中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)血管靶向治療專(zhuān)家委員會(huì) 中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)非小細(xì)胞肺癌專(zhuān)家委員會(huì)

無(wú)論是非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）還是小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC），均有部分患者可從免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICIs）治療中獲益。目前，預(yù)測(cè)程序性細(xì)胞死亡受體1（programmed cell death 1, PD-1）及其配體（programmed cell death ligand 1, PD-L1）抗體療效的生物標(biāo)志物主要有PD-L1表達(dá)、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden, TMB）。TMB概念起源于2013年Nature發(fā)表的一項(xiàng)研究[1]。在30個(gè)癌種7,000多個(gè)標(biāo)本中，研究者通過(guò)全基因組測(cè)序（whole genome sequencing,WGS）和全外顯子測(cè)序（whole exome sequencing, WES）技術(shù)分析了突變圖譜，描述了不同癌種樣本中每百萬(wàn)堿基（megabase, Mb）的突變數(shù)量。2014年的一項(xiàng)黑色素瘤研究[2]發(fā)現(xiàn)，免疫治療的響應(yīng)率與腫瘤突變數(shù)目有一定的相關(guān)性，通過(guò)WES檢出錯(cuò)義突變數(shù)量大于100的患者接受免疫治療后具有更長(zhǎng)的總生存期（overall survival, OS），這是首個(gè)驗(yàn)證TMB和免疫治療療效相關(guān)性的研究。2015年，首個(gè)TMB與NSCLC免疫治療療效的研究[3]發(fā)表于Science，該研究發(fā)現(xiàn)高于中位TMB的NSCLC患者具有更長(zhǎng)的無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival, PFS）。此后，CheckMate-026、CheckMate-227等多項(xiàng)大型研究證實(shí)了TMB對(duì)NSCLC免疫治療療效的預(yù)測(cè)作用。2017年，Genome Medicine發(fā)表的一項(xiàng)10萬(wàn)例實(shí)體瘤患者研究[4]，探索了靶向捕獲測(cè)序panel與WES檢測(cè)TMB的相關(guān)性，證實(shí)了panel檢測(cè)TMB的可行性與可靠性。2019年中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（Chinese Society of Clinical Oncology, CSCO）指南和美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）指南均將TMB納入晚期肺癌的分子病理檢測(cè)范圍。2020年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準(zhǔn)Pembrolizumab單藥用于治療高TMB且既往接受治療后病情進(jìn)展的不可手術(shù)或轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤患者。Pembrolizumab成為全球首個(gè)以TMB作為標(biāo)志物而獲批的抗腫瘤藥物。但臨床實(shí)踐中TMB的檢測(cè)和評(píng)估缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，這極大限制了其臨床應(yīng)用。雖然《腫瘤突變負(fù)荷檢測(cè)及臨床應(yīng)用中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)（2020年版）》已發(fā)布[5]，但TMB在肺癌免疫治療臨床應(yīng)用中的相關(guān)規(guī)范仍有待統(tǒng)一。為促進(jìn)TMB在肺癌免疫治療中應(yīng)用的規(guī)范化，協(xié)作組組織國(guó)內(nèi)肺癌領(lǐng)域權(quán)威專(zhuān)家，綜合國(guó)內(nèi)外高質(zhì)量文獻(xiàn)，形成《腫瘤突變負(fù)荷應(yīng)用于肺癌免疫治療的專(zhuān)家共識(shí)》，對(duì)TMB的定義、臨床意義和臨床應(yīng)用給出指導(dǎo)性建議。

1 TMB的定義

TMB是指腫瘤基因組內(nèi)存在的體細(xì)胞突變位點(diǎn)數(shù)量，可以間接反映腫瘤產(chǎn)生新生抗原的能力[6]。由于早期研究多基于WES檢測(cè)[7-10]，因此TMB通常是指單位基因組外顯子編碼區(qū)域（外顯子組，exome）的突變數(shù)量（mutations, muts），單位為muts/exome。雖然WES是檢測(cè)TMB的金標(biāo)準(zhǔn)[11]，但WES時(shí)間成本和分析成本較高。經(jīng)過(guò)多項(xiàng)大樣本研究驗(yàn)證后，TMB檢測(cè)從WES擴(kuò)展到了更切合臨床實(shí)際的靶向二代測(cè)序（next-generation sequencing panel, NGS panel）[12-17]。靶向測(cè)序的基因檢測(cè)位點(diǎn)比外顯子組少，由于不同平臺(tái)檢測(cè)方法和測(cè)序覆蓋的外顯子區(qū)域長(zhǎng)度不同，TMB也被定義為腫瘤基因組區(qū)域中每兆堿基（megabase, Mb）發(fā)生的堿基替換突變和插入缺失突變的數(shù)量總和，單位為muts/Mb。

不同研究納入TMB計(jì)算的突變類(lèi)型不同。例如，CheckMate-026研究[9]中，TMB被定義為通過(guò)WES測(cè)序腫瘤組織樣本中體細(xì)胞非同義突變數(shù)量的總和。在NGS panel檢測(cè)TMB的研究中，納入TMB計(jì)算的是體細(xì)胞編碼區(qū)中堿基替換突變和插入缺失突變，部分NGS panel計(jì)算TMB也同時(shí)納入了同義突變，而胚系變異、核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)、明確的抑癌基因及驅(qū)動(dòng)基因熱點(diǎn)突變則不計(jì)算在內(nèi)[4,18,19]。

2 TMB的檢測(cè)方法

2.1 WES WES是測(cè)定腫瘤TMB的金標(biāo)準(zhǔn)。NSCLC、黑色素瘤和尿路上皮癌等癌種的早期免疫治療研究均使用WES計(jì)算TMB[20-22]。由于同義突變產(chǎn)生新生抗原的可能性較低，利用WES計(jì)算TMB時(shí)僅納入非同義突變。但WES檢測(cè)成本較高、對(duì)樣本要求較高、數(shù)據(jù)分析較為復(fù)雜，在臨床應(yīng)用中有較大的局限性。到目前為止，F(xiàn)DA僅批準(zhǔn)了一款采用WES技術(shù)檢測(cè)TMB的產(chǎn)品（Omics CoreSM,NantHealth）。

2.2 NGS panel 通過(guò)NGS panel檢測(cè)TMB的計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)為每百萬(wàn)堿基中單堿基突變（可以納入同義突變）以及短插入和缺失突變。NGS panel檢測(cè)TMB需要與WES檢測(cè)TMB有較高的一致性。有研究[11]指出，對(duì)于突變頻率高的腫瘤，較小的NGS panel足夠用于TMB評(píng)估。但也有一些證據(jù)[23,24]發(fā)現(xiàn)檢測(cè)的基因數(shù)越多，TMB的檢測(cè)結(jié)果與WES的一致性越高，NGS大panel可能更適合評(píng)估TMB。對(duì)于TMB較高的樣本，不同大小的NGS panel檢測(cè)結(jié)果差異可能不顯著；而對(duì)于TMB較低的樣本，檢測(cè)結(jié)果的不一致性顯著增加。目前一般認(rèn)為NGS panel ≥0.8 Mb可以較好地評(píng)估腫瘤組織TMB水平[11]。測(cè)序深度是每個(gè)堿基讀長(zhǎng)的平均次數(shù)。WES的測(cè)序深度約100×，對(duì)于等位基因突變頻率大于15%的位點(diǎn)檢測(cè)較靈敏[25]。NGS panel的測(cè)序深度應(yīng)大于500×，可提高低頻突變的檢測(cè)敏感性[26,27]。目前已有兩款基于組織的panel產(chǎn)品（FoundationOne CDx，F(xiàn)oundation Medicine和PGDx Elio Tissue Complete，Personal Genome Diagnostics）和一款基于血液的panel產(chǎn)品（FoundationOne Liquid CDx, Foundation Medicine）獲得FDA批準(zhǔn)用于TMB檢測(cè)。計(jì)算機(jī)模擬及臨床實(shí)踐均證明經(jīng)這些NGS panel檢測(cè)的TMB與經(jīng)WES檢測(cè)的TMB有較好的一致性，并且在臨床試驗(yàn)中證實(shí)可以預(yù)測(cè)免疫治療療效。此外，測(cè)序操作建議選用國(guó)家藥品監(jiān)督管理局（National Medical Products Administration, NMPA）或者FDA批準(zhǔn)的測(cè)序儀器。通過(guò)NGS panel檢測(cè)TMB需經(jīng)過(guò)模型建立、虛擬驗(yàn)證、技術(shù)驗(yàn)證和臨床驗(yàn)證。

3 影響TMB檢測(cè)的因素

樣本收集階段、DNA處理階段、測(cè)序階段、生物信息分析階段和報(bào)告生成階段均會(huì)影響TMB檢測(cè)的可靠性。樣本收集階段主要包括樣本類(lèi)型、腫瘤類(lèi)型、腫瘤異質(zhì)性和克隆進(jìn)化等影響因素；DNA處理階段包括DNA質(zhì)量和數(shù)量、文庫(kù)構(gòu)建等影響因素；測(cè)序階段包括DNA捕獲區(qū)域、測(cè)序深度、覆蓋讀長(zhǎng)、測(cè)序平臺(tái)等影響因素；生物信息分析階段包括突變類(lèi)型、胚系突變過(guò)濾、等位基因突變頻率等影響因素[28-30]；報(bào)告生成階段包括瘤種分類(lèi)、患者人群、患者數(shù)量、TMB排序標(biāo)準(zhǔn)等影響因素[31,32]。除了考慮技術(shù)因素，流程監(jiān)管、樣本收集和處理質(zhì)控以及樣本運(yùn)送時(shí)長(zhǎng)等因素可能也會(huì)影響樣本質(zhì)量，從而影響檢測(cè)結(jié)果[6]。

4 TMB的臨床意義

免疫檢查點(diǎn)分子可負(fù)向調(diào)控細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性，從而抑制新生抗原驅(qū)動(dòng)的抗腫瘤免疫反應(yīng)[33]。PD-1抗體、PD-L1抗體和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T lymphocyte antigen 4, CTLA-4）抗體能夠與免疫檢查點(diǎn)分子結(jié)合，恢復(fù)細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性，啟動(dòng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。高TMB的腫瘤往往攜帶較高水平的新生抗原，腫瘤特異性體細(xì)胞突變所產(chǎn)生的新生蛋白或其降解產(chǎn)物被主要組織相容性復(fù)合體遞呈到腫瘤細(xì)胞表面，形成腫瘤新生抗原，可能導(dǎo)致T細(xì)胞的激活，故能提高ICIs的治療敏感性?，F(xiàn)有證據(jù)表明，TMB是晚期肺癌免疫治療的療效預(yù)測(cè)因子和預(yù)后的影響因素。

從2015年至今，已經(jīng)有大量臨床研究探索了TMB對(duì)肺癌免疫治療療效的預(yù)測(cè)作用。KEYNOTE-158是其中一項(xiàng)里程碑式研究[34]，該研究納入10個(gè)癌種共計(jì)1,032例難治性實(shí)體瘤患者，結(jié)果表明Pembrolizumab在高TMB患者中總體客觀緩解率（objective response rate, ORR）為29%，而低TMB患者ORR僅為6%。基于該結(jié)果，Pembrolizumab被FDA批準(zhǔn)用于高TMB且既往治療后疾病進(jìn)展的不可手術(shù)或轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤患者，其中高TMB定義為組織TMB≥10 muts/Mb。除了基于腫瘤組織檢測(cè)TMB，通過(guò)液體活檢技術(shù)評(píng)估血液TMB（blood-based TMB, bTMB）水平并預(yù)測(cè)免疫治療療效也展開(kāi)了初步探索。2018年發(fā)表于Nature Medicine的一項(xiàng)回顧性研究[35]分析了bTMB與Atezolizumab療效的相關(guān)性，該研究發(fā)現(xiàn)高bTMB的晚期NSCLC患者接受Atezolizumab治療后ORR和PFS得到顯著改善。2019年發(fā)表于JAMA Oncology的另一項(xiàng)研究[24]證實(shí)了通過(guò)NGS panel計(jì)算的bTMB同樣能夠預(yù)測(cè)晚期NSCLC患者接受免疫治療的ORR和PFS。2020年發(fā)表在Journal of Thoracic Oncology的一項(xiàng)研究[23]進(jìn)一步優(yōu)化了bTMB算法，證實(shí)LAF-bTMB（low allele frequency, bTMB）能夠有效地預(yù)測(cè)晚期NSCLC患者接受免疫治療的ORR、PFS以及OS。這些研究表明，bTMB在預(yù)測(cè)免疫治療療效中具有一定前景。

5 TMB應(yīng)用于肺癌免疫治療共識(shí)

共識(shí)一：WES是TMB檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但目前測(cè)序成本和分析難度較高。NGS panel與WES的TMB檢測(cè)結(jié)果具有高度一致性，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的NGS panel可作為臨床檢測(cè)TMB的替代方式。

TMB檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)是WES。FDA已批準(zhǔn)了一款基于WES技術(shù)檢測(cè)TMB的產(chǎn)品（Omics CoreSM），其包含19,396個(gè)基因，覆蓋DNA全長(zhǎng)39 Mb，其中編碼區(qū)（coding sequence, CDS）長(zhǎng)度約為33.7 Mb。WES測(cè)序成本高、分析難度大，因此NGS panel測(cè)序技術(shù)在臨床上得到了廣泛應(yīng)用。需要指出的是，NGS panel檢測(cè)的TMB應(yīng)與WES檢測(cè)的TMB具有高度一致性才能指導(dǎo)臨床選用ICIs[31]。

通過(guò)NGS檢測(cè)TMB需經(jīng)過(guò)模型建立、虛擬驗(yàn)證、技術(shù)驗(yàn)證和臨床驗(yàn)證。模型建立指：在設(shè)計(jì)NGS panel時(shí)，應(yīng)建立理論計(jì)算模型，對(duì)納入不同基因數(shù)的NGS panel和WES進(jìn)行TMB相關(guān)性比對(duì)?；驍?shù)量確定后，基因選擇需符合以下標(biāo)準(zhǔn)：①權(quán)威指南推薦和有高等級(jí)循證醫(yī)學(xué)證據(jù)的基因；②有高質(zhì)量研究支持的上述基因相關(guān)的上下游通路基因；③與免疫治療相關(guān)的基因，包括可能的敏感基因、原發(fā)或繼發(fā)耐藥基因、與免疫超進(jìn)展發(fā)生相關(guān)的基因；④與TMB相關(guān)的基因，例如DNA損傷修復(fù)（DNA damage repair, DDR）相關(guān)基因等[36]。納入隨機(jī)選擇的基因和通過(guò)篩選的基因分別計(jì)算TMB，比對(duì)NGS panel和WES檢測(cè)TMB的相關(guān)性。此外，納入同義突變對(duì)于NGS panel與WES檢測(cè)TMB相關(guān)性的影響也應(yīng)考慮在內(nèi)。虛擬驗(yàn)證指：通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)待驗(yàn)證NGS panel及已獲批NGS panel計(jì)算TMB與WES計(jì)算TMB的相關(guān)性。通過(guò)公共隊(duì)列數(shù)據(jù)比對(duì)NGS panel計(jì)算的TMB能否區(qū)分臨床獲益。技術(shù)驗(yàn)證是指利用WES和NGS panel同時(shí)檢測(cè)臨床腫瘤樣本，評(píng)估兩種方法所得TMB的相關(guān)性是否較高。臨床驗(yàn)證指：通過(guò)前瞻性或回顧性臨床研究，驗(yàn)證NGS panel檢測(cè)所得的TMB是否可用于提示免疫治療療效。

經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的NGS panel可用于替代WES檢測(cè)TMB。FDA批準(zhǔn)用于檢測(cè)TMB的NGS panel產(chǎn)品（表1）均與WES測(cè)序進(jìn)行了對(duì)比研究，兩者檢測(cè)所得TMB結(jié)果高度一致。另一款FDA批準(zhǔn)的NGS panel產(chǎn)品MSK-IMPACT在獲批的臨床應(yīng)用中未包含TMB，但MSK-IMPACT在既往臨床研究中被證明可用于替代WES進(jìn)行TMB檢測(cè)，體現(xiàn)了其臨床應(yīng)用價(jià)值。

表1 FDA批準(zhǔn)的TMB檢測(cè)panel參數(shù)

共識(shí)二：通過(guò)病理質(zhì)控的石蠟包埋腫瘤組織方可用于TMB檢測(cè)。在腫瘤組織獲取困難或石蠟包埋樣本中腫瘤細(xì)胞含量不足的情況下，晚期NSCLC患者可選擇外周血進(jìn)行基于ctDNA的bTMB檢測(cè)。

石蠟包埋樣本是臨床上評(píng)估TMB最常用的標(biāo)本類(lèi)型。經(jīng)石蠟包埋的腫瘤組織用于TMB檢測(cè)之前應(yīng)經(jīng)過(guò)病理質(zhì)控。手術(shù)組織取材大小應(yīng)在5 mm×5 mm×3 mm及以上，取材時(shí)盡量選取腫瘤組織多的區(qū)域，避免壞死組織。組織離體后盡快（10 min內(nèi)）浸入足量的10%中性緩沖福爾馬林固定液中固定。穿刺活檢樣本取材直徑應(yīng)不小于1 mm，長(zhǎng)度不小于10 mm，且不少于1條穿刺樣本。穿刺取材時(shí)盡量選取腫瘤組織多的區(qū)域，避開(kāi)壞死組織，若含壞死組織較多，建議重新活檢。石蠟切片厚度約4 μm-5 μm。檢測(cè)TMB時(shí)，手術(shù)來(lái)源的石蠟切片至少需要5張，穿刺樣本或小標(biāo)本切片需10張以上。為保證TMB檢測(cè)結(jié)果的可靠性，建議送檢1年內(nèi)的石蠟包埋樣本。既往有研究發(fā)現(xiàn)6個(gè)月內(nèi)的蠟塊基因組信息保留相對(duì)穩(wěn)定，因此送檢6個(gè)月內(nèi)的蠟塊更佳[37]。在臨床實(shí)踐中，DNA含量過(guò)低可能會(huì)影響TMB的評(píng)估[38-40]。根據(jù)FDA獲批的TMB檢測(cè)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)顯示，送檢樣本需至少含有50 ng腫瘤DNA。影響石蠟包埋樣本提取DNA的因素包括：樣本可用性[41-44]、收集、準(zhǔn)備和固定（對(duì)于中性福爾馬林固定的手術(shù)標(biāo)本最佳固定時(shí)間約24 h，對(duì)于穿刺活檢標(biāo)本固定時(shí)間約12 h[45]）、樣本腫瘤細(xì)胞含量（FDA批準(zhǔn)的TMB檢測(cè)產(chǎn)品對(duì)腫瘤純度要求均≥20%）。應(yīng)充分考慮腫瘤組織來(lái)源異質(zhì)性對(duì)TMB結(jié)果的影響。研究[46]發(fā)現(xiàn)原發(fā)灶TMB和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移灶TMB差異不明顯，而轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)來(lái)源的TMB則顯著低于原發(fā)灶TMB，因此原發(fā)灶和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移灶均可用于評(píng)估TMB。此外，全血樣本或正常組織也應(yīng)同時(shí)采集，用于過(guò)濾胚系突變。全血標(biāo)本采集推薦使用游離核酸保存管或含乙二胺四乙酸鹽的抗凝采血管，約8 mL-10 mL。正常組織石蠟切片與腫瘤組織切片數(shù)量相似。

在腫瘤組織獲取困難或石蠟包埋樣本中腫瘤細(xì)胞含量不足的情況下，外周血循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）也是可選擇的一種樣本類(lèi)型。相比于組織，使用ctDNA檢測(cè)bTMB具有創(chuàng)傷性小、可重復(fù)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)。血液樣本推薦使用游離核酸保存管采集，并在說(shuō)明書(shū)規(guī)定保存時(shí)間范圍內(nèi)分離血漿。分離后的血漿應(yīng)按照核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)盡快提取血漿游離DNA（cell free DNA,cfDNA），DNA濃度采用核酸定量試劑盒定量。如無(wú)法及時(shí)提取cfDNA，應(yīng)將血漿置于-80oC冰箱保存，并避免反復(fù)凍融。目前，使用ctDNA評(píng)估bTMB的技術(shù)已通過(guò)了方法驗(yàn)證和臨床驗(yàn)證[47-49]。大多數(shù)研究[35,50]認(rèn)為組織和ctDNA評(píng)估的TMB一致性較高。盡管ctDNA檢測(cè)bTMB的敏感性較組織低[48,51,52]，基于ctDNA評(píng)估bTMB依然具有潛在的臨床應(yīng)用前景。除了ctDNA，胸腔積液、腦脊液等液體活檢樣本用于TMB評(píng)估和指導(dǎo)臨床用藥的證據(jù)尚不充分，本共識(shí)不做討論。

對(duì)于晚期NSCLC，基于組織檢測(cè)的高TMB患者比低TMB患者接受免疫治療后具有更高的ORR、更長(zhǎng)的中位PFS[9,30,53]。類(lèi)似地，基于ctDNA檢測(cè)的B-F1RST研究[54]中，Atezolizumab一線治療高bTMB和低bTMB的NSCLC患者的ORR分別為36.4%和6.4%，中位PFS分別為9.5個(gè)月和2.8個(gè)月。POPLAR和OAK研究的回顧性分析[24,35]發(fā)現(xiàn)，高bTMB的患者PFS獲益大于低bTMB的患者，但OS在高bTMB和低bTMB患者中無(wú)明顯差異。然而，改進(jìn)bTMB算法后的一項(xiàng)研究[23]表明，低豐度的bTMB可預(yù)測(cè)免疫治療患者的OS獲益。

CheckMate-032研究結(jié)果提示，基于組織檢測(cè)的高TMB SCLC患者接受Nivolumab聯(lián)合Ipilimumab后ORR、中位PFS以及中位OS均優(yōu)于中低TMB患者[55,56]。一項(xiàng)SCLC回顧性研究[57]也發(fā)現(xiàn)，基于組織檢測(cè)的高TMB患者比低TMB患者具有更長(zhǎng)的中位PFS和中位OS。目前，基于外周血ctDNA檢測(cè)的bTMB相關(guān)研究在SCLC中的報(bào)道尚少。

共識(shí)三：既往未接受過(guò)免疫治療的晚期NSCLC患者，在接受免疫單藥治療前推薦進(jìn)行TMB檢測(cè)。TMB預(yù)測(cè)SCLC一線免疫治療療效的臨床證據(jù)尚不充分，暫不作為提示免疫一線治療療效標(biāo)志物，但可考慮作為二線及后線免疫治療的療效標(biāo)志物。

晚期NSCLC相關(guān)研究[9]顯示，TMB對(duì)免疫一線治療、二線治療和后線治療均有一定預(yù)測(cè)作用。例如，CheckMate-026研究表明，高TMB的NSCLC患者接受Nivolumab一線治療的ORR為47%，而接受化療的ORR僅為28%，中位PFS分別為9.7個(gè)月和5.8個(gè)月（HR=0.62,95%CI: 0.38-1.00）；而中、低TMB患者接受免疫治療的中位PFS顯著劣于化療（4.1個(gè)月 vs 6.9個(gè)月；HR=1.82，95%CI：1.30-2.55）。以二線治療為主的免疫治療研究發(fā)現(xiàn)，高TMB的NSCLC患者比低TMB的患者具有更高的ORR、更長(zhǎng)的中位PFS和OS[30,53]。在以后線治療為主的KEYNOTE-001研究中，高TMB的NSCLC患者中位PFS為14.5個(gè)月，而低TMB患者中位PFS僅為3.7個(gè)月[3,58]。MYSTIC研究結(jié)果[59]表明，高TMB患者和低TMB患者接受PD-L1抑制劑Durvalumab治療的中位OS分別為18.6個(gè)月和10.1個(gè)月。OAK和POPLAR研究的回顧性分析結(jié)果[35]提示，高bTMB的NSCLC患者接受Atezolizumab治療的ORR和中位PFS顯著優(yōu)于化療。這些數(shù)據(jù)表明，對(duì)于既往沒(méi)有接受過(guò)免疫治療的晚期NSCLC患者，TMB檢測(cè)可以指導(dǎo)其選用ICIs單藥治療。

對(duì)于SCLC，IMpower-133研究亞組分析并未顯示bTMB與Atezolizumab聯(lián)合化療的療效具有相關(guān)性[55]。一項(xiàng)SCLC二線及后線免疫治療研究（CheckMate-032）[56]發(fā)現(xiàn)，相比于低、中TMB患者，高TMB SCLC患者接受Nivolumab單藥治療的中位PFS和OS并未顯著延長(zhǎng)，但接受Nivolumab聯(lián)合Ipilimumab治療的高TMB患者中位PFS和OS顯著延長(zhǎng)。KEYNOTE-158研究[34]納入了76例后線SCLC患者，高TMB組Pembrolizumab治療的ORR達(dá)到29.4%，而低TMB組為9.5%。此外，一項(xiàng)回顧性研究[57]發(fā)現(xiàn)接受二線及后線免疫治療的高TMB SCLC患者具有顯著更長(zhǎng)的中位PFS和OS。由此可見(jiàn)，TMB并不能預(yù)測(cè)SCLC一線免疫聯(lián)合化療的療效，但對(duì)后線免疫治療療效具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。

共識(shí)四：不推薦PD-1/PD-L1抗體聯(lián)合化療的晚期NSCLC或SCLC患者接受TMB檢測(cè)。

ICIs聯(lián)合治療方式包括ICIs聯(lián)合化療、雙ICIs聯(lián)合治療、ICIs聯(lián)合抗血管生成治療、ICIs同時(shí)聯(lián)合化療及抗血管生成治療等。Pembrolizumab聯(lián)合化療的KEYNOTE-021、KEYNOTE-189和KEYNOTE-407回顧性分析發(fā)現(xiàn)，高TMB不是預(yù)測(cè)Pembrolizumab聯(lián)合化療療效的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。從國(guó)內(nèi)PD-1單抗藥物的肺癌臨床數(shù)據(jù)[60]可知，Sintilimab聯(lián)合化療（培美曲塞/順鉑）的Ib期研究中TMB與ORR無(wú)顯著相關(guān)。對(duì)于接受Atezolizumab聯(lián)合化療的SCLC患者，bTMB也不是OS獲益的預(yù)測(cè)因素[55]。因此，對(duì)于晚期NSCLC或SCLC患者，TMB并不能預(yù)測(cè)PD-1/PD-L1抗體聯(lián)合化療的療效。

目前，雙ICIs聯(lián)合治療晚期肺癌主要方式為PD-1/PD-L1抑制劑聯(lián)合CTLA-4抑制劑。CheckMate-227研究中，當(dāng)腫瘤細(xì)胞PD-L1≥1%、TMB≥10 muts/Mb時(shí)，接受Nivolumab聯(lián)合Ipilimumab治療的NSCLC患者比接受Nivolumab治療患者的中位PFS更長(zhǎng)（7.1個(gè)月 vs 4.2個(gè)月）；TMB<10 muts/Mb時(shí)，接受Nivolumab聯(lián)合Ipilimumab治療的患者僅有3.2個(gè)月的中位PFS[12]。MYSTIC研究中，bTMB≥20 muts/Mb時(shí)接受Durvalumab聯(lián)合Tremelimumab治療的NSCLC患者中位PFS及OS均長(zhǎng)于Durvalumab單藥治療的患者[59]，而bTMB<20 muts/Mb時(shí)結(jié)果相反。對(duì)于高TMB的SCLC患者，接受Nivolumab聯(lián)合Ipilimumab治療患者的中位PFS和中位OS分別為7.8個(gè)月和22個(gè)月，而接受Nivolumab治療患者的中位PFS和中位OS僅有1.4個(gè)月和5.4個(gè)月。對(duì)于低TMB的SCLC患者，接受Nivolumab聯(lián)合Ipilimumab治療患者的中位PFS和中位OS分別為1.5個(gè)月和3.4個(gè)月，而接受Nivolumab治療患者的中位PFS和中位OS分別為1.3個(gè)月和3.1個(gè)月[56]。由此可見(jiàn)，高TMB的NSCLC或SCLC患者接受Nivolumab聯(lián)合Ipilimumab治療獲益更明顯。需要特別強(qiáng)調(diào)的是，盡管高TMB可以預(yù)測(cè)PD-1/PD-L1抑制劑聯(lián)合CTLA-4抑制劑的療效，但CTLA-4抑制劑在我國(guó)目前尚未獲批肺癌適應(yīng)證。因此，對(duì)于PD-1/PD-L1抑制劑聯(lián)合CTLA-4抑制劑治療的晚期NSCLC或SCLC患者是否接受TMB檢測(cè)暫不做推薦。

ICIs聯(lián)合抗血管生成治療、ICIs同時(shí)聯(lián)合化療和抗血管生成治療中TMB的臨床指導(dǎo)價(jià)值尚無(wú)充足的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，有待于將來(lái)進(jìn)一步探索。

共識(shí)五：暫不推薦TMB用于預(yù)測(cè)免疫新輔助治療療效。

相比于晚期NSCLC，TMB在早期NSCLC免疫新輔助治療中的研究仍不多。2018年New England Journal of Medicine發(fā)表了一項(xiàng)Nivolumab用于I期-IIIa期NSCLC患者新輔助治療的研究[61]，顯著病理緩解（major pathological response, MPR）率為45%；達(dá)到MPR的患者和未達(dá)到MPR的患者具有的突變位點(diǎn)數(shù)量分別為311個(gè)和74個(gè)，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.01）。但在另一項(xiàng)免疫新輔助研究[62]中，Nivolumab聯(lián)合Ipilimumab治療的MPR為33%，MPR和TMB高低狀態(tài)無(wú)顯著相關(guān)性。由于這些均為小樣本臨床研究，未來(lái)還需要更多研究探索TMB在免疫新輔助治療中的預(yù)測(cè)價(jià)值。

共識(shí)六：目前尚沒(méi)有公認(rèn)的區(qū)分高、低TMB的cut-off值，推薦各免疫治療藥物根據(jù)各自臨床研究數(shù)據(jù)確定cut-off值，并進(jìn)行前瞻性驗(yàn)證。

目前，區(qū)分高、低TMB的cut-off值并無(wú)統(tǒng)一界定，不同的研究采用不同的方法確定cut-off值。一種方式是通過(guò)訓(xùn)練集確定TMB cut-off值[3,63]。例如，KEYNOTE-001研究的訓(xùn)練集TMB cut-off值為178 muts/exome，患者持續(xù)臨床緩解的敏感性和特異性分別為100%和67%。TMB≥178 muts/exome的患者ORR為63%，而TMB<178 muts/exome的患者ORR為0。對(duì)于中位PFS，TMB≥178 muts/exome的患者較TMB<178 muts/exome的患者延長(zhǎng)10.8個(gè)月。另一種方式是通過(guò)分位法確定TMB cut-off值。分位法目前有二分位（排序前50%為高TMB）、三分位（排序前30%為高TMB）、四分位（排序前25%為高TMB）、五分位（排序前20%為高TMB）和十分位（排序前10%為高TMB）。不同研究采用相同分位時(shí)，免疫治療的獲益有所不同[53,64]。同一研究采用不同分位值時(shí)，免疫治療的療效是否隨TMB升高而提高也具有爭(zhēng)議。例如，發(fā)表于Nature Genetics的一項(xiàng)回顧性研究[65]發(fā)現(xiàn)免疫治療獲益隨TMB的升高而提高。但在CheckMate-568研究中，TMB≥10 muts/Mb時(shí)ORR為43.8%，而TMB≥15 muts/Mb時(shí)ORR僅為39.3%[63]。在另一項(xiàng)研究[53]中，TMB排序前25%、50%、75%和90%患者的疾病控制率分別為24.1%、25.1%、25.7%和27.7%。這可能和納入分析的患者數(shù)量、免疫治療藥物、NGS panel、TMB計(jì)算方法和研究設(shè)計(jì)類(lèi)型等因素有關(guān)。建議臨床盡可能采用循證醫(yī)學(xué)證據(jù)較為充分的NGS panel進(jìn)行TMB檢測(cè)；并建議各類(lèi)免疫治療藥物在開(kāi)展臨床研究時(shí)盡可能使用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的NGS panel作為伴隨診斷工具，根據(jù)各自臨床研究數(shù)據(jù)確定TMB的cutoff值，并通過(guò)前瞻性研究加以驗(yàn)證。

共識(shí)七：TMB檢測(cè)報(bào)告應(yīng)呈現(xiàn)納入TMB計(jì)算的基因變異類(lèi)型、TMB排序以及支持TMB排序的參考數(shù)據(jù)庫(kù)，并提供輔助臨床決策所需要的醫(yī)學(xué)證據(jù)。

WES檢測(cè)TMB和NGS panel檢測(cè)TMB所納入的基因變異類(lèi)型不同。對(duì)于WES檢測(cè)TMB而言，僅納入了腫瘤組織樣本中體細(xì)胞非同義突變。而對(duì)于NGS panel，納入TMB計(jì)算的則是體細(xì)胞編碼區(qū)中堿基替換突變和插入缺失突變，有的研究還納入了同義突變。無(wú)論是WES還是NGS panel檢測(cè)TMB，胚系變異、核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)、明確的抑癌基因及驅(qū)動(dòng)基因熱點(diǎn)突變均不計(jì)算在內(nèi)。雖然納入不同基因變異類(lèi)型計(jì)算的TMB在肺癌ICIs臨床研究中均有獲益報(bào)道，但是對(duì)于TMB基因變異類(lèi)型仍無(wú)統(tǒng)一規(guī)范。因此，TMB檢測(cè)報(bào)告應(yīng)呈現(xiàn)TMB計(jì)算納入的變異類(lèi)型，同時(shí)推薦報(bào)告中WES檢測(cè)TMB的單位統(tǒng)一為muts/exome，NGS檢測(cè)TMB的單位統(tǒng)一為muts/Mb。

如共識(shí)六所述，TMB cut-off值主要通過(guò)訓(xùn)練集或分位法確定。無(wú)論是哪種方法確定，高TMB患者在肺癌ICIs臨床研究中均有獲益報(bào)道。與計(jì)算TMB所納入的基因變異類(lèi)型相似，目前尚沒(méi)有公認(rèn)的TMB cut-off值。因此，TMB檢測(cè)報(bào)告應(yīng)呈現(xiàn)TMB排序以及支持該排序的參考數(shù)據(jù)庫(kù)。此外，TMB檢測(cè)報(bào)告應(yīng)具備盡量全面的、更新及時(shí)的高級(jí)別循證醫(yī)學(xué)證據(jù)用于輔助臨床決策。醫(yī)學(xué)證據(jù)包括TMB計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)文獻(xiàn)、TMB cut-off值確定標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)文獻(xiàn)、TMB技術(shù)驗(yàn)證和臨床驗(yàn)證的相關(guān)文獻(xiàn)、報(bào)告中TMB高低標(biāo)準(zhǔn)與免疫治療療效相關(guān)性的相關(guān)文獻(xiàn)等。醫(yī)學(xué)證據(jù)要求準(zhǔn)確，應(yīng)參考臨床研究結(jié)論優(yōu)先于臨床前研究結(jié)論，前瞻性研究結(jié)論優(yōu)先于回顧性研究結(jié)論的順序進(jìn)行展示和解讀。

共識(shí)八：建議聯(lián)合PD-L1表達(dá)、免疫治療相關(guān)基因、組織和循環(huán)中的免疫細(xì)胞等信息，對(duì)TMB指導(dǎo)肺癌免疫治療進(jìn)行綜合解讀。

目前，PD-L1和NGS檢測(cè)是臨床上預(yù)判免疫治療療效應(yīng)用最多的檢測(cè)手段。PD-L1表達(dá)在NSCLC免疫治療中的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)最為充分。TMB與PD-L1表達(dá)相關(guān)性不大[30,53]。因此，臨床實(shí)踐中應(yīng)將TMB檢測(cè)結(jié)果與PD-L1表達(dá)結(jié)合起來(lái)進(jìn)行解讀。在一項(xiàng)晚期NSCLC免疫治療研究[66]中，TMB高且PD-L1高表達(dá)的患者的ORR可達(dá)62.5%，而TMB高且PD-L1低表達(dá)的患者ORR為43.9%，TMB低且PD-L1高表達(dá)的患者ORR僅有27.3%。TMB高且PD-L1高表達(dá)的患者的中位PFS最長(zhǎng)（HR=0.42, 95%CI: 0.30-0.58,P<0.001）。在Rizvi等[53]的研究中也得到了相似的結(jié)論。除TMB數(shù)據(jù)以外，NGS還可以提供詳細(xì)的腫瘤體細(xì)胞基因突變信息。一般認(rèn)為，攜帶EGFR、ALK重排、ROS1融合、STK11/LKB1、KEAP1、PTEN、JAK2、B2M、MDM2/MDM4擴(kuò)增等免疫耐藥基因變異的肺癌患者，接受免疫單藥療效較差，甚至可能發(fā)生快速進(jìn)展或超進(jìn)展。而攜帶DDR通路基因突變的患者，由于DNA損傷修復(fù)基因功能受損，導(dǎo)致TMB增高，對(duì)免疫治療可能更為敏感。王潔教授團(tuán)隊(duì)[36]前期研究發(fā)現(xiàn)，如果腫瘤細(xì)胞同時(shí)攜帶2條DDR通路基因突變，則其對(duì)免疫治療療效更佳。吳一龍教授團(tuán)隊(duì)[67]的研究結(jié)果表明，攜帶TP53和KRAS基因突變的肺腺癌患者PD-L1表達(dá)顯著增高，免疫治療療效也優(yōu)于野生型患者。因此，當(dāng)TMB、PD-L1均為高表達(dá)且沒(méi)有攜帶耐藥基因突變時(shí)，強(qiáng)烈推薦使用免疫治療；而當(dāng)以上檢測(cè)結(jié)果不一致時(shí)，需謹(jǐn)慎考慮使用免疫治療，尤其是免疫單藥治療。

現(xiàn)有的研究數(shù)據(jù)[10,68-70]表明，人類(lèi)白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）分型、腫瘤免疫微環(huán)境、腫瘤新生抗原和腸道菌群多樣性等指標(biāo)均與肺癌免疫治療有一定相關(guān)性。例如，NSCLC患者腫瘤組織免疫微環(huán)境中PD-1+CD8+T細(xì)胞、PD-L1+CD8+T細(xì)胞、PD-L1+CD68+巨噬細(xì)胞水平與免疫治療應(yīng)答呈正相關(guān)[71-73]。此外，外周血CD8+T細(xì)胞可能也與免疫治療應(yīng)答相關(guān)[74]。這些檢測(cè)指標(biāo)尚處于研究階段，且對(duì)臨床樣本要求較高，檢測(cè)、分析方法也較復(fù)雜，故有檢測(cè)條件的中心可結(jié)合相關(guān)檢測(cè)結(jié)果，對(duì)TMB指導(dǎo)肺癌免疫治療進(jìn)行綜合解讀。

致謝：感謝上海思路迪醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司張丁博士和陳世清博士在數(shù)據(jù)和資料收集過(guò)程中提供的幫助。

附錄：關(guān)于TMB/bTMB在肺癌免疫治療的研究（http://www.lungca.org/files/0426supp.pdf）