陳海燕，程仕群，胡騰鑫，酈明浩

廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院（佛山 528300）

蜜蜂在我國有著悠久的養(yǎng)殖歷史，蜜蜂生產(chǎn)出的蜂蜜是人們?nèi)粘Ｉ钪兄鲃訑z入糖的主要來源，同時又可以用于食物保存，因此在很早以前就被廣泛使用[1-2]。蜂蜜作為治療和保健食品，已有悠久的歷史[3]。1 800年前，張仲景將蜂蜜用于治療多種疾病，明代的李時珍在《本草綱目》中列舉用蜂蜜治病的處方20余處[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，蜂蜜外用可以治療凍傷、凍瘡[5]，護唇及治療口腔疾病、舒緩干燥，治療皸裂、燒燙傷、蚊蟲叮咬、皮膚潰瘍、鼻炎[6]及外傷，養(yǎng)顏美容等[7-8]；蜂蜜內(nèi)服可以緩解痛經(jīng)[9]、治療便秘和調(diào)節(jié)胃腸功能[10-12]、治療支氣管炎[13]、咳嗽[14]等。蜂蜜因多用途深受消費者喜歡，但天然蜂蜜成本高，部分不良商家以次充好來欺騙消費者牟取暴利[15-16]，天然蜂蜜中含有的化學(xué)物質(zhì)主要為糖類，占蜂蜜質(zhì)量的60~80 g/100 g[17-18]，蔗糖含量不得超過5 g/100 g，而部分不良商家主要是摻入糖類物質(zhì)來冒充天然蜂蜜，因此準確測定蜂蜜中糖含量尤為重要[19-20]。

蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖的檢測方法主要是GB 5009.8—2016《食品安全國家標準 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》高效液相色譜法（high performance liquid chromatography HPLC）。按照GB 14963—2011《食品安全國家標準 蜂蜜》規(guī)定果糖和葡萄糖含量≥60 g/100 g，蔗糖含量≤5 g/100 g（野桂花蜜≤10 g/100 g），根據(jù)檢測經(jīng)驗，不少蜂蜜產(chǎn)品果糖和葡萄糖含量在60±10 g/100 g，處于臨界值附近，而對于果糖、葡萄糖、蔗糖這3種物質(zhì)在蜂蜜中的穩(wěn)定性研究尚少。試驗從溫度、水浴時間、pH等樣品前處理研究3種糖在蜂蜜前處理過程中及樣品處理后不同儲存時間的穩(wěn)定性，為試驗過程中選取最優(yōu)穩(wěn)定性條件及最長儲存時間進行相關(guān)物質(zhì)測定時提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

果糖（99.70%，德國DR Ehrenstorfer公司）；葡萄糖（99.7%，美國TM Standard公司）；蔗糖（99.9%，中國北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）；乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）；甲醇（色譜純，美國TEDIA公司）；鹽酸（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；氫氧化鈉（分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

試樣來自各大商超及農(nóng)貿(mào)市場。

LC-20 AT高效液相色譜儀，配蒸發(fā)光散射檢測器（日本島津公司）；JJ500Y電子天平（常熟市金羊砝碼儀器有限公司）；EYELA SB-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化公司）；IKA MS3漩渦混合器（德國IKA公司）；JP-0600超聲波清洗機（廣州吉普超聲波電子設(shè)備有限公司）；Milli-Q超純水純化系統(tǒng)（美國Millipore公司）；0.22 μm水系濾膜（天津津滕公司）；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市億能實驗儀器廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

Shodex Asahipak NH2P-50 4E色譜柱（4.6 mm×250 mm，10 μm）；流動相，80 g/100 g乙腈（A）-20 g/100 g水（B）；流速1.0 mL/min；進樣體積20 μL；柱溫40 ℃。蒸發(fā)光散射檢測器條件：飄移管溫度80~90 ℃；氮氣壓力350 kPa；撞擊器為關(guān)。

1.2.2 單因素試驗設(shè)計

1.2.2.1 溫度對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖穩(wěn)定性的影響

取7份樣品，水浴溫度分別為40，50，60，70，80，90和100 ℃，水浴30 min待蜂蜜晶體溶解。稱取樣品，用蒸餾水溶解稀釋至合適的上機濃度過水系濾膜、上機檢測。此條件下pH 7、水浴時間30 min，研究不同溫度對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖穩(wěn)定性的影響。

1.2.2.2 水浴時間對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖穩(wěn)定性的影響

取5份樣品，水浴時間分別為20，30，40，50和60 min，水浴溫度40 ℃，取樣上機測試試樣中果糖、葡萄糖、蔗糖含量。此條件下溫度40 ℃、pH 7，研究不同水浴時間對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖穩(wěn)定性的影響。

1.2.2.3 pH對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖穩(wěn)定性的影響

分別用1 mol/L鹽酸和1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，分別制成pH 2，5，7，9和12的溶液。取5份樣品，分別用pH 2，5，7，9和12的溶液溶解別稀釋釋至合適的濃度過水系濾膜上機測定試樣中果糖、葡萄糖、蔗糖含量。此條件下溫度40 ℃、水浴時間30 min，研究不同pH對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖穩(wěn)定性的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計

采用Box-Behnken模型，對影響蜂蜜果糖和葡萄糖、蔗糖含量的3個因素（溫度、水浴時間、pH）進行優(yōu)化設(shè)計，響應(yīng)面試驗因素水平詳見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表

1.2.4 儲存時間對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖穩(wěn)定性的影響

取11份樣品，設(shè)定溫度60 ℃，水浴30 min后用水溶解稀釋至適合上機的濃度，室溫放置0，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8和9 d，取樣上機測試試樣中果糖、葡萄糖、蔗糖含量。此條件下室溫溫度25 ℃、pH 7，研究儲存時間對蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖穩(wěn)定性的影響。

1.3 統(tǒng)計方法

每組試驗均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。響應(yīng)面設(shè)計及優(yōu)化分析利用Design-Expert 8.0.6軟件，顯著性分析利用Excel 2003軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制及試驗檢測

分別準確稱取5.000 0 g果糖、葡萄糖、蔗糖，溶于水，移入5 mL容量瓶中，加一級水至刻度，混勻，此時溶液中果糖、葡萄糖、蔗糖質(zhì)量濃度1 000.0 mg/mL，用一級水繼續(xù)稀釋成質(zhì)量濃度為500.0，200.0，100.0和50.0 mg/mL的標準使用液。過水系濾膜上機繪制標準曲線。標準圖譜見圖1，3種化合物的回歸方程、線性范圍及檢出限標準曲線見表2。結(jié)果顯示，試樣樣品中果糖質(zhì)量分數(shù)為35.5 g/100 g，葡萄糖質(zhì)量分數(shù)為30.4 g/100 g，蔗糖質(zhì)量分數(shù)為1.88 g/100 g。

圖1 果糖、葡萄糖、蔗糖標準品液相圖譜

表2 果糖、葡萄糖、蔗糖回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 溫度對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖穩(wěn)定性的影響

蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖質(zhì)量分數(shù)在40，50，60，70，80，90和100 ℃，水浴時間30 min，pH 7條件下處理結(jié)果見圖2。

由圖2可知：溫度對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖質(zhì)量分數(shù)穩(wěn)定性有影響；果糖和葡萄糖、蔗糖這3種糖在溫度60 ℃以上檢出含量開始減少，溫度越高，果糖和葡萄糖質(zhì)量分數(shù)檢出越少，因此，水浴蜂蜜中結(jié)晶時溫度宜在60 ℃以下，考慮到水浴鍋升高至60 ℃耗時耗能，故設(shè)置溫度40 ℃。

圖2 溫度對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖質(zhì)量分數(shù)的影響

2.2.2 水浴時間對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖穩(wěn)定性的影響

蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖質(zhì)量分數(shù)在水浴時間20，30，40，50和60 min，溫度40 ℃，pH 7條件下處理結(jié)果見圖3。

由圖3可知：水浴時間對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖質(zhì)量分數(shù)穩(wěn)定性有影響；果糖和葡萄糖、蔗糖質(zhì)量分數(shù)隨著水浴時間的延長有減少趨勢，因此選定水浴時間30 min。

圖3 水浴時間對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖質(zhì)量分數(shù)的影響

2.2.3 pH對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖穩(wěn)定性的影響

蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖質(zhì)量分數(shù)在pH 2，5，7，9和12環(huán)境中處理結(jié)果見圖4。

由圖4可知：pH對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖質(zhì)量分數(shù)穩(wěn)定性有影響；在酸性和堿性環(huán)境下均為減少趨勢，pH 7環(huán)境下蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖質(zhì)量分數(shù)檢出最高，因此選定pH 7。

圖4 pH對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖穩(wěn)定性的影響

2.3 蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖質(zhì)量分數(shù)響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

綜合單因素試驗結(jié)果：溫度、水浴時間和pH對蜂蜜中果糖和葡萄糖、蔗糖含量穩(wěn)定性有影響，選取溫度、pH、水浴時間3個因素進行響應(yīng)面試驗設(shè)計。采用Box-Behnken模型優(yōu)化設(shè)計提取工藝條件，響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表3，果糖和葡萄糖質(zhì)量分數(shù)回歸方程方差分析見表4，蔗糖質(zhì)量分數(shù)回歸方程方差分析見表5。

表3 Box-Behnken設(shè)計方案及試驗結(jié)果

由表4可見：模型極顯著（p＜0.01），說明該模型可以預(yù)測蜂蜜中果糖和葡萄糖質(zhì)量分數(shù)最優(yōu)穩(wěn)定性條件。A、B、A2、B2、C2對果糖和葡萄糖質(zhì)量分數(shù)影響顯著（p＜0.05），C、AB、AC、BC 對果糖和葡萄糖質(zhì)量分數(shù)的影響不顯著；3個條件對果糖和葡萄糖質(zhì)量分數(shù)穩(wěn)定（C）C pH。

表4 果糖和葡萄糖質(zhì)量分數(shù)的回歸方程方差分析

由表5可見：模型極顯著（p＜0.01），說明該模型可以預(yù)測蜂蜜中蔗糖質(zhì)量分數(shù)最優(yōu)穩(wěn)定性條件；A、B、C、BC、A2、B2、C2對蔗糖質(zhì)量分數(shù)影響顯著（p＜0.05），AB、AC對蔗糖質(zhì)量分數(shù)的影響不顯著；3個條件對蔗糖質(zhì)量分數(shù)穩(wěn)定性影響大小順序為（A）溫度＞（B）水浴時間＞（C）pH。

2.3.2 各因素間的交互作用對果糖和葡萄糖、蔗糖質(zhì)量分數(shù)的影響

等高線變化越密集，說明該因素對響應(yīng)值影響越大。響應(yīng)面曲線越陡，說明兩者相互作用對響應(yīng)值影響越顯著，響應(yīng)曲面越平滑，說明兩者交互作用對響應(yīng)值影響越不顯著。根據(jù)圖5~7等高線疏密程度可知，3種因素對果糖和葡萄糖影響大小順序為（A）溫度＞（B）水浴時間＞（C）pH，根據(jù)圖8~圖10，3種因素對蔗糖含量穩(wěn)定性影響大小順序為（A）溫度＞（B）水浴時間＞（C）pH。再次驗證了表4和表5的分析結(jié)果。

圖10 水浴時間和pH交互作用對蔗糖質(zhì)量分數(shù)影響的響應(yīng)面和等高線圖

表5 蔗糖質(zhì)量分數(shù)的回歸方程方差分析

圖5 溫度和水浴時間交互作用對果糖和葡萄糖質(zhì)量分數(shù)影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖6 溫度和pH交互作用對果糖和葡萄糖質(zhì)量分數(shù)影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖7 水浴時間和pH交互作用對果糖和葡萄糖質(zhì)量分數(shù)影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖8 溫度和水浴時間交互作用對蔗糖質(zhì)量分數(shù)影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖9 溫度和pH交互作用對蔗糖質(zhì)量分數(shù)影響的響應(yīng)面和等高線圖

2.3.3 響應(yīng)面試驗?zāi)Ｐ偷尿炞C

根據(jù)響應(yīng)面模型得到蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖質(zhì)量分數(shù)穩(wěn)定性最優(yōu)條件：溫度69.7 ℃、水浴時間37.4 min、pH 7.05，果糖和葡萄糖質(zhì)量分數(shù)理論值為66.474 1%，蔗糖質(zhì)量分數(shù)理論值為1.850 96%?？紤]到操作簡便、實用，確定最優(yōu)穩(wěn)定性條件：溫度70 ℃、水浴時間35 min、pH 7.0。在此條件下，進行3次驗證試驗，得出果糖、葡萄糖、蔗糖質(zhì)量分數(shù)與預(yù)測值接近。

2.4 儲存時間對蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖穩(wěn)定性的影響

蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖在0，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8和9 d儲存時間中質(zhì)量分數(shù)分別見圖11。

由圖11可知，果糖、葡萄糖、蔗糖這3種糖質(zhì)量分數(shù)在6 d之內(nèi)相對比較穩(wěn)定，隨著儲存時間延長，檢出含量就越低。有可能是隨著儲存時間增加溶液里細菌等微生物滋生，降解蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖從而影響其穩(wěn)定性，故在測定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖含量時進行樣品處理后只適合短期保存。

圖11 不同儲存時間下蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖質(zhì)量分數(shù)的變化

3 結(jié)論與討論

采用高效液相色譜法及蒸發(fā)光散射檢測器通過溫度、水浴時間、pH這3個因素試驗表明對其穩(wěn)定性都有影響。采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計法研究蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖質(zhì)量分數(shù)穩(wěn)定性的結(jié)果表明，影響果糖和葡萄糖、蔗糖穩(wěn)定性因素大小順序為溫度＞水浴時間＞pH。穩(wěn)定性最優(yōu)條件：溫度70 ℃以下，水浴時間35 min以內(nèi)，pH 7.0左右。

蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖在處理樣品后儲存時間的穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，這3種糖質(zhì)量分數(shù)隨著儲存時間延長，檢出質(zhì)量分數(shù)降低。試樣處理完畢最適宜6 d之內(nèi)果糖、葡萄糖、蔗糖質(zhì)量分數(shù)相對比較穩(wěn)定。

果糖、葡萄糖、蔗糖是蜂蜜品質(zhì)判斷的重要指標，在試驗過程中發(fā)現(xiàn)果糖、葡萄糖、蔗糖在高溫、酸或堿性環(huán)境下質(zhì)量分數(shù)會降低，有可能是因為溫度較高破壞由于糖類和羥甲基糠醛的降解，產(chǎn)生一些酸性物質(zhì)，如乙酰丙酸、甲酸、乳酸等物質(zhì)導(dǎo)致蜂蜜中糖質(zhì)量分數(shù)發(fā)生變化[21]。這樣檢測工作者在試驗過程中遇到結(jié)晶的蜂蜜試樣可用水浴待樣品全部溶解后定容，但水溫不宜過高；蜂蜜試樣、糖類標準品盡量避免在酸性或堿性環(huán)境中儲存，這就需要試驗過程中避免盛放試樣、標準品的容器殘留酸、堿性試劑以免影響試驗結(jié)果；蜂蜜試樣隨著儲存時間越長也在不斷地降低，有可能是隨著儲存時間加溶液里細菌等微生物滋生，降解果糖、葡萄糖、蔗糖。在測定蜂蜜試樣處理樣品后只適合短期保存，試樣處理后可于6 d之內(nèi)上機分析測試。若遇臨界值附近樣品有因未及時上機導(dǎo)致樣品不合格需要重新配制標準品、樣品復(fù)測。至于果糖、葡萄糖、蔗糖質(zhì)量分數(shù)減少的真實原因需要科研工作者從微生物、分子結(jié)構(gòu)或其他角度進行深層次研究，為日常檢測工作提供理論依據(jù)。