符家良 ，李春蓮，張紅楊，黃齊林，阮長(zhǎng)青 ，張東杰

1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院（大慶 163319）；2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（大慶 163319）；3.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心（大慶 163319）；4.黑龍江省雜糧加工及質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心（大慶 163319）

凝集素是具有糖專一性與血型專一性的一類蛋白質(zhì)[1]，故凝集素可與動(dòng)物消化道內(nèi)膜結(jié)合并產(chǎn)生一定的毒副作用[2-3]。近年來(lái)，凝集素的抗菌、抗蟲(chóng)及抗腫瘤等性質(zhì)開(kāi)始被國(guó)內(nèi)外學(xué)者重視，凝集素亦開(kāi)始應(yīng)用于農(nóng)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)及生化檢測(cè)領(lǐng)域[4-6]。

凝集素具有致敏劑量低、致死率高的特點(diǎn)，是蕓豆中主要的過(guò)敏原蛋白之一[7]。早年亦有因食用未徹底加熱的蕓豆而致使食物中毒的案例[8]，后經(jīng)證實(shí)其主要致病原因?yàn)槟貙?dǎo)致的毒副作用。紫花蕓豆在東北也叫飯豆、大蕓豆，含有優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，是東北常見(jiàn)的食材[9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)紫花蕓豆凝集素其活性僅次于黑豆，顯著高于其他雜豆品種，故對(duì)紫花蕓豆中的凝集素進(jìn)行提取和純化并研究其相關(guān)性質(zhì)具有必要性。

反膠束萃取作為雙水相萃取方法的一種，通過(guò)表面活性劑在有機(jī)相中形成“水池”，利用電荷相互作用使蛋白進(jìn)入反膠束“水池”中，通過(guò)改變表面活性劑類型、溶液pH、離子強(qiáng)度等參數(shù)就可以選擇性萃取蛋白[10-12]。該方法不但具有選擇性高、成本低、操作方便、易放大等優(yōu)點(diǎn)，而且避免了雙水相萃取中蛋白直接與有機(jī)相接觸而易失活的缺點(diǎn)[13]，現(xiàn)已在蛋白質(zhì)的提取中有了廣泛應(yīng)用[14-16]，但使用反膠束萃取法萃取凝集素的相關(guān)文獻(xiàn)則罕見(jiàn)。

試驗(yàn)利用反膠束萃取對(duì)課題組前期的紫花蕓豆凝集素粗提液進(jìn)行分離純化，探究反膠束萃取應(yīng)用于凝集素純化的可行性，以期得到一種高效的凝集素純化方法，為后續(xù)研究工作的開(kāi)展提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

紫花蕓豆，黑龍江省哈爾濱市王崗鎮(zhèn)新立村；4%兔紅細(xì)胞，廣州鴻泉生物科技有限公司；牛血清蛋白（生化試劑純），上海源葉生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

FA2204B電子天平（上海天美天平儀器有限公司）；CTH1850R高速冷凍離心機(jī)（湖南湘立科學(xué)儀器有限公司）；723N可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司制造）；PHS-3C pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；HZQ-C氣浴恒溫振蕩器（常州金壇良友儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

根據(jù)前期研究，對(duì)原料粉碎，得到粒徑0.25 mm的粉末，以PBS為浸提液，控制條件為超聲功率300 W、微波功率300 W、提取時(shí)間30 min，提取后離心取上清液，得凝集素粗提液，其凝血活性為78 251.78 HU/mg。

1.2.2 萃取流程

樣品粗提液→前萃取→離心→有機(jī)相→后萃取→離心→水相→透析凍干

1.2.3 單因素試驗(yàn)

根據(jù)何述棟[17]的研究方法，參照設(shè)計(jì)反膠束萃取凝集素的單因素試驗(yàn)，控制反膠束水分含量25%，以前萃取丁二酸二辛酯磺酸鈉（AOT）濃度、前萃取離子強(qiáng)度、前萃取pH、前萃取時(shí)間、后萃取離子強(qiáng)度、后萃取pH為自變量，以蛋白回收率和純化倍數(shù)為因變量進(jìn)行單因素試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用軟件Design-Expert.V8.0.6設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

1.2.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定前萃取離子強(qiáng)度50 mmol/L、萃取時(shí)間20 min，以前萃取pH、前萃取AOT濃度、后萃取pH、后萃取離子強(qiáng)度為因素，利用Design-Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表

1.2.5 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

使用Folin-酚法測(cè)定蛋白含量[18]。

1.2.6 血凝活性測(cè)定

參照孫冊(cè)等[1]與陳靖宜[19]的方法，由于方法中所用的最大凝血倍數(shù)和半數(shù)凝血倍數(shù)帶有較強(qiáng)的主觀意識(shí)，不易準(zhǔn)確判斷，故試驗(yàn)采用使紅細(xì)胞全部凝結(jié)的最大稀釋倍數(shù)為指標(biāo)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。凝血活性（HA，HU/mg）表示每毫克凝集素的活性單位，按式（1）計(jì)算，以該公式計(jì)算所得的凝集素活性亦可對(duì)凝集素的提取率進(jìn)行表示。

式中：n為紅細(xì)胞全部凝結(jié)的最大稀釋倍數(shù)；Cpr為粗提液蛋白濃度，mg/mL，按1.2.5中方法測(cè)定；V為每孔粗提液體積，50 μL。

1.2.7 蛋白回收率和純化倍數(shù)測(cè)定

蛋白回收率和純化倍數(shù)按式（2）和（3）計(jì)算。

式中：BEE為蛋白回收率，%；Pbe為后萃取蛋白含量，mg/mL，按1.2.5中方法測(cè)得；Pcr為粗提液蛋白含量，mg/mL；PR為純化倍數(shù)；(HA)be為后萃取凝血活性，HU/mg，按1.2.6中方法測(cè)得；(HA)cr為粗提液凝血活性，HU/mg。

采用Origin 8.0和SPSS 18.0軟件進(jìn)行繪圖、數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果

2.1.1 前萃取pH對(duì)反膠束萃取的影響

由圖1可知，當(dāng)pH為3~5時(shí)，純化倍數(shù)隨pH的增大而增大；當(dāng)pH為5時(shí)，純化倍數(shù)達(dá)到最大；當(dāng)pH＞6時(shí)，雖然仍有較高的蛋白回收率但純化倍數(shù)開(kāi)始降低，可能是由于雜質(zhì)蛋白被大量萃取而凝集素相對(duì)萃取率降低所導(dǎo)致。

圖1 前萃取pH對(duì)反膠束萃取的影響

2.1.2 前萃取AOT濃度對(duì)反膠束萃取的影響

由圖2可知，當(dāng)AOT濃度在50 mmol/L以下時(shí)，蛋白回收率和純化倍數(shù)均增加，此時(shí)隨著AOT濃度的增加反膠束水池?cái)?shù)量增加，故溶液對(duì)凝集素的萃取率提高，進(jìn)一步提升AOT濃度，或許是過(guò)多的反膠束交聯(lián)在一起，使得蛋白萃取回收率下降。

圖2 前萃取AOT濃度對(duì)反膠束萃取的影響

2.1.3 前萃取離子強(qiáng)度對(duì)反膠束萃取的影響

由圖3可知，當(dāng)前萃取離子強(qiáng)度＜50 mmol/L時(shí)，蛋白回收率和純化倍數(shù)均較低，且在試驗(yàn)過(guò)程中水相和有機(jī)相界面渾濁，不利于兩相分離。隨著離子強(qiáng)度提升，離子力增強(qiáng)，純化倍數(shù)和蛋白回收率隨之升高。離子強(qiáng)度在50~100 mmol/L之間得到最大的純化倍數(shù)，當(dāng)離子強(qiáng)度＞100 mmol/L時(shí)，或許是由于溶液中高離子強(qiáng)度導(dǎo)致的拜德長(zhǎng)度降低，電荷屏蔽增大，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白和反膠束之間的靜電吸引力下降，故純化倍數(shù)降低[17]。

圖3 前萃取離子強(qiáng)度對(duì)反膠束萃取的影響

2.1.4 前萃取時(shí)間對(duì)反膠束萃取的影響

由圖4可知，當(dāng)萃取時(shí)間在15 min至20 min之間時(shí)，純化倍數(shù)顯著增高，當(dāng)時(shí)間達(dá)到20 min時(shí)，純化倍數(shù)達(dá)到最大，此后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，純化倍數(shù)下降，可能是雜質(zhì)蛋白進(jìn)入反膠束內(nèi)導(dǎo)致的凝集素相對(duì)比例下降所導(dǎo)致。

圖4 前萃取時(shí)間對(duì)反膠束萃取的影響

2.1.5 后萃取pH對(duì)反膠束萃取的影響

由圖5可知，當(dāng)pH達(dá)到9時(shí)，凝集素純化倍數(shù)達(dá)到最大；當(dāng)pH＞9時(shí)，在試驗(yàn)過(guò)程中可在兩相界面處看到白色固體存在，可能是由于部分蛋白變性所導(dǎo)致，因而限制了凝集素的后萃??；當(dāng)pH為8~12時(shí)，蛋白回收率無(wú)顯著變化，說(shuō)明此時(shí)蛋白的萃取可能是由疏水力而非靜電力為主導(dǎo)。

圖5 后萃取pH對(duì)反膠束萃取的影響

2.1.6 后萃取離子強(qiáng)度對(duì)反膠束萃取的影響

由圖6可知，當(dāng)后萃取離子強(qiáng)度達(dá)到500 mmol/L時(shí)，純化倍數(shù)達(dá)到最大；當(dāng)離子強(qiáng)度高于500 mmol/L時(shí)，純化倍數(shù)開(kāi)始下降，或許是由于過(guò)高的鹽濃度使凝集素失活，從而導(dǎo)致純化倍數(shù)下降。

圖6 后萃取離子強(qiáng)度對(duì)反膠束萃取的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 結(jié)果及方差分析

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，利用Design-Expert.V8.0.6軟件對(duì)表中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到各因素與響應(yīng)值之間的多元二次回歸模型：

蛋白回收率（Y1）=81.37-12.99A-7.09B+1.51C+3.70D-1.62AB-0.30AC+0.38AD+2.31BC+5.87BD+3.02CD-18.33A2-17.93B2-12.74C2-14.56D2

純化倍數(shù)（Y2）=9.53-1.33A+0.92B-0.14C+0.38D+0.046AB-0.036AC+0.13AD-0.10BC-0.067BD+0.050CD-2.92A2-2.53B2-1.77C2-1.65D2

對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。蛋白回收率回歸模型F=5.04，p=0.002 3＜0.01，失擬項(xiàng)p=0.290 1＞0.05，純化倍數(shù)回歸模型F=4.24，p=0.005 3＜0.01，失擬項(xiàng)p=0.835 8＞0.05，說(shuō)明各因素與響應(yīng)面之間建立的模型極顯著，方程對(duì)試驗(yàn)?zāi)M情況好，試驗(yàn)誤差小。

表3 回歸模型方差分析

由方差分析可知，一次項(xiàng)A對(duì)蛋白回收率和純化倍數(shù)的影響均極顯著（＜0.01），B對(duì)蛋白回收率和純化倍數(shù)的影響均顯著（＜0.05），二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)蛋白回收率的影響均極顯著，A2、B2、C2對(duì)純化倍數(shù)的影響極顯著（＜0.01），D2對(duì)純化倍數(shù)的影響顯著（＜0.05）。由F值可知，各因素對(duì)蛋白回收率和純化倍數(shù)的影響依次為A＞B＞D＞C，即前萃取pH＞AOT濃度＞后萃取離子強(qiáng)度＞后萃取pH。

接表3

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化驗(yàn)證

通過(guò)回歸模型預(yù)測(cè)，得到反膠束萃取紫花蕓豆凝集素的最佳條件：前萃取pH 5.78、AOT濃度59 mmol/L、后萃取pH 8.96、后萃取離子強(qiáng)度530 mmol/L。該條件下預(yù)測(cè)的蛋白回收率為81.77%，純化倍數(shù)為9.79。根據(jù)實(shí)際條件調(diào)整為前萃取pH 5.8、AOT濃度60 mmol/L、后萃取pH 9.0、后萃取離子強(qiáng)度530 mmol/L，所得蛋白回收率為82.66%，純化倍數(shù)為9.65倍，與預(yù)測(cè)值相比，蛋白回收率相對(duì)誤差為1.07%，純化倍數(shù)相對(duì)誤差為1.41%，驗(yàn)證了該模型的有效性，可以利用響應(yīng)面對(duì)反膠束萃取進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析。

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)證明了反膠束萃取法可用于紫花蕓豆凝集素的分離純化，利用響應(yīng)面可確定反膠束法萃取紫花蕓豆凝集素的最佳條件：前萃取離子強(qiáng)度50 mmol/L、萃取時(shí)間20 min、前萃取pH 5.8、AOT濃度60 mmol/L、后萃取pH 9.0、后萃取離子強(qiáng)度530 mmol/L。在該條件下，蛋白回收率為82.66%，純化倍數(shù)為9.65倍，接近預(yù)測(cè)值，驗(yàn)證了該模型的有效性，可以利用響應(yīng)面對(duì)反膠束萃取進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析。

今后可從熱或酸堿處理對(duì)紫花蕓豆凝集素構(gòu)象的影響、凝集素糖結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)域的分析或空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等方面進(jìn)行進(jìn)一步研究，以探究紫花蕓豆凝集素的性質(zhì)和生物學(xué)信息，為紫花蕓豆凝集素的應(yīng)用提供理論支持。