程天德，游麗君

1.清遠(yuǎn)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品藥品學(xué)院（清遠(yuǎn) 511510）；2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（廣州 510640）

大果山楂是一種有著悠久歷史的藥食兩用水果，與中國(guó)傳統(tǒng)中藥山楂具有相似的成分和功效[1-2]。大果山楂既可鮮食，也可加工成山楂酒、山楂果汁、山楂醋、山楂茶等[3-4]。雖然大果山楂營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，但由于其味道酸澀，山楂汁、山楂茶等產(chǎn)品難以被消費(fèi)者廣泛接受，因此需要研究可改善大果山楂澀味的深加工技術(shù)。果汁脫澀的方法主要有物理脫澀法、化學(xué)脫澀法和生物脫澀法[5]。劉國(guó)凌等[6]進(jìn)行活性炭-超聲波聯(lián)合脫除法對(duì)崗稔果汁的脫澀研究，有一定脫澀效果，但存在果汁不穩(wěn)定，易失去原有色澤和風(fēng)味等缺陷。張珊珊等[7]采用明膠對(duì)山荊子果汁進(jìn)行脫澀，效果較好，但明膠脫澀法特異性強(qiáng)，存在二次沉淀等問題。朱一方等[8]進(jìn)行單寧酶對(duì)刺梨果汁脫澀的研究，并與明膠脫澀法和羧甲基殼聚糖脫澀法進(jìn)行比較，顯示酶法脫澀效果更好，但在最優(yōu)條件下的單寧脫除率僅為70.67%，部分單寧由于有果膠的保護(hù)而無法被分解，導(dǎo)致脫澀效果難以進(jìn)一步提升。

大果山楂汁的澀味主要來自于單寧類物質(zhì)[9]，除可采用單寧酶直接降解單寧而脫澀外，還可采用果膠酶、纖維素酶水解大果山楂汁中的果膠和多糖，使大果山楂汁中的單寧失去果膠等物質(zhì)的保護(hù)而與其他膠體共同沉淀，達(dá)到脫澀的目的[10]。試驗(yàn)以大果山楂汁中的單寧含量為考察指標(biāo)，采用單寧酶、果膠酶和纖維素酶進(jìn)行酶解，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最佳復(fù)合酶配比，應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化大果山楂汁復(fù)合酶法脫澀工藝，得出最優(yōu)工藝條件，以期為大果山楂汁的脫澀和產(chǎn)品品質(zhì)的改善提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大果山楂（廣東省連山縣某大果山楂種植基地）；單寧標(biāo)準(zhǔn)品（上海金穗生物科技有限公司）；500 U/g單寧酶（南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司）；30 000 U/g果膠酶（南寧龐博生物工程有限公司）；20 000 U/g纖維素酶（山東隆科特酶制劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ-2型組織搗碎機(jī)（金壇市晨陽電子儀器廠）；UV-759型分光光度計(jì)（上海精密儀器儀表有限公司）；JA3003N型電子天平（上海菁海儀器有限公司）；PHS-25型pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；SHA-CA型數(shù)顯恒溫水浴振蕩器（常州金壇友聯(lián)儀器研究所）；CL4S型離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 大果山楂汁制備工藝

準(zhǔn)確稱取100 g新鮮大果山楂，加入500 mL pH 5.0的磷酸緩沖溶液，用高速組織搗碎機(jī)打漿，煮沸10 min，冷卻至室溫后于3 500 r/min離心20 min，取大果山楂汁于4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 試驗(yàn)方法

1.3.2.1 單寧含量測(cè)定

參考GB/T 27985—2011[11]進(jìn)行測(cè)定。分別取2.0，4.0，6.0，8.0和10.0 mL 10 μg/mL的單寧標(biāo)準(zhǔn)溶液于5個(gè)50 mL容量瓶中，依次加入3.0 mL鐵（Ⅲ）溶液，置于85 ℃恒溫水浴鍋中水浴20 min。將冷卻至室溫的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別依次加入4.0 mL pH 5.0的磷酸緩沖溶液、6.0 mL鄰二氮菲、1.0 mL EDTA溶液，用蒸餾水定容至刻度后搖勻，靜置10 min，以試劑空白作對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，制作單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=0.472 5X+0.082 6，R2=0.996 2。參考上述方法測(cè)定大果山楂汁酶解前后單寧含量，計(jì)算得出單寧脫除率（%）。

1.3.2.2 單酶水解工藝

分別稱取一定質(zhì)量的單寧酶、果膠酶和纖維素酶加入大果山楂汁中，于45 ℃恒溫水浴鍋中酶解2 h，酶解結(jié)束后于95 ℃熱水中滅酶15 min，減壓抽濾即得酶解液。

1.3.2.3 確定單酶最佳添加量

分別向大果山楂汁中添加0.1，0.3，0.5，0.7和0.9 g/100 mL的單寧酶、果膠酶和纖維素酶，按照1.3.2.2的工藝進(jìn)行酶解，分別測(cè)定各酶解液中單寧含量，通過分析單酶添加量對(duì)酶解液中單寧脫除率的影響，確定各種酶的合適添加量。

1.3.2.4 確定復(fù)合酶比例

根據(jù)1.3.2.3的試驗(yàn)結(jié)果，按照表1進(jìn)行正交試驗(yàn)，以復(fù)合酶比例為變量，按照1.3.2.2的工藝進(jìn)行酶解，以大果山楂汁單寧脫除率為指標(biāo)，確定最佳復(fù)合酶比例。

表1 復(fù)合酶比例的正交試驗(yàn)因素水平表單位：g/100 mL

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3.1 酶解溫度對(duì)大果山楂汁脫澀效果的影響

采用1.3.2.4所確定的最佳復(fù)合酶比例加入酶制劑，分別在30，35，40，45，50和55 ℃條件下按1.3.2.2的工藝進(jìn)行酶解，研究不同溫度對(duì)大果山楂汁脫澀效果的影響，確定酶解溫度的合適范圍。

1.3.3.2 酶解pH對(duì)大果山楂汁脫澀效果的影響

采用1.3.2.4所確定的最佳復(fù)合酶比例加入酶制劑，分別在pH 3.5，4.0，4.5，5.0，5.5和6.0的條件下按1.3.2.2的工藝進(jìn)行酶解，研究不同pH對(duì)大果山楂汁脫澀效果的影響，確定酶解pH的合適范圍。

1.3.3.3 酶解時(shí)間對(duì)大果山楂汁脫澀效果的影響

采用1.3.2.4所確定的最佳復(fù)合酶比例加入酶制劑，按1.3.2.2的工藝分別酶解0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 h，研究不同酶解時(shí)間對(duì)大果山楂汁脫澀效果的影響，確定合適的酶解時(shí)間。

1.3.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)1.3.3的試驗(yàn)結(jié)果，選擇酶解溫度、酶解pH和酶解時(shí)間3個(gè)因素及各因素合適的水平，依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以大果山楂汁單寧脫除率為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面分析法對(duì)大果山楂汁復(fù)合酶法脫澀工藝進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪制圖表，采用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和顯著性差異分析，使用Design Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單酶添加量對(duì)大果山楂汁脫澀效果的影響

單寧酶、果膠酶和纖維素酶添加量對(duì)大果山楂汁單寧脫除率的影響如圖1所示?？梢钥闯?，3種酶都能提高大果山楂汁單寧脫除率，但單寧酶的影響比果膠酶、纖維素酶更明顯，原因在于果膠酶和纖維素酶主要是分解大果山楂汁中的果膠類物質(zhì)及多糖，使單寧溶出并與其他物質(zhì)形成膠體而共同沉淀，單寧酶則是直接分解單寧類物質(zhì)從而降低大果山楂汁中單寧含量。單寧酶添加量0.7 g/100 mL時(shí)，大果山楂汁單寧脫除率達(dá)到68.35%，繼續(xù)增加單寧酶，單寧脫除率反而下降。果膠酶添加量達(dá)到0.3 g/100 mL時(shí)，大果山楂汁單寧脫除率達(dá)到26.72%，繼續(xù)增加果膠酶，單寧脫除率的變化趨勢(shì)逐漸平緩。纖維素酶添加量0.5 g/100 mL時(shí)，大果山楂汁單寧脫除率達(dá)到22.66%，繼續(xù)增加纖維素酶，單寧脫除率的變化趨勢(shì)逐漸平緩。

圖1 單酶添加量對(duì)大果山楂汁單寧脫除率的影響

2.2 復(fù)合酶比例正交試驗(yàn)結(jié)果

復(fù)合酶比例正交試驗(yàn)及方差分析結(jié)果見表3和表4。

由表3可知，單寧酶的極差為16.257，果膠酶和纖維素酶的極差分別為2.704和2.137，說明單寧酶添加量對(duì)大果山楂汁單寧脫除率的影響最大。從各水平的均值可以看出，正交試驗(yàn)所得的最佳復(fù)合酶比例為果膠酶0.4 g/100 mL、單寧酶0.7 g/100 mL、纖維素酶0.6 g/100 mL。按此比例添加復(fù)合酶，按1.3.2.2的工藝進(jìn)行酶解驗(yàn)證試驗(yàn)，大果山楂汁的單寧脫除率為86.23%，高于正交試驗(yàn)所有試驗(yàn)組。由表4可知，單寧酶添加量對(duì)大果山楂汁單寧脫除率有顯著性影響，果膠酶和纖維素酶添加量對(duì)大果山楂汁單寧脫除率影響不顯著。

表3 復(fù)合酶比例正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)方差分析表

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 酶解溫度對(duì)大果山楂汁脫澀效果的影響

酶解溫度對(duì)大果山楂汁單寧脫除率的影響如圖2所示。隨著溫度升高，大果山楂汁單寧脫除率隨之提高，酶解溫度50 ℃時(shí)，復(fù)合酶解的效果最好，大果山楂汁單寧脫除率達(dá)到最大值85.42%，進(jìn)一步提高溫度，大果山楂汁單寧脫除率開始下降，這很可能是由于過高的溫度降低復(fù)合酶的酶活力，從而影響單寧、果膠和多糖的分解，因此選擇酶解溫度50 ℃左右進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 酶解溫度對(duì)大果山楂汁單寧脫除率的影響

2.3.2 酶解pH對(duì)大果山楂汁脫澀效果的影響

酶解pH對(duì)大果山楂汁單寧脫除率的影響如圖3所示。隨著pH提高，大果山楂汁單寧脫除率隨之上升，pH 5.5時(shí)，復(fù)合酶解的效果最好，大果山楂汁單寧脫除率達(dá)到最大值82.76%，進(jìn)一步提高pH，大果山楂汁單寧脫除率開始下降，這很可能是由于繼續(xù)提高pH，超出復(fù)合酶的最適pH范圍，酶活力降低導(dǎo)致單寧、果膠和多糖的分解受到不利影響，因此選擇pH 5.5左右進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 pH對(duì)大果山楂汁單寧脫除率的影響

2.3.3 酶解時(shí)間對(duì)大果山楂汁脫澀效果的影響

酶解時(shí)間對(duì)大果山楂汁單寧脫除率的影響如圖4所示。隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，大果山楂汁單寧脫除率隨之上升，酶解至2 h時(shí)，大果山楂汁單寧脫除率達(dá)到最大值84.06%，繼續(xù)酶解，大果山楂汁單寧脫除率沒有太大變化，這可能是由于隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，底物活化能逐漸減小，當(dāng)?shù)竭_(dá)一定時(shí)間后底物活化能降至最低，即使時(shí)間再延長(zhǎng)也很難進(jìn)一步酶解底物，因此選擇酶解時(shí)間2 h左右進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)大果山楂汁單寧脫除率的影響

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

大果山楂汁復(fù)合酶法脫澀工藝的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方差分析結(jié)果見表6。模型的p值＜0.05，說明回歸性顯著，結(jié)果可信。失擬項(xiàng)p值＞0.05，說明該模型對(duì)大果山楂汁復(fù)合酶法脫澀工藝的分析和預(yù)測(cè)可靠。模型的一次項(xiàng)C（酶解時(shí)間）影響顯著，其余一次項(xiàng)影響均不顯著；二次項(xiàng)中酶解溫度影響顯著，其余二次項(xiàng)影響不顯著；交互項(xiàng)中酶解溫度與酶解pH交互作用影響顯著，其余交互項(xiàng)影響不顯著。

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.4.2 響應(yīng)面分析

不同因素之間的交互作用對(duì)大果山楂汁單寧脫除率影響的響應(yīng)面及等高線如圖5，圖6和圖7所示。

圖6 酶解溫度與酶解時(shí)間交互作用對(duì)大果山楂汁單寧脫除率影響的響應(yīng)面及等高線

圖7 酶解pH與酶解時(shí)間交互作用對(duì)大果山楂汁單寧脫除率影響的響應(yīng)面及等高線

從3D響應(yīng)面圖可以看出各因素的交互作用對(duì)大果山楂汁單寧脫除率影響的響應(yīng)值都是先隨各因素?cái)?shù)值的增加而增加，響應(yīng)值達(dá)到極限后，隨著各因素?cái)?shù)值增加，響應(yīng)值出現(xiàn)不同程度下降。從圖5中的等高線可以看出，酶解溫度與酶解pH之間的交互作用對(duì)大果山楂汁單寧脫除率具有顯著性影響，其他因素之間交互作用的影響不顯著，這與表6中交互項(xiàng)AB（酶解溫度與酶解pH）的分析結(jié)果一致。

圖5 酶解溫度與酶解pH交互作用對(duì)大果山楂汁單寧脫除率影響的響應(yīng)面及等高線

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，將大果山楂汁單寧脫除率值設(shè)置得盡可能大，得出最佳酶解條件：酶解溫度50.4 ℃、酶解pH 4.96、酶解時(shí)間2.5 h。單寧脫除率為90.53%。為便于操作，確定酶解條件：酶解溫度50 ℃、酶解pH 5.0、酶解時(shí)間2.5 h。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，所得單寧脫除率均值為89.92%，與理論值90.53%無顯著性差異，表明該預(yù)測(cè)模型科學(xué)可行。

3 結(jié)論

單寧又被稱為植物多酚，是廣泛存在于果蔬中的一種多元酚類化合物。大果山楂中的單寧含量較高，特別是果皮和果核中的單寧含量明顯高于其他部位[12]。大果山楂汁在加工過程中，由于果皮和果核很難完全去除，很容易使其中的大量單寧進(jìn)入果汁中，影響大果山楂汁的風(fēng)味和品質(zhì)[13]。大果山楂汁的澀味主要是由于單寧與口腔中的蛋白質(zhì)結(jié)合生產(chǎn)沉淀，形成收斂感和干燥感而造成的[14]。除此之外，單寧中的酚羥基還可能被氧化成深色的鄰醌，導(dǎo)致大果山楂汁色澤不穩(wěn)定；單寧在酸性條件下還可能發(fā)生縮合，形成不溶性大分子從而使果汁變得渾濁[15]。因此，研究如何脫除單寧成為大果山楂汁加工過程中的關(guān)鍵控制點(diǎn)。

單寧酶是一類脂肪酶，又稱單寧?；饷?，可水解縮合單寧、沒食子單寧和沒食子酯鍵。美國(guó)、日本等在利用單寧酶提高果汁飲料冷溶性方面的研究較深入。Tsai等[16]研究采用纖維素酶、果膠酶、單寧酶處理茶飲料的效果，結(jié)果顯示采用單寧酶進(jìn)行處理后，茶飲料的“冷渾”現(xiàn)象得到明顯改善。Chandini等[17]采用單寧酶處理茶飲料，可明顯降低茶飲料的兒茶素苦味閾值，改善飲料的苦澀味，口感較好。果膠酶是一類降解果膠基質(zhì)的酶的總稱[18-19]，主要作用于植物細(xì)胞壁中的果膠，破壞果膠與半纖維素組成的無定型結(jié)構(gòu)，有助于細(xì)胞中的有效成分釋出。纖維素酶是一類能夠水解纖維素中葡萄糖苷鍵的酶的總稱[20-21]，主要作用于植物細(xì)胞壁中的纖維素，與果膠酶一起協(xié)作破壞細(xì)胞壁，提高內(nèi)容物的溶出率。

大果山楂在成熟過程中，單寧與果膠相互接觸并結(jié)合，僅使用單寧酶處理大果山楂汁，單寧脫除率始終有限，這在朱一方等[8]的研究中得到驗(yàn)證。試驗(yàn)聯(lián)用單寧酶、纖維素酶和果膠酶處理大果山楂汁，破壞大果山楂細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)單寧類物質(zhì)充分釋出，提高單寧酶作用時(shí)的底物濃度，大幅提高單寧脫除率，有效改善大果山楂汁的澀味。結(jié)果顯示，采用復(fù)合酶法處理大果山楂汁的脫澀效果優(yōu)于單酶處理法，最佳復(fù)合酶配比為果膠酶0.4 g/100 mL、單寧酶0.7 g/100 mL、纖維素酶0.6 g/100 mL。采用響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶法脫澀工藝，脫澀效果進(jìn)一步提升，所得的最佳酶解條件為酶解溫度50 ℃、酶解pH 5.0、酶解時(shí)間2.5 h。此條件下大果山楂汁單寧脫除率為89.92%。