許金娟，楊書珍，張美紅，李笑影，彭麗桃

碳酸銨對(duì)意大利青霉的作用機(jī)制及對(duì)不同柑橘果實(shí)品質(zhì)的影響

許金娟，楊書珍，張美紅，李笑影，彭麗桃※

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，武漢 430070）

為了尋求一種安全有效的方法防治由意大利青霉（）引起的柑橘青霉病，該研究分析了碳酸銨抑制意大利青霉生長(zhǎng)的可能作用機(jī)制及對(duì)臍橙、皇帝柑、沃柑3種不同類型柑橘貯藏品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，碳酸銨能抑制意大利青霉孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)，且呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，在質(zhì)量濃度分別為0.4和0.8 g/L時(shí)可完全抑制孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)。結(jié)構(gòu)觀察表明，碳酸銨引起菌絲生長(zhǎng)節(jié)點(diǎn)稀疏和分支減少；超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)菌絲嚴(yán)重皺縮，菌絲線粒體結(jié)構(gòu)異常。生理生化分析表明，碳酸銨處理引起線粒體的鈉/鉀離子ATP酶（Na+/ K+-ATPase）、鈣離子ATP酶（Ca2+-ATPase）和鎂離子ATP酶（Mg2+-ATPase）活性下降，導(dǎo)致還原型谷胱甘肽（Reduced Glutathione，GSH）含量及谷胱甘肽還原酶（Glutathione Reductase，GR）活性降低，活性氧清除體系超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）、過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）活性紊亂，促進(jìn)H2O2積累。添加活性氧清除劑半胱氨酸（Cysteine，Cys）能部分恢復(fù)碳酸銨處理的病菌孢子萌發(fā)?；铙w接種表明，16 g/L碳酸銨處理顯著減小了柑橘果實(shí)接種意大利青霉的病斑直徑（<0.05），減輕果實(shí)發(fā)病。碳酸銨處理能降低3種類型柑橘果實(shí)自然發(fā)病率，且對(duì)果實(shí)失重率、色澤、可溶性固形物、可滴定酸、維生素C、還原糖含量無(wú)不良影響。結(jié)果表明，碳酸銨通過(guò)損傷意大利青霉菌絲線粒體結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)活性氧積累來(lái)發(fā)揮抗真菌活性，可以作為殺菌劑的綠色有效替代品，研究結(jié)果可為碳酸銨防治柑橘果實(shí)采后腐爛提供參考。

貯藏；品質(zhì)控制；意大利青霉；線粒體；碳酸銨；活性氧；作用機(jī)理；柑橘

0 引 言

柑橘是世界上主要的水果之一，橙、柑、橘、柚、檸檬等是商業(yè)上重要的柑橘類型[1]。柑橘在采后貯藏運(yùn)輸環(huán)節(jié)易受多種病原菌侵染，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。由意大利青霉引起的青霉病柑橘占果實(shí)腐爛柑橘的30%～50%[3]。目前在生產(chǎn)實(shí)踐中，主要采用咪鮮胺、抑霉唑等化學(xué)殺菌劑進(jìn)行防治，雖有良好的防治作用，但對(duì)人體和環(huán)境存在安全隱患[4]。因此，尋找安全有效的方法替代或減少合成殺菌劑的使用至關(guān)重要[5]。

一些無(wú)機(jī)鹽或有機(jī)鹽如碳酸鹽、山梨酸鹽、硅酸鹽、苯甲酸鹽等，通常被認(rèn)為是安全（Generally Recognized As Safe，GRAS）的藥劑，由于其可接受性、低成本和高溶解度而在商業(yè)用途中有顯著優(yōu)勢(shì)[4]。目前研究表明，碳酸鹽中的碳酸鈉和碳酸鉀，可以顯著抑制果實(shí)采后病原菌如意大利青霉（）、炭疽菌（）、指狀青霉（）和葡萄座腔菌（）的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)[6-8]。活體試驗(yàn)研究結(jié)果顯示碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀等鹽類，可有效控制檸檬、橙子、葡萄等果實(shí)采后真菌侵染，降低果實(shí)的發(fā)病率[8-11]。碳酸銨是一種常見(jiàn)的無(wú)機(jī)鹽，化學(xué)式為(NH4)2CO2，具有強(qiáng)烈的氨臭味，易溶于水，且水溶液呈堿性。有研究發(fā)現(xiàn)，碳酸銨具有較強(qiáng)的抗真菌能力，能顯著降低夏橙由酸腐菌（）引起的腐爛，主要是通過(guò)抑制酸腐菌菌絲呼吸，改變膜通透性，加劇核酸和蛋白的丟失來(lái)發(fā)揮其抗真菌活性[12]。碳酸銨與可食用涂膜如羥丙基甲基纖維素、蜂蠟等復(fù)配使用，有一定的防治果實(shí)采后病原菌侵染的效果，如可有效抑制櫻桃番茄接種灰葡萄孢菌（）后灰霉病的侵染，延長(zhǎng)果實(shí)貯藏期[13]；可降低柑橘接種焦腐病菌（）的發(fā)病率，且能保持果實(shí)品質(zhì)[14]；顯著抑制李子褐腐病菌（）的菌絲生長(zhǎng)，降低李子采后褐腐病發(fā)生率[15]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，碳酸銨能抑制柑橘意大利青霉活性[16]，但對(duì)意大利青霉的作用機(jī)制及對(duì)不同柑橘種類果實(shí)品質(zhì)的影響尚不明確。因此，本研究主要分析碳酸銨對(duì)柑橘意大利青霉抑制的可能作用機(jī)制，并評(píng)價(jià)了碳酸銨對(duì)臍橙、皇帝柑、沃柑采后腐爛和貯藏品質(zhì)的影響，為碳酸銨作為有機(jī)、安全有效的柑橘防腐保鮮劑應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

意大利青霉從具有典型青霉病癥狀的柑橘上分離而來(lái)，并接種果實(shí)，由形態(tài)學(xué)和分子手段鑒定為意大利青霉。

用無(wú)菌接種環(huán)刮取在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d的意大利青霉孢子，并將其懸浮于含有0.05%（體積分?jǐn)?shù)）Tween 80的蒸餾水中。臍橙、皇帝柑、沃柑均購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)，挑選大小相似、無(wú)機(jī)械損傷的果實(shí)，在26 ℃、相對(duì)濕度為90%～95%下貯存。碳酸銨、蔗糖、Tween等試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)制劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司，EX20Thermo Fisher）；UV-1000紫外分光光度計(jì)（上海美普達(dá)儀器有限公司，UV-1000）；掃描電鏡（日本NTC儀器公司，JSM-6390LV）；透射電鏡（日本HITACHI公司，H-7650）；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，SCIENTZ-ⅡD）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 意大利青霉孢子萌發(fā)的測(cè)定

參考熊琪等[17]的方法，分別將0.025、0.050、0.100、0.200、0.400 g/L的碳酸銨溶液與PDA培養(yǎng)基混勻，然后將培養(yǎng)基均勻涂于載玻片上，培養(yǎng)基凝固后，在載玻片兩端滴加10L孢子懸浮液（5×106個(gè)/mL），置于滅菌培養(yǎng)皿中并封口后，在26 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)，8 h后在光學(xué)顯微鏡下觀察萌發(fā)情況，使用照相機(jī)軟件（TS-View 6.2.3.2）統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率。按照公式（1）計(jì)算萌發(fā)率。

1.3.2 意大利青霉菌絲生長(zhǎng)量的測(cè)定

參考Yang等[18]方法，用涂布棒將200L 意大利青霉孢子懸浮液（1×106個(gè)/mL）均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上，于26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。打孔器（7 mm）取菌餅并將其反貼于含不同濃度碳酸銨的PDA培養(yǎng)基上，于26 ℃條件下培養(yǎng)，每24 h采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑。

1.3.3 菌絲形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的觀察

在培養(yǎng)24 h菌絲的培養(yǎng)基中，加入碳酸銨溶液使其終濃度為0.8 g/L，對(duì)照組加等量無(wú)菌水，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集菌絲，在光學(xué)顯微鏡下觀察。掃描電鏡觀察參考Yang[18]等的方法，菌絲用2.5%（體積分?jǐn)?shù)）戊二醛固定48 h，磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS，pH值7.2）洗滌3次，隨后將蓋玻片在梯度乙醇（30%、50%、70%、95%和100%，體積分?jǐn)?shù)）中脫水20 min，并在液態(tài)CO2中干燥至臨界點(diǎn)。離子濺射儀鍍膜，然后在掃描電鏡下觀察樣品。對(duì)于透射電鏡，菌絲在3%戊二醛溶液中固定過(guò)夜，用0.1 mol/L PBS清洗3次，在2%鋨酸中固定，脫水，并包埋在SPI-812環(huán)氧樹脂中。用Leica UC6超薄切片后，用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛染色，在透射電鏡下觀察切片。

1.3.4 線粒體ATPase活性測(cè)定

培養(yǎng)2 d的菌絲用0.4、0.8、1.6 g/L碳酸銨（該濃度分別為碳酸銨對(duì)意大利青霉的0.5、1、2倍的最小抑菌值（Minimal Inhibitory Concentration，MIC））處理不同時(shí)間，無(wú)菌水做對(duì)照。參考Li等[19]方法提取線粒體，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎線粒體，用購(gòu)買自南京建成生物科技公司的ATP酶活力測(cè)試盒檢測(cè)Na+/K+-ATPase、Ca2+-ATPase和Mg2+-ATPase活力。

1.3.5 菌絲H2O2含量的測(cè)定

參考Sagisaka[20]的方法，稱取1 g菌絲于玻璃勻漿器中，并加入4 mL PBS（pH值 7.5）于冰浴中進(jìn)行研磨，然后加入2.8 mL 5%（體積分?jǐn)?shù)）的三氯乙酸，混勻后于10 000 r/min離心10 min。取1.6 mL上清液于試管中，加入0.2 mL的硫氰酸鉀（2.5 mol/L）、0.4 mL的硫酸亞鐵銨（10 mmol/L）、0.4 mL 50%（體積分?jǐn)?shù)）的三氯乙酸，混勻，于480 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.3.6 H2O2清除劑對(duì)病原菌保護(hù)作用的評(píng)價(jià)

參考張美紅等[21]方法，并作適當(dāng)修改。將碳酸銨溶液加入到滅菌PDA培養(yǎng)基中，使其終質(zhì)量濃度為0.2 g/L，并在培養(yǎng)基加入半胱氨酸，使其終濃度分別為0、5、10、20 mmol/L，將PDA培養(yǎng)基平鋪在載玻片上，置于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基凝固后，在兩端各滴加10L孢子懸浮液（5×106個(gè)/mL），用封口膠密封后置于26 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)10 h時(shí)用顯微鏡觀察孢子萌發(fā)。

1.3.7 還原型谷胱甘肽含量的測(cè)定

培養(yǎng)2 d的菌絲體過(guò)濾后稱取0.5 g左右加入10 mL 的生理鹽水，用組織勻漿器研磨均勻。在4 ℃、4 000×下離心 10 min，取上清，用購(gòu)買自南京建成生物科技公司的谷胱甘肽試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.3.8 抗氧化酶活性的測(cè)定

酶活測(cè)定參考包斯琴等[22]的方法，并稍作修改。取1 g培養(yǎng)24 h的菌絲加入3 mL的PBS（0.05 mol/L，pH值7.2）在冰浴中研磨，于10 000 r/min、4 ℃離心20 min，上清即為提取的粗酶液。過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）活性采用H2O2分解法測(cè)定；超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性測(cè)定采用核黃素-NBT法；過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，酶活單位均用U/mg表示。

1.3.9 碳酸銨對(duì)接種病菌果實(shí)腐爛的影響

參考Ji等[23]方法，略有修改。將柑橘果實(shí)在0.2%（體積分?jǐn)?shù)）次氯酸鈉溶液中浸泡2 min，用蒸餾水清洗兩次，自然晾干后，在果實(shí)赤道部位造傷傷口，分別接種20L質(zhì)量濃度為4、8、16 g/L的碳酸銨溶液（碳酸銨濃度根據(jù)活體試驗(yàn)的預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定），無(wú)菌水為對(duì)照。在室溫下自然晾干后，在造傷處繼續(xù)接種20L 1×106個(gè)/mL孢子懸浮液，將果實(shí)密封于保鮮盒中，置于26 ℃培養(yǎng)箱中，每日觀察病斑變化并測(cè)定病斑直徑。

1.3.10 柑橘果實(shí)貯藏品質(zhì)的測(cè)定

將大小均勻的健康果實(shí)用蒸餾水清洗干凈后，再將果實(shí)分別在質(zhì)量濃度為4、8、16 g/L的碳酸銨溶液中浸泡處理10 min，蒸餾水作對(duì)照。自然晾干后，將柑橘儲(chǔ)存于保鮮袋中，并置于26 ℃培養(yǎng)箱中，定期取樣，分析失重率、腐爛率和品質(zhì)指標(biāo)。

果實(shí)的失重率采用稱重法測(cè)定，腐爛率采用統(tǒng)計(jì)方法分析，色澤采用3nh分光測(cè)色計(jì)測(cè)定果實(shí)色澤變化；采用WYT-J手持糖度計(jì)測(cè)定柑橘果汁中可溶性固形物含量；2，6-二氯酚靛酚法測(cè)定柑橘維生素C含量；可滴定酸含量的測(cè)定參考Vilaplana等[24]所用的酸堿滴定法。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)進(jìn)行3次平行，3次重復(fù)。數(shù)據(jù)用Excel繪圖并用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳酸銨對(duì)孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)的影響

碳酸銨處理對(duì)意大利青霉孢子萌發(fā)有顯著影響，如圖1a所示，隨著處理濃度的增加，孢子萌發(fā)率降低，質(zhì)量濃度為0.200 g/L時(shí)，抑制效果顯著（<0.05），孢子萌發(fā)率為36.6%，而在0.400 g/L時(shí)，未見(jiàn)孢子萌發(fā)。碳酸銨對(duì)意大利青霉的菌絲生長(zhǎng)速率的影響如圖1b所示，隨著碳酸銨濃度的增加，意大利青霉生長(zhǎng)速率逐漸降低，菌落直徑逐漸減小，碳酸銨質(zhì)量濃度達(dá)到0.8 g/L時(shí)，在培養(yǎng)5 d內(nèi)，未觀察到意大利青霉菌絲的生長(zhǎng)。

2.2 碳酸銨對(duì)菌絲形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的影響

碳酸銨對(duì)意大利青霉菌絲形態(tài)的影響如圖2所示，在光學(xué)顯微鏡下觀察到，對(duì)照組的菌絲生長(zhǎng)繁盛，分支較多，碳酸銨處理后，菌絲生長(zhǎng)節(jié)點(diǎn)較少，幾乎無(wú)分支；進(jìn)一步通過(guò)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，未處理的菌絲表面光滑且大小均勻，而處理后的菌絲干癟彎曲且有明顯的褶皺。這說(shuō)明碳酸銨處理導(dǎo)致意大利青霉菌絲形態(tài)被破壞。通過(guò)透射電鏡觀察菌絲的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，碳酸銨對(duì)菌絲線粒體影響較明顯，對(duì)照組菌絲內(nèi)部線粒體結(jié)構(gòu)完整，且分布均勻，有膨大的嵴，排列整齊，而0.8 g/L碳酸銨導(dǎo)致線粒體嚴(yán)重變形，外膜斷裂，線粒體基質(zhì)透明化且有部分線粒體已經(jīng)溶解，這表明碳酸銨處理嚴(yán)重破壞了意大利青霉線粒體的結(jié)構(gòu)。

2.3 碳酸銨對(duì)線粒體ATPase活性的影響

碳酸銨處理后，3種ATP酶活性變化如圖3所示，在處理12 h內(nèi)，0.4 g/L碳酸銨處理組的Na+/K+-ATPase、Mg2+-ATPase活力都有上升趨勢(shì)，而Ca2+-ATPase活性整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，處理12 h后，3種ATP酶活都顯著降低（<0.05），并表現(xiàn)出濃度劑量效應(yīng)，1.6 g/L碳酸銨處理組3種ATP酶活分別下降至0.073、0.109和0.146 U/mg。這表明碳酸銨處理破壞了線粒體ATPase活性，從而引起線粒體能量代謝障礙。

2.4 碳酸銨對(duì)H2O2含量的影響

H2O2被認(rèn)為是活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的主要化合物之一，主要在線粒體中產(chǎn)生。碳酸銨對(duì)意大利青霉H2O2的影響如圖4所示，碳酸銨處理組的H2O2含量明顯高于對(duì)照組，在處理6 h時(shí)，0.8 g/L碳酸銨處理組的H2O2含量為對(duì)照的1.85倍。結(jié)果表明，碳酸銨處理導(dǎo)致H2O2積累，進(jìn)一步可能會(huì)導(dǎo)致線粒體損傷。

2.5 碳酸銨對(duì)還原型谷胱甘肽含量和谷胱甘肽還原酶活力的影響

碳酸銨處理對(duì)細(xì)胞中還原型谷胱甘肽（Reduced Glutathione，GSH）含量的影響如圖5a所示，隨著處理時(shí)間的增加，GSH水平顯著下降（<0.05），且呈濃度依賴性，在處理6 h時(shí)，碳酸銨處理組GSH含量分別下降至1.087、0.472、0.425 mg/g，與對(duì)照組8.370 mg/g相比，均顯著降低（<0.05），這意味著谷胱甘肽已不能及時(shí)清除機(jī)體內(nèi)過(guò)量的活性氧。碳酸銨處理降低了谷胱甘肽還原酶（Glutathione Reductase，GR）活性。如圖5b所示，碳酸銨處理6 h時(shí)，對(duì)照組和1.6 g/L碳酸銨處理組的GR活力分別為558.86、65.14 U/g，這表明碳酸銨處理導(dǎo)致GR活力降低，GR無(wú)法正常催化GSSG還原成GSH，從而導(dǎo)致機(jī)體中的活性氧無(wú)法及時(shí)清除。

2.6 碳酸銨對(duì)抗氧化酶活性的影響

碳酸銨對(duì)菌絲抗氧化酶的影響如圖6所示，隨著碳酸銨濃度的增加，CAT酶活出現(xiàn)上升趨勢(shì)，而POD和SOD酶活則有相反的結(jié)果，隨著碳酸銨濃度的增加，POD和SOD酶活逐漸減小。在處理3 h內(nèi)，0.8和1.6 g/L的碳酸銨處理組的POD酶活分別降低到0.22和0.19 U/mg。結(jié)果表明碳酸銨破壞了意大利青霉抗氧化酶系的平衡，機(jī)體內(nèi)活性氧無(wú)法及時(shí)清除。

2.7 H2O2清除劑對(duì)孢子萌發(fā)的保護(hù)作用

半胱氨酸是有效的H2O2清除劑，對(duì)孢子萌發(fā)的保護(hù)作用如圖7所示，僅添加碳酸銨的孢子萌發(fā)率為24.58%，添加一定濃度的半胱氨酸后，孢子萌發(fā)率有所提高，培養(yǎng)基添加5 mmol/L半胱氨酸后，孢子的萌發(fā)率為31.85%，再次印證碳酸銨至少部分通過(guò)導(dǎo)致病原菌活性氧積累來(lái)發(fā)揮抗真菌活性。

2.8 碳酸銨對(duì)接種病菌果實(shí)腐爛程度的影響

柑橘接種意大利青霉5 d后，果實(shí)腐爛的變化如圖8所示，經(jīng)過(guò)碳酸銨浸泡處理后的臍橙、皇帝柑及沃柑的病斑直徑均小于對(duì)照組，在16 g/L的碳酸銨處理下，臍橙、皇帝柑、臍橙的病斑直徑分別為對(duì)照組的49.2%、48.1%、62.7%，這表明柑橘果實(shí)經(jīng)過(guò)碳酸浸泡處理后，可以顯著抑制意大利青霉病菌在柑橘果實(shí)上的擴(kuò)散（<0.05）。

2.9 碳酸銨處理對(duì)柑橘自然腐爛率的影響

碳酸銨處理對(duì)柑橘果實(shí)自然腐爛的影響如圖9所示，與對(duì)照相比，碳酸銨處理有效降低了3種柑橘的腐爛率。貯藏30 d后，16 g/L的碳酸銨處理下，臍橙、皇帝柑及沃柑的果實(shí)腐爛率與對(duì)照相比，分別降低了48.02%、29.78%、29.17%。試驗(yàn)表明碳酸銨可有效降低柑橘果實(shí)腐爛率，特別是16 g/L的碳酸銨作用效果較好。

2.10 碳酸銨對(duì)柑橘貯藏品質(zhì)的影響

碳酸銨對(duì)3種柑橘品質(zhì)的影響如表1所示，貯藏30 d后，3種品類的柑橘果實(shí)質(zhì)量較貯藏前均有所降低，碳酸銨處理后，臍橙失重率低于對(duì)照組，且呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)；而對(duì)沃柑有相反的趨勢(shì)，碳酸銨處理導(dǎo)致沃柑失重率增加；4 g/L碳酸銨使皇帝柑失重率增加，16 g/L碳酸銨處理減小了其失重率。貯藏結(jié)束后，對(duì)照組與處理組的柑橘果實(shí)可溶性固形物含量無(wú)明顯變化。柑橘的維生素C含量較貯藏前有所降低，碳酸銨處理組的沃柑和臍橙的維生素C含量較對(duì)照組略高，且8 g/L處理組的維生素C含量相對(duì)較高，而處理組的皇帝柑的維生素C含量較對(duì)照組略低，說(shuō)明適當(dāng)濃度的碳酸銨處理可以抑制沃柑、臍橙果實(shí)維生素C的降解，且對(duì)沃柑的作用效果較好。碳酸銨處理的沃柑可滴定酸含量略低于對(duì)照組，而對(duì)于臍橙、皇帝柑，碳酸銨處理使其可滴定酸含量略有增加。16 g/L碳酸銨處理使臍橙和皇帝柑的還原糖含量略有降低，而沃柑還原糖含量略有增加。貯藏30 d后，處理組的3種柑橘的*、*、*值與對(duì)照組相比，變化較小，這表明碳酸銨處理對(duì)柑橘色澤無(wú)不利影響。

表1 碳酸銨處理對(duì)臍橙、皇帝柑、沃柑果實(shí)貯藏30 d后理化指標(biāo)的影響

注：同種柑橘品質(zhì)同列間相互比較，具有不同標(biāo)記字母的為差異性顯著（＜0.05）。

Note: Citrus quality attributors are compared with each other within the same column and those with different labeled letters are considered significant (<0.05).

3 討 論

全世界對(duì)合成殺菌劑相關(guān)健康風(fēng)險(xiǎn)認(rèn)識(shí)的不斷提高，促使研究人員探索新的、更安全的天然抗菌劑和食品保鮮劑產(chǎn)品[25]。在本項(xiàng)研究中，碳酸銨作為通常認(rèn)為安全的藥劑，可以有效抑制體外和柑橘上意大利青霉的生長(zhǎng)（<0.05），降低柑橘在貯藏期間的腐爛率（<0.05），并且對(duì)柑橘品質(zhì)無(wú)不良影響，儲(chǔ)藏結(jié)束后，幾乎聞不到氨臭味。結(jié)果表明碳酸銨是一種安全有效的柑橘采后病害的控制方法。

目前多數(shù)研究表明，鹽類可以抑制病原菌的分生孢子萌發(fā)、芽管伸長(zhǎng)[7-9]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，0.4 g/L碳酸銨可以完全抑制意大利青霉的孢子萌發(fā)（圖1），通過(guò)光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，碳酸銨處理導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)異常，出現(xiàn)褶皺，塌陷且不規(guī)則分支（圖2），與NO熏蒸對(duì)意大利青霉菌絲形態(tài)的影響一致[26]，這些結(jié)果均表明意大利青霉在抗真菌藥物的作用下，菌絲形態(tài)可能會(huì)受到破壞。

線粒體作為細(xì)胞進(jìn)行呼吸的主要細(xì)胞器，其結(jié)構(gòu)的完整性與生物的生命活動(dòng)密切相關(guān)。Li等[19]研究發(fā)現(xiàn)茶樹油通過(guò)影響灰葡萄孢菌的線粒體來(lái)抑制病原菌的生長(zhǎng)，最直觀的表現(xiàn)為線粒體的結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致外膜破裂，空泡化及囊泡出現(xiàn)。在本研究中有類似的結(jié)果，通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)碳酸銨導(dǎo)致意大利青霉菌絲線粒體結(jié)構(gòu)異常，外膜斷裂，這表明意大利青霉線粒體可能是碳酸銨作用的重要靶點(diǎn)，碳酸銨處理導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)破壞，進(jìn)一步可能影響線粒體功能（圖2）。ATPase是大多數(shù)生物膜中普遍存在的質(zhì)子泵，在能量代謝中起重要作用，可以維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，為物質(zhì)的運(yùn)輸和能量的轉(zhuǎn)換提供驅(qū)動(dòng)力，還能平衡pH值，維持膜電位[27]。Ju等[28]研究發(fā)現(xiàn)在檸檬醛的處理下，婁地青霉（）的Na+/K+-ATPase、Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase活性均顯著下降，進(jìn)一步導(dǎo)致能量代謝水平降低，表明檸檬醛可以通過(guò)破壞婁底青霉的ATPase活性發(fā)揮其抗真菌活性。在本研究中發(fā)現(xiàn)，1.6 g/L碳酸銨處理導(dǎo)致意大利青霉線粒體的3種ATPase活性顯著降低（<0.05）（圖3），這表示線粒體正常功能被破壞，也將會(huì)引起能量代謝失調(diào)。

活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）積累會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)，蛋白質(zhì)，碳水化合物以及核酸的損傷[29]，線粒體是ROS的主要來(lái)源，因此線粒體易受到ROS的攻擊而發(fā)生氧化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)功能失調(diào)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，碳酸銨導(dǎo)致意大利青霉H2O2含量的增加（圖4），H2O2是ROS的主要類型，表明碳酸銨處理引起意大利青霉菌絲活性氧累積，而導(dǎo)致線粒體氧化損傷，與硼酸處理導(dǎo)致芒果炭疽菌（）孢子中ROS積累而導(dǎo)致線粒體功能障礙的結(jié)果一致[30]。半胱氨酸是有效的活性氧清除劑，筆者研究發(fā)現(xiàn)，添加5 mmol/L半胱氨酸時(shí)，可以明顯提高碳酸銨處理的意大利青霉菌孢子萌發(fā)率（圖7），再次印證了碳酸銨通過(guò)導(dǎo)致菌絲活性氧積累發(fā)揮抗真菌活性。

抗氧化酶及還原型谷胱甘肽（GSH）是細(xì)胞內(nèi)是重要的抗氧化劑和自由基清除劑，谷胱甘肽還原酶（GR）可以催化氧化型谷胱甘肽（GSSG）還原成GSH。Park[31]研究發(fā)現(xiàn)外源性H2O2處理肺癌細(xì)胞，可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS積累，CAT活性提高，SOD活性降低，且造成GSH含量的下降，表明通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞ROS積累，導(dǎo)致抗氧化酶系統(tǒng)失衡是H2O2抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的重要途徑。在本研究中有類似的結(jié)果，碳酸銨處理降低了菌絲內(nèi)GSH含量及GR活力（圖5），同時(shí)CAT活性提高，SOD、POD活性降低（圖6），這表明細(xì)胞中抗氧化系統(tǒng)平衡被打破，無(wú)法清除過(guò)量的ROS 而出現(xiàn)不可逆的反應(yīng)，最終也會(huì)導(dǎo)致線粒體功能喪失。

在活體試驗(yàn)中，碳酸銨處理可以降低臍橙、皇帝柑、沃柑上接種病原菌的擴(kuò)散，皇帝柑經(jīng)16 g/L碳酸銨的處理后，接種孢子懸浮液5 d后的果實(shí)病斑直徑僅為對(duì)照的48.1%（圖8）。Zhang等[32]研究發(fā)現(xiàn)，梨經(jīng)過(guò)1.22 mmol/L 的2-苯乙基異硫氰酸酯處理后，接種鏈格孢菌（）7 d后的病斑直徑僅為對(duì)照的39%，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。保鮮劑的保鮮效果還要考慮果蔬的生理生化指標(biāo)變化。Fagundes等[13]發(fā)現(xiàn)丙酸鈉、硼酸鉀、磷酸銨和碳酸銨等鹽類涂膜的使用不會(huì)對(duì)櫻桃番茄果實(shí)的呼吸速率、硬度、顏色、感官風(fēng)味和外觀產(chǎn)生不利影響，在本研究中同樣發(fā)現(xiàn)，碳酸銨處理可以有效降低3種柑橘在貯藏期間的腐爛率（圖9），且對(duì)3種柑橘的營(yíng)養(yǎng)成分無(wú)不利影響（表1）。

4 結(jié) 論

1）通過(guò)孢子萌發(fā)試驗(yàn)和菌餅生長(zhǎng)試驗(yàn)，證實(shí)0.4 g/L碳酸銨處理可以完全抑制孢子萌發(fā)，0.8 g/L碳酸銨可以完全抑制菌絲生長(zhǎng)。

2）碳酸銨處理會(huì)破壞意大利青霉菌絲的正常形態(tài)及線粒體結(jié)構(gòu)，降低線粒體ATPase活性，造成H2O2積累，還原型谷胱甘肽（Reduced Glutathione，GSH）含量及谷胱甘肽還原酶（Glutathione Reductase，GR）活性降低，抗氧化系統(tǒng)平衡被破壞。

3）16 g/L的碳酸銨處理可以顯著降低柑橘的自然腐爛率，貯藏30 d后，臍橙、皇帝柑、沃柑的自然腐爛率與對(duì)照相比分別降低了48.02%、29.78%、29.17%；碳酸銨處理明顯降低3種柑橘品種接種意大利青霉后的腐爛程度，并對(duì)其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)無(wú)不良影響。

研究結(jié)果表明，碳酸銨對(duì)柑橘采后致病菌意大利青霉有強(qiáng)烈的抑制作用，且碳酸銨處理對(duì)柑橘品質(zhì)無(wú)不良影響，因此，碳酸銨處理有望進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為綠色、安全、有效的防治柑橘采后腐爛的技術(shù)方法。

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Mechanism of ammonium carbonate onand its effect on the quality of different citrus fruits

Xu Jinjuan, Yang Shuzhen※, Zhang Meihong, Li Xiaoying, Peng Litao※

(430070,)

Citrus is susceptible to infection by a variety of fungi during storage and transportation, leading to severe economic loss.is one of two major postharvest diseases of citrus fruits, causing blue mold. It is crucial to seek a safe and effective way to replace or reduce the use of synthetic fungicides for health and environmental concerns. Since the ammonium carbonate can be expected to inhibitactivity in recent years, it still remains unknown on the specific mechanism and the effect on the fruit quality of different citrus species. Taking the “Navel” orange, “Tribute” citrus, and “Fertile” orange as the research objects, this study aims to investigate the antifungal activity of ammonium carbonate againstcausing blue mold in fruits via interfering reactive oxygen metabolism. A possible mechanism of ammonium carbonate was also clarified to evaluate the storage qualities under the safe and limited growth ofafter treatment. Scanning and Transmission Electron Microscope (SEM/TEM) were utilized to characterize the mycelial morphology and mitochondrial structure. The mitochondrial ATPase activities and H2O2content were also measured to determine the inhibition of substances against the pathogens. Furthermore, the activity of antioxidant enzymes and the content of reduced glutathione were measured to further clarify the effect of ammonium carbonate on the accumulation of Reactive Oxygen Species (ROS). In addition, an in-vivo experiment was carried out to explore the effects of ammonium carbonate on the storage quality, such as soluble solids, vitamin C, titratable acid, reducing sugar, and color of citrus. The results showed that ammonium carbonate greatly inhibited the spore germination and mycelial growth ofin a dose-dependent manner. Specifically, ammonium carbonate at 0.4 and 0.8 g/L completely inhibited the spore germination and mycelial growth, respectively. The morphology observation showed that ammonium carbonate caused the growth of mycelia with sparse nodes and fewer branches. Ultrastructural observation showed that the hypha was seriously shrunk to the abnormal structure of mitochondria. Physiological and biochemical analysis indicated that ammonium carbonate treatment caused the decrease of Na+/K+-ATPase, Ca2+-ATPase, and Mg2+-ATPase activities in the mitochondria of hypha, further resulted in the loss of reduced glutathione content and glutathione reductase activity, concurrently interrupted the balance of Superoxide Dismutase (SOD), Catalase (CAT) and Peroxidase (POD) activities in the scavenging system of ROS, and finally to promote the H2O2accumulation in hypha of. Nevertheless, the addition of Cysteine (Cys), a scavenger of ROS, partially restored the spore germination that inhibited by ammonium carbonate. In vivo test, 16 g/L ammonium carbonate treatment significantly reduced the lesion diameter of citrus fruits inoculated with(<0.05), and then alleviated the disease severity in “Novel” orange, “Tribute” citrus, and “Fertile” orange. Correspondingly, the ammonium carbonate treatment can be expected to reduce the natural disease incidence without adverse effects on fruit weight loss, color, and quality parameters, including soluble solids, titratable acid, vitamin C, and reducing sugar contents. These results demonstrated that ammonium carbonate can be used to damage the mitochondrial structure and function of, thereby promoting the accumulation of ROS for the antifungal activity. The powerful antifungal activity of ammonium carbonate againstcan offer great potential application in control of postharvest decay of citrus fruits.

storage; quality control;; mitochondrion; ammonium carbonate; Reactive Oxygen Species (ROS); action mechanism; citrus

許金娟，楊書珍，張美紅，等. 碳酸銨對(duì)意大利青霉的作用機(jī)制及對(duì)不同柑橘果實(shí)品質(zhì)的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2021，37(15)：299-307.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.15.035 http://www.tcsae.org

Xu Jinjuan, Yang Shuzhen, Zhang Meihong, et al. Mechanism of ammonium carbonate onand its effect on the quality of different citrus fruits[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(15): 299-307. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.15.035 http://www.tcsae.org

2021-06-04

2021-08-01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31871850）

許金娟，研究方向?yàn)楣哔A藏與保鮮。Email：2498780612@qq.com

彭麗桃，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楣哔A藏保鮮。Email：penglt12@mail.hzau.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.15.035

TS255.1

A

1002-6819(2021)-15-0299-09