhì)控盤（IHWG-SP Reference Pannel），共包含來自不同個體的51 份DNA 樣本，是基于不同種族和地域的多樣性基因樣本，極具代表性，這些樣本的基因型已經(jīng)多種HLA 基因分型方法驗證，包括SBT 測序法，常用于國內(nèi)外免疫遺傳學(xué)和組織相容性實驗室用于HLA 分型檢測的質(zhì)量控制及HLA 分型試劑的測試驗證［14-15］。本研究采用該套IHWG 質(zhì)控盤作為實驗檢測的質(zhì)量控制，51 份DNA 樣本的分型檢測結(jié)果與IHWG 公布結(jié)果完全一致，表明本研究對HLA 組織配型基因分型國家參考品定值結(jié)果的可信度。

本研究對HLA 組織配型基因分型國家參考品定值進行了準(zhǔn)確的協(xié)作標(biāo)定，能夠滿足其作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求，可用于HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 分型檢測試劑盒的準(zhǔn)確性評價，適用于熒光PCR 法、PCR熔解曲線法、PCR-SSP 法、PCR-SSO 法、PCR-SBT 和NGS 測序法。采用本參考品進行準(zhǔn)確性檢測時，其分型結(jié)果在制造商標(biāo)示的分辨率水平上應(yīng)與參考品已知基因分型結(jié)果相符。