王新新，許令俠，盧艷慧，曲芙生，李迎秋，梁艷

齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）食品科學(xué)與工程學(xué)院（濟(jì)南 250353）

維生素E作為一類(lèi)脂溶性活性物質(zhì)，在抗氧化方面表現(xiàn)突出，但因其對(duì)紫外線、氧、酸堿等外部因素較為敏感，無(wú)法直接進(jìn)行使用。被稱(chēng)為新型抗菌劑的抗菌肽是一類(lèi)由12~100個(gè)氨基酸殘基所構(gòu)成的兩親性陽(yáng)離子肽，無(wú)交叉抗性和病原菌耐藥性。研究表明，抗菌肽具有多重生物活性，如抗病毒、廣譜抗菌等，并在熱穩(wěn)定性、耐酸堿性、對(duì)高等動(dòng)物正常細(xì)胞毒副性小等方面表現(xiàn)優(yōu)異[1-4]。雖然抗菌肽作為抗生素替代品具有巨大的發(fā)展?jié)摿?，但因?yàn)樯矬w內(nèi)存在的蛋白酶對(duì)抗菌肽具有一定水解作用，導(dǎo)致其利用率及抗菌性能大打折扣，在實(shí)際應(yīng)用中嚴(yán)重受限。

微膠囊技術(shù)是微量物質(zhì)包裹在聚合物薄膜中的技術(shù)，是一種儲(chǔ)存固體、液體、氣體的微型包裝技術(shù)。該技術(shù)因可增強(qiáng)產(chǎn)品穩(wěn)定性、提高產(chǎn)品緩釋性能以及改善產(chǎn)品物理性質(zhì)等特點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥、生物技術(shù)等多個(gè)領(lǐng)域[5]。復(fù)合凝聚微膠囊技術(shù)選擇高分子材料（帶相反電荷）作為壁材，將芯材分散于壁材溶液中，通過(guò)pH調(diào)節(jié)，使相反電荷間通過(guò)靜電自組裝在芯材表面形成固化膜，并利用溶解度改變后的相分離現(xiàn)象而獲得的微膠囊[6]。該技術(shù)所生產(chǎn)的微膠囊由疏水性的芯材和親水性的壁材所構(gòu)成，具備高載量、耐高溫的特性，并在芯材的緩控釋方面優(yōu)勢(shì)顯著[7]。

試驗(yàn)以氨基-β-環(huán)糊精和阿拉伯膠為壁材，以維生素E/抗菌肽為芯材，通過(guò)構(gòu)建復(fù)合凝聚體系，制備一種維生素E/抗菌肽復(fù)合凝聚微膠囊[8-10]。通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)微膠囊制備工藝進(jìn)行優(yōu)化處理，并利用紅外、形貌表征、粒徑分析、抗菌肽體外試驗(yàn)及活性驗(yàn)證對(duì)所制備維生素E/抗菌肽微膠囊進(jìn)行表征，以期實(shí)現(xiàn)維生素E和抗菌肽在體內(nèi)利用率的提升及抗菌性能的緩慢釋放[11]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基-β-環(huán)糊精（山東濱州智源生物科技有限公司）；阿拉伯膠（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；維生素E（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；抗菌肽（上海玉博生物科技有限公司）；吐溫80（上海麥克林生化科技有限公司）；人體胃液（福州飛凈生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

ESR-500X高速剪切乳化機(jī)（南通博萊德機(jī)械科技有限公司）；FS-1高速勻漿機(jī)（常州市凱航儀器有限公司）；GY-GTGZJ噴霧干燥機(jī)（上海歸永電子有限公司）；Quanta 200掃描電鏡（FEI公司）；TENSOR紅外光譜儀（廣東晟澤科技有限公司）；馬爾文3000激光粒度儀（深圳市倍鈉德科技有限公司）；BT-1001智能粉體特性測(cè)試儀（丹東百特儀器有限公司）；BGG-9035A鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 復(fù)合凝聚微膠囊的制備與優(yōu)化

1.3.1.1 微膠囊芯材的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取200 g維生素E油和適量的吐溫80（調(diào)節(jié)HLB值在10~13.5）置于高壓剪切乳化機(jī)中，以2 000 r/min轉(zhuǎn)速高速分散處理10 min后，將等質(zhì)量的抗菌肽水溶液緩慢滴入其中，并以3 000 r/min轉(zhuǎn)速進(jìn)行乳化分散處理30 min，獲得含抗菌肽的復(fù)合凝聚微膠囊芯材。

1.3.1.2 復(fù)合壁材溶液的制備

將適當(dāng)比例氨基-β-環(huán)糊精、阿拉伯膠按照一定比例混合后倒入200 mL蒸餾水中，45 ℃氣浴恒溫?fù)u床（水浴鍋）中加熱攪拌至溶解以形成復(fù)合凝聚微膠囊壁材。

1.3.1.3 復(fù)合凝聚微膠囊的制備[12-13]

取100 g壁材溶液置于高速勻漿機(jī)中，以2 000 r/min速度高速攪拌10 min后緩慢滴入復(fù)合凝聚微膠囊芯材溶液，并提高轉(zhuǎn)速至10 000 r/min進(jìn)行分散處理。5min后將混合液轉(zhuǎn)移到高壓均質(zhì)機(jī)中進(jìn)行二次混合處理，處理?xiàng)l件：30 MPa下10 min，49 MPa下5 min，獲得分散均一的微膠囊預(yù)備液。利用1 mol/L HCl溶液將體系調(diào)至pH 4.5左右后繼續(xù)反應(yīng)10 min，降溫至15 ℃以下并用0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 6.0進(jìn)行固化處理。將所制備的復(fù)合凝聚微膠囊分散液靜置20~24 h后，棄去上清液得到微膠囊濕囊，并利用離心噴霧干燥得到試驗(yàn)所需的復(fù)合凝聚微膠囊[14]。噴霧干燥的條件設(shè)置為：進(jìn)料流速500 mL/h，進(jìn)風(fēng)口、出風(fēng)口溫度分別為180 ℃和80 ℃[15-16]。

1.3.2 微囊包埋率測(cè)定[17]

從泉州志愿服務(wù)開(kāi)展的情況看，大部分志愿活動(dòng)是由政府部分機(jī)構(gòu)組織的，志愿者也是由政府機(jī)關(guān)工作人員組成。政府主導(dǎo)和行政推動(dòng)的方式雖然有利于啟動(dòng)志愿服務(wù)活動(dòng)，但過(guò)分依靠行政推動(dòng)往往會(huì)出現(xiàn)“被志愿”或志愿服務(wù)形式化或運(yùn)動(dòng)化的問(wèn)題。[7]由于長(zhǎng)期的行政化主導(dǎo)，一方面讓民眾產(chǎn)生誤解，以為志愿服務(wù)是政府行為；一方面很容易形成運(yùn)動(dòng)式，出現(xiàn)形式化的問(wèn)題；一方面“被志愿”者在心理上對(duì)志愿服務(wù)活動(dòng)會(huì)產(chǎn)生抵觸情緒。

通過(guò)索氏提取法測(cè)定總油含量。準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0 g微囊固體M0，用9 cm濾紙進(jìn)行包裹，研磨使其充分粉碎，稱(chēng)取質(zhì)量為M1，將包裹后的樣品用石油醚進(jìn)行索氏提取，8 h后80 ℃烘干得到質(zhì)量M2?？傆秃堪词剑?）計(jì)算。

表面油含量測(cè)定：準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g粉體M0加入45 mL石油醚，輕搖1 min抽濾，洗滌漏斗，抽濾，將抽濾后的液體烘干，稱(chēng)取質(zhì)量M1。表面油含量按式（2）計(jì)算，包埋率按式（3）計(jì)算。

1.3.3 微膠囊粒徑測(cè)定

利用激光粒度儀來(lái)測(cè)定微膠囊的粒徑大小并表征其粒徑分布。將微膠囊分散在適量去離子水中制成懸浮液，超聲處理30 s后，在激光粒度儀上進(jìn)行粒徑的測(cè)定。

1.3.4 微膠囊形貌表征

從微觀層面表征微膠囊的結(jié)構(gòu)，采用加速電壓5 keV的JEOL JSM-6700F場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡進(jìn)行測(cè)試（測(cè)試前對(duì)樣品作噴金處理）。

1.3.5 微膠囊紅外表征

傅里葉變換紅外光譜被用來(lái)檢測(cè)形成微膠囊后阿拉伯膠、氨基-β-環(huán)糊精、維生素E特征官能團(tuán)的變化情況，從側(cè)面驗(yàn)證所制備微膠囊對(duì)芯材的包埋情況。

1.3.6 復(fù)合凝聚微膠囊的體外釋放試驗(yàn)及抗菌肽活性驗(yàn)證

模擬人的胃液，以此為模型，以釋放出來(lái)的維生素E含量和抗菌肽為指標(biāo)，測(cè)試成分含量變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 微膠囊制備工藝優(yōu)化

復(fù)合凝聚微膠囊制備過(guò)程中，以維生素E包埋率為指標(biāo)，依次以氨基-β-環(huán)糊精與阿拉伯膠比例（3∶1，5∶1，7∶1，9∶1和11∶1）、吐溫80添加量（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%）、芯材添加量（25%，35%，45%，55%和65%）和抗菌肽添加量（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%）作為變量，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，從而分析各因素對(duì)微囊包埋率影響。

從圖1（a）可知：氨基-β-環(huán)糊精和阿拉伯膠之間的配比直接影響維生素E油的包埋效果，二者比例為5∶1時(shí)，包埋率達(dá)到最高值，表明在該比例下氨基-β-環(huán)糊精和阿拉伯膠之間可形成穩(wěn)定的陰陽(yáng)離子配對(duì)體系，包埋率達(dá)到最大值[18]；但隨著氨基-β-環(huán)糊精比例逐步增加，因環(huán)糊精間靜電斥力及空間位阻的存在，破壞原本穩(wěn)定的陰陽(yáng)離子配對(duì)體系的穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致微膠囊因壁材體系的不穩(wěn)定產(chǎn)生包埋率下降的問(wèn)題[19]。

由圖1（b）可以看出：相對(duì)于氨基-β-環(huán)糊精和阿拉伯膠比例而言，吐溫80添加量對(duì)包埋效果來(lái)說(shuō)，影響相對(duì)較小。隨著吐溫80添加量逐步增加，包埋效果并沒(méi)有發(fā)生很大的變化；微膠囊的包埋率在吐溫80添加量1.5%時(shí)達(dá)到最大，吐溫80添加量增加至2.0%和2.5%時(shí)，微膠囊包埋率下降。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是吐溫80的加入僅對(duì)乳化效果產(chǎn)生影響，對(duì)包埋率的影響微乎其微，但隨著添加量逐漸增加，因壁材在總體系中所占比例逐步下降，造成微膠囊“漏油”現(xiàn)象的出現(xiàn)，使包埋率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，選取添加量1.5%作為微膠囊制備的最佳乳化劑使用量。

作為試驗(yàn)的主承載體，芯材添加量的變化對(duì)包埋效果的影響較大，隨著芯材添加量增加，包埋效果呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)，芯材添加量35%時(shí)，包埋率達(dá)到最大值，如圖1（c）所示。但隨著芯材添加量再度增加，因壁材在體系中比例逐步下降，使復(fù)合凝聚反應(yīng)所形成的囊壁越來(lái)越薄，微膠囊力學(xué)性能大幅降低。由此可知，在微膠囊制備過(guò)程中，芯材添加量設(shè)定35%時(shí)，達(dá)到最大包埋率（83.2%），包埋效果最好。

眾多抗菌肽微膠囊研究中表明，抗菌肽的濃度直接關(guān)系到該微膠囊的實(shí)際應(yīng)用效果。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，抗菌肽雖然具有很強(qiáng)的抵抗病毒或真菌、抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞等功能，但其在人體的吸收量相對(duì)較少。因此分別選取0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%作為抗菌肽的添加量，并研究不同添加量對(duì)微膠囊包埋率的影響情況。從圖1（d）中可以看出，抗菌肽添加量對(duì)微膠囊包埋率的影響總體呈現(xiàn)先增加后減小趨勢(shì)（添加量1.5%時(shí)，包埋率最高可達(dá)81.5%），但相對(duì)于壁材配比、芯材添加量而言，抗菌肽添加量對(duì)微膠囊包埋率的影響總體偏小。

圖1 氨基-β-環(huán)糊精和阿拉伯膠比例（a）、吐溫80用量（b）、芯材用量（c）、抗菌肽添加量（d）對(duì)包埋率的影響

2.2 微膠囊粒徑分析及形貌表征

微膠囊的微觀結(jié)構(gòu)、粒徑大小對(duì)其穩(wěn)定性、機(jī)械性能和粉體特性具有不同程度的影響。試驗(yàn)用激光粒度分析儀測(cè)量、表征微膠囊的粒徑大小和分布，用掃描電鏡來(lái)表征微膠囊的微觀形態(tài)（圖2）。由圖2（a）可知，所制備微膠囊的平均粒徑為2.823±0.11 μm，處于亞微囊區(qū)域，PDI為0.322，粒徑分布集中且正態(tài)分布良好，表明所制備的微膠囊大小均一、分散性良好[20]。由圖2（b）可以看出所制備微膠囊為表面規(guī)則，無(wú)裂紋的球體顆粒，表面無(wú)撕裂跡象[21]。但噴霧干燥過(guò)程中，高溫、高壓的制備條件易對(duì)一些囊壁薄的顆粒產(chǎn)生不利影響，最終導(dǎo)致膠囊破裂現(xiàn)象的出現(xiàn)，如圖2（c）所示。破裂微膠囊內(nèi)部存在空穴，囊壁具有一定的厚度且結(jié)構(gòu)致密。這表明氨基-β-環(huán)糊精和阿拉伯膠通過(guò)復(fù)合凝聚體系所形成的微膠囊壁可將芯材完美的包埋于其中，保證所制備微膠囊的高包埋率。

圖2 微膠囊粒徑及形貌表征圖

2.3 紅外光譜表征

氨基-β-環(huán)糊精因特有的疏水性空腔結(jié)構(gòu)，使其能夠?qū)⒅苄晕镔|(zhì)包埋在空腔內(nèi)部形成具有相對(duì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的微膠囊體系。包埋過(guò)程中，由于疏水作用、靜電相互作用等非共價(jià)鍵的存在，使原料活性官能團(tuán)的紅外特征峰發(fā)生不同程度變化。由圖3可知，阿拉伯膠的特征吸收峰中1 758 cm-1代表羰基伸縮振動(dòng)峰、1 573 cm-1代表芳香環(huán)骨架振動(dòng)峰；氨基-β-環(huán)糊精中3 324 cm-1代表氨基伸縮振動(dòng)峰；維生素E的特征吸收峰主要包括甲基不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰（2 954 cm-1）、羰基伸縮振動(dòng)峰（1 761 cm-1）、甲基彎曲振動(dòng)峰（1 368 cm-1）及C—O—C反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰（1 208 cm-1）[20]。由圖3（d）所示，在形成復(fù)合凝聚微膠囊后，阿拉伯膠、氨基-β-環(huán)糊精及維生素E的特征峰呈現(xiàn)出不同程度的強(qiáng)度變化。其中，以維生素E的變化最大：位于2 954 cm-1、1 761 cm-1的特征峰完全消失、1 368 cm-1和1 208 cm-1處特征峰變小，表明維生素E被有效的包埋于氨基-β-環(huán)糊精和阿拉伯膠所形成的微膠囊中。

圖3 阿拉伯膠（a）、氨基-β-環(huán)糊精（b）、維生素E（c）、微膠囊（d）的紅外光譜圖

2.4 微膠囊穩(wěn)定性研究

理想的微膠囊是保護(hù)芯材中的活性物質(zhì)不受體內(nèi)酶的破壞，并保證其可在體內(nèi)緩慢釋放被人體所吸收。因此，微膠囊在模擬胃液中的穩(wěn)定性是保證微膠囊對(duì)活性物質(zhì)具有保護(hù)作用的重要指標(biāo)。從經(jīng)模擬胃液對(duì)微膠囊進(jìn)行消化處理后的維生素E釋放情況和抗菌肽活性2個(gè)方面對(duì)微膠囊穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

如圖4所示，在模擬人體胃液的環(huán)境中，通過(guò)復(fù)合凝聚法制得的微膠囊緩釋性比簡(jiǎn)單的物理共混具有顯著提高。結(jié)果表明，4 h后微膠囊中維生素E的釋放率僅34%，而物理共混的釋放率達(dá)92%，直到18 h后微膠囊體系內(nèi)維生素E才達(dá)到完全釋放。這意味著經(jīng)微囊化處理的維生素E具有抵抗外部因素影響的能力，產(chǎn)品穩(wěn)定性得以提高，且緩釋效果顯著，可達(dá)到在體內(nèi)緩慢釋放的功效[22]。

圖4 不同混合方式的維生素E在模擬胃液釋放率

由大腸桿菌抑制性結(jié)果來(lái)看，如圖5所示，基于復(fù)合凝膠體系所制備的微膠囊對(duì)于活性成分抗菌肽具有很高的保護(hù)性，導(dǎo)致微膠囊在抗菌性上明顯低于未被微囊包裹的抗菌肽。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，阻礙人體吸收抗菌肽類(lèi)物質(zhì)的主要障礙為蛋白酶對(duì)其的水解作用，因此進(jìn)一步研究微膠囊的蛋白酶耐受性來(lái)驗(yàn)證所制備微膠囊的穩(wěn)定性[23]。從蛋白酶的耐受性來(lái)看，微膠囊化后的抗菌肽耐受性相比于常規(guī)抗菌肽提高73%，意味著抗菌肽已經(jīng)成功包埋于壁材或者內(nèi)腔中，使抗菌肽的蛋白酶耐受性大幅提升。總的來(lái)說(shuō)，利用復(fù)合凝聚微膠囊技術(shù)對(duì)抗菌肽進(jìn)行包埋，雖然一定程度上抑制其抗菌活性，但這種影響相比于對(duì)抑制蛋白酶降解來(lái)講可忽略不計(jì)。

圖5 不同制備方式的抗菌肽抑菌性和耐受性比較

3 結(jié)論

試驗(yàn)利用復(fù)合凝聚微膠囊體系對(duì)維生素E/抗菌肽進(jìn)行穩(wěn)定性包埋處理，單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，所制備的微膠囊在氨基-β-環(huán)糊精和阿拉伯膠添加比例5∶1、吐溫80添加量1.5%、芯材添加量35%，芯材中抗菌肽添加量1.5%時(shí)包埋率達(dá)到最大，包埋效果顯著。紅外光譜結(jié)果表明氨基-β-環(huán)糊精和阿拉伯膠間通過(guò)靜電相互作用、疏水作用等非共價(jià)鍵間所形成的壁材可有效實(shí)現(xiàn)芯材包埋；粒徑分布及掃描電鏡結(jié)果表明所制備微膠囊平均粒徑為2.823±0.11 μm，分布集中且正態(tài)分布良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)表明4 h后微膠囊芯材釋放率僅34%，18 h后芯材可完全釋放；抗菌肽活性驗(yàn)證結(jié)果表明經(jīng)微膠囊化處理后的抗菌肽相比于未處理的抗菌肽，在耐受性有所提升，而抗菌活性有所抑制，但影響較小。由此可知，通過(guò)微膠囊化處理后的維生素E/抗菌肽完全可以滿足當(dāng)前對(duì)于維生素E和抗菌肽等活性物質(zhì)體內(nèi)緩釋需求，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有巨大應(yīng)用潛力。