王媛花

（江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇 句容 212400）

目前我國(guó)草莓的種植主要以溫室大棚為主，由于種植技術(shù)、環(huán)境條件等因素的限制，導(dǎo)致草莓的病害日趨嚴(yán)重[1]，其中，灰霉病是草莓生產(chǎn)中的一種世界性病害，其病原菌為灰葡萄孢菌 (Botrytis cinerea Pers.，B.cinerea)。B.cinerea被認(rèn)為是非常重要的致病性死體營(yíng)養(yǎng)型真菌，染色體組分析表明B.cinerea 能分泌大約40種毒素，在采前和采后都會(huì)侵染草莓果實(shí)，造成果實(shí)腐爛，導(dǎo)致果實(shí)不能食用[2-4]。草莓一旦感染灰霉病，病果率一般在30%～60%，嚴(yán)重的情況下甚至絕收，會(huì)給草莓生產(chǎn)造成巨大的損失[5]。

茉莉酸(Jasmonic acid，JA)及其揮發(fā)性甲酯衍生物茉莉酸甲酯(Methyl-jasmonate，MeJA，也稱為甲基茉莉酸)和氨基酸衍生物統(tǒng)稱為茉莉酸類物質(zhì)(Jasmonates，JAs)，也稱為茉莉素、茉莉酮酸和茉莉酮酯，是植物體內(nèi)起整體性調(diào)控作用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)[6-9]。近年來，有關(guān)茉莉酸和蔗糖處理草莓的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，其不僅對(duì)于草莓果實(shí)發(fā)育與成熟方面有一定調(diào)控作用，而且以MeJA處理草莓能有效抑制草莓中由灰霉菌引起的灰霉病[10]。蔗糖是調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的信號(hào)分子，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)蔗糖能夠和茉莉酸共同作用促進(jìn)草莓果實(shí)成熟[11]。但是蔗糖對(duì)灰霉病影響的研究還很少，因此本研究就對(duì)茉莉酸甲酯與蔗糖對(duì)草莓果實(shí)灰霉病影響的的分子機(jī)理做初步探討，旨在為后續(xù)開展草莓抗病研究工作提供一個(gè)研究基礎(chǔ)，也可以為未來草莓的抗病育種工作提供一條新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究試驗(yàn)于2017年11月—2018年5月，在江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)所用的“紅顏”(Fragaria × ananassa ‘Benihoppe’)草莓果實(shí)材料均來自江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院草莓玻璃溫室。試驗(yàn)過程中，用來進(jìn)行果實(shí)采后處理的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑茉莉酸甲酯和蔗糖購(gòu)買自來自SIGMA-ALDRICH，吐溫20來自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司。各生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在超凈工作臺(tái)上配置成所需濃度，冷藏備用?；颐咕?Botrytis cinerea Bc)由本校生物工程中心從田間分離所得。病菌培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。病菌經(jīng)過常規(guī)方法純化以后，接種至PDA培養(yǎng)基上，在25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)14 d。然后在超凈工作臺(tái)上將培養(yǎng)基切下放入裝有無菌水的錐形瓶中，振蕩10 h后用4層紗布過濾，顯微鏡鏡檢調(diào)整，制備孢子懸浮濃度為1×105 cfu/mL懸浮液，用于果實(shí)病菌處理[12-15]。

1.2 主要試劑配方

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯去皮、去芽眼切成黃豆大小，用略多于所需量的水煮20 min左右，至其軟而不爛，再用4層紗布過濾，然后加入20 g/L瓊脂、20 g/L葡萄糖，定容至1 000 mL，高溫滅菌，備用。茉莉酸甲酯JA：500μmoL/L+0.02% 吐溫-20[16-18]。

蔗糖：15mmol/L+0.02% 吐溫-20[10]。

對(duì)照：無菌水+0.02% 吐溫-20。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 MeJA和蔗糖處理采后草莓果實(shí)后的發(fā)病規(guī)律觀察

摘取成熟的草莓果實(shí)，用配置好的MeJA和蔗糖處理后，直接噴施果面，每24 h噴一次，共3次。第3次噴完待12 h后，用無菌注射器針頭在果實(shí)上扎1個(gè)小孔，再用配置好的灰霉病懸浮液進(jìn)行果面噴施。觀察不同處理環(huán)節(jié)中草莓果實(shí)的發(fā)病情況。試驗(yàn)過程要求置于20 ℃恒溫環(huán)境，空氣濕度達(dá)到80%以上，光周期16 h/8 h。從果實(shí)處理開始每天拍照，直至完全發(fā)病。試驗(yàn)重復(fù)3次，重復(fù)試驗(yàn)時(shí)，每次處理果實(shí)50個(gè)。果實(shí)處理過程中，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)。

1.3.2 草莓果實(shí)中抗病基因表達(dá)量檢測(cè)

分別提取不同藥劑處理和發(fā)病情況的草莓果實(shí)的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。選取與草莓抗灰霉病相關(guān)的基因16個(gè)，轉(zhuǎn)錄據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列，設(shè)計(jì)目的基因熒光定量引物（見表1），并比對(duì)驗(yàn)證，確認(rèn)無誤后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qT-PCR）方法，檢測(cè)各基因相對(duì)表達(dá)量。qT-PCR使用儀器為Roche公司的熒光定量LightCycler 96儀，各個(gè)基因和內(nèi)參Actin 基因的反應(yīng)總體系為20 μL，其中包含10 μL Til RNase Plus (2x)，1 μL 上下游引物混合液，1 μL cDNA，8 μL無核酸污染的ddH2O，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；PCR定量分析95 ℃變性5 s，60 ℃退火 30 s，40個(gè)循環(huán)后，進(jìn)行溶解曲線分析：95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，最后降溫：50 ℃ 30 s，程序結(jié)束，用Roche的LightCycler 96 SW 1.1軟件分析各功能基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法和果實(shí)發(fā)病等級(jí)劃分

所有基因表達(dá)量采用2-ΔΔCT法來計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理的果實(shí)內(nèi)各功能基因的表達(dá)量均以用水處理果實(shí)的相應(yīng)基因表達(dá)量為對(duì)照。表達(dá)量按照上調(diào)下調(diào)倍數(shù)的方式，以不同顏色作為表達(dá)量上調(diào)或者下調(diào)的倍數(shù)。

發(fā)病率在灰霉病處理96 h時(shí)統(tǒng)計(jì)，后發(fā)病率=（發(fā)病的果實(shí)/處理果實(shí)）×100%。

病果級(jí)率=（該病果級(jí)的病果數(shù)/所有發(fā)病的果實(shí)）100%。

病果級(jí)按照?qǐng)D1中的標(biāo)準(zhǔn)來劃分：

圖1 草莓果實(shí)發(fā)病等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 MeJA和蔗糖處理草莓果實(shí)后的發(fā)病規(guī)律分析

從試驗(yàn)結(jié)果（見圖1）可以看出，用MeJA和蔗糖處理后的草莓果實(shí)與對(duì)照相比，灰霉病開始發(fā)病時(shí)間都差不多，都在接種灰霉病73 h開始發(fā)病。但是用MeJA和蔗糖處理后發(fā)病的程度與對(duì)照相比要輕很多。處理96 h后，對(duì)照大部分果實(shí)發(fā)病已經(jīng)很嚴(yán)重了，而用MeJA和蔗糖處理的果實(shí)發(fā)病癥狀依然很輕。從表2的發(fā)病率統(tǒng)計(jì)和發(fā)病程度的統(tǒng)計(jì)上來看，MeJA和蔗糖處理的果實(shí)發(fā)病程度顯著更輕于對(duì)照。從這個(gè)結(jié)果能夠推斷出，MeJA和蔗糖對(duì)于采后草莓灰霉病的發(fā)生中是有一定作用的。

表2 對(duì)照和處理草莓果實(shí)接種灰霉病后發(fā)病情況

2.2 草莓果實(shí)中相關(guān)抗病基因的表達(dá)量分析

從圖3的試驗(yàn)結(jié)果可以看出，與抗病相關(guān)的基因，在MeJA和蔗糖處理后與對(duì)照相比都受到不同程度的調(diào)控。而蔗糖處理后這些基因的調(diào)控更為明顯。在被MeJA處理的果實(shí)中，除MYB10、WRKY70基因外，所有與MeJA合成有關(guān)的基因均為負(fù)調(diào)控，而WRKY1基因的變化倍數(shù)達(dá)到了2～5倍，MYB10基因的變化倍數(shù)則達(dá)到了10倍以上，結(jié)合前面發(fā)病率數(shù)據(jù)，可以推測(cè)其對(duì)于灰霉病有不小的抗性。而在蔗糖處理果實(shí)中，除ERF3、MYB44.3、PR4、WRKY25及WRKY33基因外，皆為正調(diào)控，其中，AMY3基因的變化量達(dá)到2～5倍，bHLH3基因?yàn)?～10倍，而MYB10、WRKY1更是在10倍以上，結(jié)合前面發(fā)病率數(shù)據(jù)，也能推測(cè)這四個(gè)基因的過量表達(dá)也許能減輕灰霉病病果的發(fā)病程度，并且MYB10和WRKY1這兩個(gè)基因在兩種藥劑處理中都表現(xiàn)為2倍以上的正調(diào)控，在后續(xù)研究中需重點(diǎn)關(guān)注。

圖2 草莓果實(shí)處理后接種灰霉病發(fā)病進(jìn)程觀察

圖3 抗病基因表達(dá)量分析

3 討論

茉莉酸類化合物在植物抗逆基因中起著重要的作用。草莓作為重要的園藝作物，對(duì)其各功能基因在抗灰霉病方面的影響分子機(jī)理研究，能夠?yàn)椴葺鼓娓牧继峁├碚撘繹19-21]。目前已經(jīng)從草莓中分離鑒定出各種功能基因，并對(duì)其基因組分布、分子特征、系統(tǒng)進(jìn)化等方面進(jìn)行了分析。草莓灰霉病作為灰霉病是較為普遍且嚴(yán)重的病害之一，而且果實(shí)和葉片中都能感病，因此給草莓產(chǎn)量造成了很大的損失[2-3]。目前，普遍而有效的防治灰霉病的方法是化學(xué)藥劑防治，化學(xué)藥劑會(huì)使灰霉病產(chǎn)生抗藥性[16]。要從根源上解決，只有培育抗病品種才能最大限度地降低其危害，而分子育種是最為直接有效的方法，所以應(yīng)該尋找各種有效的抗病基因?yàn)楹罄m(xù)的育種工作提供素材，并進(jìn)一步篩選出更好的目標(biāo)基因，逐步提高良種素質(zhì)。

本試驗(yàn)用茉莉酸甲酯和蔗糖處理采后草莓果實(shí)，對(duì)草莓發(fā)病規(guī)律做了相關(guān)研究，同時(shí)用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)從抗病基因的表達(dá)量變化方面研究分析了其對(duì)于灰霉病的影響。研究結(jié)果表明，MeJA和蔗糖處理均對(duì)果實(shí)灰霉病的抑制有正向作用。期間發(fā)現(xiàn)了一些抗病相關(guān)基因（比如MYB10和WRKY1等）在處理后調(diào)控倍數(shù)明顯，因此可以推斷這些基因在灰霉病的抗性方面有關(guān)鍵作用，有可能在草莓中起到抗灰霉病的作用。本研究對(duì)深入解析草莓抗病的分子機(jī)理具有參考價(jià)值，同時(shí)為抗病育種研究提供了一條新的方向和思路。