高博，趙宇，孫堯，崔本海，高冷，高曉晨

1.長春工業(yè)大學化學與生命科學學院（長春 130012）；2.長春中醫(yī)藥大學吉林省人參科學研究院（長春 130117）；3.通榆縣向海崔成大雁養(yǎng)殖有限公司（白城 137200）

雁掌黃皮為大雁腳掌及足蹼上的黃色表皮。向海雁（Anser cygnoides）作為吉林省特有物種，常年生活在吉林省通榆縣向海自然保護區(qū)內，2015年其被美國國立生物技術信息中心認定為新物種[1]。向海雁渾身是寶，雁骨、雁血、羽毛都具有一定的經濟價值。向海雁肉質蛋白含量高、熱量低、膽固醇低，作為優(yōu)質的肉類來源深受人們的追捧。吉林省作為向海雁養(yǎng)殖基地之一，每年宰殺量超過30萬只。大量的向海雁雁掌黃皮則是作為食品加工副產物被丟棄，造成極大的生物資源浪費與環(huán)境污染。

生物活性肽也稱功能性肽，由2~20個氨基酸殘基組成，通常由蛋白經過酶解得到。據(jù)報道，現(xiàn)已開發(fā)出具有抗凍、抗氧化、降血壓等活性的生物肽，在食品、保健品方面展現(xiàn)出良好的應用前景[2]。研究表明，從鴨皮、鵝皮等動物表皮中所提取分離得到的蛋白和多肽均有一定的抗氧化活性[3-4]。目前國內外對向海雁加工副產物的研究報道十分少見，對其沒有深入研究。

此次試驗以向海雁雁掌黃皮原料，選擇最適蛋白酶對其進行酶解，利用單因素試驗與正交試驗確定其適宜提取工藝，并利用凝膠排阻色譜測定向海雁雁掌黃皮多肽相對分子質量的分布，進而對其抗氧化活性進行研究，為向海雁雁掌黃皮及向海雁系列產品開發(fā)和應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮向海雁雁掌黃皮，由吉林省白城市通榆縣向海崔成大雁養(yǎng)殖有限公司提供；胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶，由合肥博美生物科技有限責任公司提供；MDA試劑盒、SOD試劑盒，由南京建成科技有限公司提供；其他試劑，均為國產分析純。

UV-3000PC紫外分光光度計（杭州俊升科學器材有限公司）；LGJ-30冷凍干燥機（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）；TGL16M高速冷凍離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）；PH-050A型恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 向海雁雁掌黃皮蛋白提取

提取參考Woo等[5]和聶新艷[6]方法，稍作修改。向海雁宰殺后，將其掌皮完整剝落，剪去指甲，除去可見脂肪，洗凈備用。將向海雁雁掌黃皮剪成2 cm×2 cm的小塊，處理后的向海雁雁掌黃皮采用石油醚進一步除去脂肪，將脫脂后的向海雁雁掌黃皮用去離子水多次沖洗，吸干多余水分放入烘箱溫度置于60 ℃干燥至恒重，利用粉碎機對其進行粉碎處理。取干燥的向海雁雁掌黃皮粉末，與去離子水按照1∶15（g/mL）的料液比混勻，稱取一定量的蛋白酶加入其中。在一定溫度、pH條件下酶解一定時間，酶解結束后在100 ℃下滅酶10 min，待蛋白液冷卻后過濾，在4 000 r/min的條件下離心30 min，取上清液冷凍干燥，得到向海雁雁掌黃皮蛋白。

1.2.2 向海雁雁掌黃皮多肽最佳酶解工藝研究

1.2.2.1 向海雁雁掌黃皮多肽蛋白酶的選擇

選取胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶等5種酶，在其最佳酶解條件下對預處理后的向海雁雁掌黃皮進行水解。5種蛋白酶的最適條件[7-8]如表1所示，在每種蛋白酶最佳酶解條件下，利用凱氏定氮法和甲醛滴定法來測定水解度[9-10]。

表1 各種蛋白酶的水解條件設計表

1.2.2.2 向海雁雁掌黃皮多肽單因素試驗

稱取10 g向海雁雁掌黃皮干燥樣品置于盛有150 mL的去離子水燒杯中，加入不同質量（1 000，2 000，3 000，4 000和5 000 U/g）蛋白酶以不同pH（5.0，6.0，7.0，8.0和9.0）在不同的溫度（40，45，50，55和60 ℃）條件下酶解一段時間（1，2，3，4和5 h）。將溫度提升至100 ℃加熱煮沸10 min，待蛋白酶完全滅活后，靜置使其冷卻后過濾再放入離心機中以4 000 r/min的速度離心30 min，取上清液，采用凱氏定氮法和甲醛滴定法測定水解度。

1.2.2.3 向海雁雁掌黃皮多肽酶解工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗結果的基礎上，以蛋白水解度為響應值（Y），選擇蛋白酶添加量（A）、酶解溫度（B）、酶解時間（C）、pH（D）為自變量，進行四因素三水平的正交試驗，試驗設計因素水平見表2。

表2 酶解工藝正交試驗設計因素水平

1.2.2.4 水解度測定

采用甲醛滴定法測定氨基氮含量[11-12]，采用凱氏定氮法[13-14]測定樣品中總氮含量，按式（1）計算水解度。

1.2.3 向海雁雁掌黃皮多肽的相對分子質量分布測定[16]

采用分子排阻色譜法測定向海雁雁掌黃皮多肽的相對分子質量大小。取1 mg/mL的樣品溶液，用0.22 μm的濾膜過濾后進色譜柱TSK gel 2000SWXL（300 nm×4.6 nm，4 μm）；流動相：0.1 mol/L的PBS+硫酸鈉溶液；檢測波長：280 nm；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。用核糖核酸酶（13 700 Da）、抑肽酶（6 500 Da）、胰島素（5 808 Da）、人生長激素釋放抑制因子（1 521 Da）、谷胱甘肽（307 Da）、亮氨酸（131 Da）作為相對分子質量校正標準[15-16]。以標準品的logMW及洗脫時間作標準曲線。

1.2.4 向海雁雁掌黃皮多肽的體外抗氧化活性研究

1.2.4.1 OH自由基清除率的測定

參照張雪嬌等[17]的方法進行測定。每個樣品3平行組，取平均值。按式（2）計算清除率。

式中：A0為蒸餾水代替過氧化氫溶液；A1為待測樣品與硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸乙醇混合溶液；A2為蒸餾水代替樣品溶液。

1.2.4.2 O2-自由基清除率的測定

參考方磊等[18]的方法進行測定。每個樣品3平行組，取平均值。按式（3）計算清除率。

式中：V0為空白樣，mL；V1為待測樣品，mL。

1.2.5 血管內皮細胞保護作用

參照顏培華等[19]的方法建立大鼠血管內皮細胞損傷模型。將向海雁雁掌黃皮多肽按照50，100和200 mg/mL的劑量與模型細胞在37 ℃ 5% CO2的條件下培養(yǎng)24 h，收集對照組、模型組和低、中、高各組的上清液，按照測試盒說明書測定其MDA和SOD活力，考察向海雁雁掌黃皮多肽對血管內皮細胞的保護作用。

2 結果與分析

2.1 向海雁雁掌黃皮蛋白最佳酶解工藝研究

2.1.1 蛋白酶的確定

由圖1可知，5種蛋白酶對向海雁雁掌黃皮蛋白的水解能力依次為中性蛋白酶＞胃蛋白酶＞堿性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞風味蛋白酶，選取水解度最高的單酶對向海雁雁掌黃皮蛋白進行水解，因此選擇中性蛋白酶作為工具酶。

圖1 不同蛋白酶的水解度

2.1.2 酶解工藝單因素試驗結果

中性蛋白酶酶解向海雁雁掌黃皮蛋白的單因素試驗結果如圖2所示。由圖2（A）可知，水解度隨著蛋白酶的加入量呈上升趨勢直至4 000 U/g時達到最高，繼續(xù)加入蛋白酶出現(xiàn)下降趨勢，可能是因為底物濃度不足影響反應的繼續(xù)進行，繼續(xù)增加加酶量，可能會過度酶解。由圖2（B）可知，向海雁雁掌黃皮蛋白水解度隨著提取時間的增長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當提取時間為5 h時向海雁雁掌黃皮水解度達到最高，這表明隨著酶解時間的延長，向海雁雁掌黃皮中蛋白與中性蛋白酶充分接觸，利于向海雁雁掌黃皮水解度的提高。由圖2（C）可知，水解度隨溫度的升高先上升后下降，在55 ℃時水解度達到最高，這可能是因為過高的溫度會使蛋白酶穩(wěn)定的分子構象被破壞，導致蛋白酶失活從而導致水解度下降。由圖2（D）可知，水解度在pH 7時到達最高，pH過高或過低均會影響蛋白酶的活力，所以確定酶解時的pH為7。

圖2 各因素對向海雁雁掌黃皮蛋白水解度的影響

2.1.3 向海雁雁掌黃皮多肽酶解正交試驗

在單因素試驗結果的基礎上，以蛋白水解度為響應值（Y），選擇蛋白酶添加量（A）、酶解溫度（B）、酶解時間（C）、pH（D）為自變量，進行L9(34)的正交試驗，試驗設計水平見表2，試驗結果見表3，方差分析見表4。通過正交試驗分析，4個因素對水解度的影響為A＞B＞C＞D。綜合考慮，選擇工藝A2B1C2D2。在此工藝條件下進行3次重復試驗，水解度的平均值為28.07%，說明該工藝可用于向海雁雁掌黃皮多肽的實際生產。

表3 向海雁雁掌黃皮多肽正交試驗設計及結果

表4 向海雁雁掌黃皮正交方差分析結果

2.1.4 向海雁雁掌黃皮多肽相對分子質量分布結果

由圖3可知，向海雁雁掌黃皮多肽在280 nm處的保留時間在9.255~12.33 min，通過線性方程（y=-0.349 4x+7.246 6，R2=0.996 5）得出其相對分子質量在859~10 302 Da之間，主要集中在8 000 Da以下，此次試驗制備得到的向海雁雁掌黃皮多肽符合具有生物活性多肽相對分子質量大小的范圍。

圖3 向海雁雁掌黃皮多肽凝膠排阻色譜結果

2.1.5 向海雁雁掌黃皮多肽抗氧化活性研究結果

分別對未酶解向海雁雁掌黃皮蛋白和向海雁雁掌黃皮多肽的·OH自由基清除率和O2-自由基清除率進行測定，結果如圖4所示。向海雁雁掌黃皮多肽添加量低、中、高三個組分中，抗氧化能力的排名為高劑量組（12 mg/mL）＞中劑量組（8 mg/mL）＞低劑量組（4 mg/mL）；抗氧化活性的能力的大小隨劑量的增長而增長，其中抗氧化活性最強是高劑量組（添加濃度為12 mg/mL），其羥基自由基的清除能力和超氧陰離子的清除能力分別為70.45%和72.68%。

圖4 向海雁雁掌黃皮多肽各濃度抗氧化活性試驗結果

2.1.6 向海雁雁掌黃皮多肽對血管內皮細胞的保護作用結果

血管內皮細胞廣泛地分布在身體的每一部分，它是組成血管的第一道屏障。它具有調節(jié)血流、抑制血栓形成等功能，血管內皮細胞的損傷是引發(fā)部分疾病的誘因，而炎癥反應、氧化應激以及冷損傷都能引起血管內皮細胞的損傷。MDA是脂質過氧化的最終代謝物質，能夠引起細胞的損傷[20]。結果表明，模型組的MDA的含量顯著上升，向海雁雁掌黃皮多肽各劑量干預組與模型組相比能夠降低MDA含量，其中中、高劑量組細胞內MDA含量顯著降低，但低劑量組無明顯影響。SOD水平的高低可以反映出抗氧化能力的強弱，SOD水平越高，抗氧化能力越強，反之則弱[21]。結果顯示，與對照組相比，模型組內皮細胞的SOD活力顯著降低，與模型組比較各劑量多肽干預組SOD活力均顯著上升。證明向海雁雁掌黃皮多肽具有抗氧化活性，能夠對血管內皮細胞起到保護作用，為今后向海雁雁掌黃皮多肽抗氧化的應用與開發(fā)提供了理論依據(jù)。

3 結論

試驗以向海雁加工副產物雁掌黃皮為原料，經過篩選確定利用中性蛋白酶對向海雁雁掌黃皮蛋白進行酶解。正交試驗得到的酶解工藝為加酶量4 000 U/g、酶解溫度55 ℃、酶解時間5 h、pH 7，在此條件下水解度為28.07%；向海雁雁掌黃皮多肽經凝膠排阻色譜測定，其相對分子質量主要集中在8 000 Da以下。并對向海雁雁掌黃皮多肽和未經酶解的向海雁雁掌黃皮蛋白進行抗氧化試驗。結果表明，在體外抗氧化試驗中，低、中、高劑量向海雁雁掌黃皮多肽的添加均有抗氧化活性?？寡趸钚耘琶麨楦邉┝拷M＞中劑量組＞低劑量組，其中高劑量組的抗氧化活性最強，其羥基自由基的清除能力和超氧陰離子的清除能力分別為70.45%和72.68%；在對大鼠血管內皮細胞的保護試驗中，低、中、高三個劑量組均能夠降低模型細胞的MDA含量，增加SOD活性，能夠對血管內皮細胞起到保護作用，說明向海雁雁掌黃皮多肽具有良好的抗氧化能力。因此，向海雁雁掌黃皮多肽可作為一種天然安全的抗氧化物質，應用于功能性食品、生物制藥及化妝品等領域。