趙行，陳令芬，張維，胡馨月，劉冰，孟旭

江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（連云港 222005）

作為大豆的主要進(jìn)口國，我國對(duì)大豆的需求量極大。大豆中富含大量的蛋白質(zhì)及油脂，能夠滿足人體所需。隨著生活水平的不斷提高，人們對(duì)大豆的營養(yǎng)價(jià)值有了更深的認(rèn)知。研究發(fā)現(xiàn)，大豆類的食品不僅可以預(yù)防心血管疾病、癌癥、骨質(zhì)疏松等疾病，同時(shí)還起到一定的保健作用[1]。豆腐作為我國的傳統(tǒng)大豆食品之一，歷史悠久，其風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值深受消費(fèi)者喜愛。豆腐凝膠的形成是凝固劑釋放出的離子作用于大豆蛋白分子，使蛋白分子大量聚集形成具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的蛋白凝膠產(chǎn)品。在豆制品加工過程中，凝固劑的種類極大影響豆制品的品質(zhì)。

很多研究者通過對(duì)豆腐的物理性研究得出最佳的凝固效果，側(cè)重點(diǎn)在物理研究方面如凝膠強(qiáng)度、持水率等，以這些為指標(biāo)判斷凝固劑的強(qiáng)弱。但在制作過程中，凝固的工藝參數(shù)不確定及其時(shí)間點(diǎn)的差異，制成的豆腐質(zhì)量差異很大。為了滿足豆腐的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，對(duì)不同凝固劑在豆?jié){中如何凝固成豆腐這個(gè)過程的研究很有意義。

豆?jié){在凝固過程中凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，可以通過測定豆?jié){體系的動(dòng)態(tài)流變特性來分析研究[2]。有研究表明，豆?jié){中凝固劑的pH下降速度影響蛋白質(zhì)的凝固速率。因此，在豆腐凝膠過程中可以用動(dòng)態(tài)流變?cè)囼?yàn)和動(dòng)態(tài)pH進(jìn)行監(jiān)測研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

大豆（產(chǎn)于東北，市售）；食品級(jí)氯化鎂（安琪酵母股份有限公司）；食品級(jí)硫酸鈣（棗莊市聚隆石膏制品有限公司）；食品級(jí)葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯（安徽省興宙醫(yī)藥食品有限公司）；食品級(jí)消泡劑（安琪酵母股份有限公司）。

1.1.2 儀器與設(shè)備

FDM-Z100型自分離大豆磨漿機(jī)（保定智香修信廚具有限公司）；BP221S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；Seven Easy S20 pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ENCL-G-3恒溫磁力攪拌器（上海易研實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；MCR 102旋轉(zhuǎn)流變儀（安東帕中國有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備流程

精選黃豆→精選浸泡→磨漿濾漿→煮漿滅酶→冷卻保藏

精選新鮮大豆，去除發(fā)霉、不飽滿的顆粒，反復(fù)清洗3~5次。按照料水比1∶3（g/mL），在20 ℃條件下浸泡8~10 h。磨漿、濾漿，按干大豆與水1∶7（g/mL）的比例進(jìn)行磨漿處理，通過0.125 mm濾網(wǎng)將濾渣去除。將研磨好的豆?jié){在煮漿前，加入一定量（豆?jié){比重的0.3%）的大豆磷脂。煮漿，將豆?jié){煮至沸騰持續(xù)5 min，過程中須不斷攪拌，防止豆?jié){底部溫度過高引起糊底。待豆?jié){冷卻至室溫，放入4 ℃的冰箱中備用。

1.2.2 動(dòng)態(tài)pH的測定

量取100 mL樣品放入燒杯中，放置在磁力攪拌器上攪拌。精確稱取0.350 0 g（精確到0.000 1 g）凝固劑倒入樣品中。蓋上保鮮膜密封（升溫-保溫階段減少熱量散失），將pH計(jì)探頭放入樣品中。開啟加熱，從25 ℃升溫至90 ℃，緊接著在90 ℃下保溫10 min，然后關(guān)閉加熱，去除保鮮膜，將90 ℃降溫至25 ℃。記錄在變溫過程中凝固劑在豆?jié){中pH的變化。

1.2.3 溫度掃描試驗(yàn)

利用MCR 102旋轉(zhuǎn)流變儀的振蕩模式測定新鮮豆?jié){凝膠的流變性質(zhì)，選用的轉(zhuǎn)子為50 mm平板，間隙值為1 mm。根據(jù)Murekatete等[3]的方法并作適當(dāng)改動(dòng)。量取10 mL新鮮豆?jié){和凝固劑（添加量0.35%），混合30 s后立即上樣，刮邊除去多余的液體后在轉(zhuǎn)子四周涂抹上凡士林，防止高溫下水分蒸發(fā)損失，隨后立即進(jìn)行溫度掃描試驗(yàn)。

溫度掃描參數(shù)：應(yīng)變1%（線性范圍區(qū)內(nèi)），頻率1 Hz。溫度循環(huán)：首先以5 ℃·min-1的速率從25 ℃升溫至90 ℃，緊接著在90 ℃下保溫10 min，然后再以5 ℃·min-1的降溫速率從90 ℃降溫至25 ℃。記錄彈性模量G’和黏性模量G’隨溫度和時(shí)間的變化情況[4]。

1.2.4 頻率掃描試驗(yàn)

在25 ℃條件下對(duì)凝膠進(jìn)行頻率掃描，應(yīng)變?cè)O(shè)為1%，頻率掃描的角頻率設(shè)為1~100 rad/s，記錄G’隨角頻率的變化情況。

1.2.5 蠕變-恢復(fù)試驗(yàn)

蠕變-恢復(fù)試驗(yàn)參照Bi等[5]的方法且略有改動(dòng)。在25 ℃條件下對(duì)豆腐凝膠施加8 Pa的剪切應(yīng)力，持續(xù)5 min，記錄應(yīng)變隨時(shí)間的變化情況；然后撤去應(yīng)力，繼續(xù)記錄5 min內(nèi)應(yīng)變隨時(shí)間的回復(fù)情況。豆腐凝膠的蠕變數(shù)據(jù)利用四參數(shù)Burger’s模型方程進(jìn)行擬合。因?yàn)樵谑称敷w系中，研究者大多選用Burger’s模型來進(jìn)行蛋白、多糖等凝膠黏彈性質(zhì)的表征[6-8]，其由Kelvin-Voigt和Maxwell兩個(gè)模型串聯(lián)而成，較為簡單，但能夠提供比較合理的分析結(jié)果[9]。該模型方程如式（1）所示[10]。

式中：J為柔量，即應(yīng)變和應(yīng)力的比值，1/Pa；G0為瞬時(shí)彈性模量，Pa；G1為弛豫彈性模量，Pa；λ為弛豫時(shí)間；μ0為黏性因子，Pa·s。

凝膠樣品的恢復(fù)情況用恢復(fù)率來表示，按式（2）計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)如無特別說明，均為3次平行試驗(yàn)獲得的平均值，使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 26進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用Origin Pro 2019b軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 動(dòng)態(tài)pH的測定結(jié)果分析

由圖1可知，在升溫-保溫-降溫三個(gè)階段中，3種凝固劑pH變化趨勢基本一致。在升溫階段，隨著溫度不斷上升，3種凝固劑pH均出現(xiàn)下降趨勢，下降速率最快是葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯（GDL），說明溫度對(duì)GDL釋放速度影響最大。隨著溫度的增加，GDL加快水解的速度，生成葡萄糖酸同時(shí)釋放出里面H+，溶液的pH下降并向大豆蛋白等電點(diǎn)移動(dòng)。H+的釋放引起蛋白質(zhì)表面電量下降，降低了蛋白表面的靜電排斥作用，破壞了膠體穩(wěn)定性，在氫鍵、疏水相互作用下蛋白質(zhì)交聯(lián)形成大豆蛋白凝膠[11-12]。其次是氯化鎂，硫酸鈣最小。隨著溫度的增加，其加快氯化鎂、硫酸鈣在豆?jié){中的解離速度，釋放出Mg2+和Ca2+，Mg2+和Ca2+不僅能夠屏蔽蛋白質(zhì)分子表面的負(fù)電荷，破壞水化膜和雙電子層，而且能夠與羧基上的H+發(fā)生交換，形成鎂橋或者鈣橋。大豆蛋白通過靜電相互作用、疏水聚集以及鎂橋或者鈣橋相互聚集、連接形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[13-14]。在保溫階段，隨著時(shí)間的推移，3種凝固劑pH無明顯增長或下降趨勢，pH處于極為平穩(wěn)狀態(tài)。說明3種凝固劑在豆?jié){中完全溶解，里面的離子得到釋放并與豆?jié){中的蛋白結(jié)合。在降溫過程中，隨著時(shí)間增加，3種凝固劑均出現(xiàn)上升趨勢。主要原因是在加熱中，凝固劑與豆?jié){中的蛋白結(jié)合生成部分可逆性型凝膠，在降溫過程中，溫度下降可逆性凝膠中的變性蛋白有可能發(fā)生部分復(fù)性，復(fù)性后蛋白分子可用于分子間交聯(lián)的活性基團(tuán)減少，氫鍵增加引起pH的上升。從圖1可以觀察到，在降溫結(jié)束后，豆?jié){中各凝固劑pH的大小為氯化鎂＞硫酸鈣＞GDL。

圖1 動(dòng)態(tài)變溫試驗(yàn)pH的變化

2.2 溫度掃描試驗(yàn)結(jié)果分析

動(dòng)態(tài)溫度掃描結(jié)果如圖2和圖3所示。在整個(gè)的變溫過程中，彈性模量G’和黏性模量G’變化趨勢一致。在升溫初期，隨著時(shí)間增加，3種凝固劑的G’和G’開始下降，說明在振蕩過程中，豆?jié){中的蛋白質(zhì)分子間氫鍵作用減小，G’減小，溶液黏度下降，沒有凝膠生成。加熱到65 ℃以上，豆?jié){與凝固劑反應(yīng)，蛋白質(zhì)分子間氫鍵劇烈增加，G’不斷上升開始形成凝膠。溫度繼續(xù)上升，氯化鎂G’和G’’增加，但另外兩種凝固劑隨著時(shí)間的不斷增加G’和G’’突然下降，可能是由于在不停振蕩中剛形成的凝膠遭到破壞，彈性和黏性模量降低。同時(shí)表明氯化鎂中的Mg2+與蛋白結(jié)合聚集形成較為緊密的凝膠。在恒溫過程中，G’、G’隨時(shí)間的增加而緩慢增加，整體G’大于G’，表明更多的蛋白質(zhì)參與凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，當(dāng)G’和G’達(dá)到一定的值后，基本保持不變，這與凝膠中疏水相互作用的形成以及凝膠終點(diǎn)的到達(dá)有關(guān)[15]。在降溫過程中，G’和G’繼續(xù)上升，凝膠結(jié)構(gòu)逐漸增強(qiáng)，這與凝膠結(jié)構(gòu)的分子重排及更強(qiáng)化學(xué)鍵的形成有關(guān)，主要包括氫鍵的形成。氫鍵在低溫下可克服蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)部側(cè)鏈間的靜電斥力，從而引起G’和G’的升高[16-17]。從圖2中可以觀察到，在降溫結(jié)束這3種凝固劑，GDL的G’最大，其次硫酸鈣，氯化鎂最小。G’越大，其凝膠強(qiáng)度越大[18-19]，說明3種凝固劑的凝膠強(qiáng)度大小為GDL＞硫酸鈣＞氯化鎂。這與上述動(dòng)態(tài)pH下降速率保持一致，這也驗(yàn)證了豆腐凝膠的pH降低程度決定蛋白質(zhì)的凝固速率，pH下降速率越快，蛋白質(zhì)凝固速率越快[2]。

圖2 G’—溫度掃描變化

圖3 G’—溫度掃描變化

tanδ[1]=G’/G’，稱為損耗因子，表示黏性相對(duì)彈性部分的比值。tanδ=1，即G’=G’，黏性和彈性相等，稱為凝膠點(diǎn)。tanδ＜1，即G’＜G’，彈性占主要部分，為凝膠體。tanδ＞1，即G’＞G’，黏性占主要部分，為流體。

由圖4可知：在升溫過程中，3種凝固劑初始tanδ＞1，說明整個(gè)溶液以黏性占主要部分，呈現(xiàn)流體狀態(tài)。隨著時(shí)間增加，tanδ均出現(xiàn)上升后降低趨勢，表明在振蕩過程中，G’增長迅速，黏性增加；隨后降低說明溫度升高豆?jié){的黏性下降，G’迅速增加；保溫過程中，3種凝固劑的tanδ值達(dá)到最低點(diǎn)并基本保持不變，說明凝固劑與豆?jié){中的蛋白結(jié)合較為緊密，G’達(dá)到最大值；降溫過程中，隨著時(shí)間的增加，溫度不斷下降，tanδ出現(xiàn)上升趨勢，說明G’’增加，但整體tanδ＜1，表明整個(gè)系統(tǒng)G’占主導(dǎo)，呈現(xiàn)凝膠化。

圖4 tan δ—溫度掃描

2.3 頻率掃描試驗(yàn)結(jié)果分析

由圖5和表1可知：氯化鎂、GDL、硫酸鈣在豆?jié){凝固過程中G’隨著角頻率ω的增大先增加后趨于平穩(wěn)，呈現(xiàn)出較弱的頻率依賴性；使用冪律方程G’=k’·ωn對(duì)G’和ω的關(guān)系進(jìn)行擬合，可以得到n值。n值可以用來表示形成凝膠結(jié)構(gòu)中作用力的性質(zhì)，n=0說明凝膠為化學(xué)性凝膠，由較強(qiáng)的共價(jià)鍵組成；n＞0則表示物理性凝膠，即主要作用力為弱的非共價(jià)鍵[20]。由表1可知，氯化鎂、GDL、硫酸鈣其凝膠得到的擬合參數(shù)n分別為0.055 7，0.037 8和0.028 9，其n值均大于0，表明是物理性凝膠，是一種“弱凝膠”，這也進(jìn)一步證明了前面的結(jié)果[21-22]。

圖5 G’—頻率掃描變化

表1 冪律方程擬合的參數(shù)值

2.4 蠕變-恢復(fù)試驗(yàn)結(jié)果分析

蠕變-恢復(fù)試驗(yàn)，記錄在恒定剪切應(yīng)力的條件下，持續(xù)一段時(shí)間豆?jié){在凝膠的形變隨時(shí)間的變化情況及撤去應(yīng)力后凝膠的恢復(fù)情況，結(jié)果可以用來比較凝膠的剛性特征[23]。由圖6可知，GDL誘導(dǎo)豆?jié){凝膠乳表現(xiàn)出很弱的抵抗形變的能力，相比于另外兩種凝固劑誘導(dǎo)的凝膠，其凝膠結(jié)構(gòu)相對(duì)較弱[24]。利用Burger’s模型方程對(duì)蠕變數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，采用流變儀自帶的擬合軟件將4個(gè)參數(shù)G0、G1、λ、μ0擬合出來，結(jié)果均表現(xiàn)出很好的擬合性（R2＞0.99），擬合得到的參數(shù)如表2所示。氯化鎂誘導(dǎo)的凝膠具有最大瞬時(shí)彈性（G0），說明具有最大的硬度。弛豫彈性模量（G1）可以用來表征凝膠內(nèi)部的凝聚力，反映其對(duì)形變的抵抗能力[25]。黏性因子（μ0）是凝膠的黏性指數(shù)。GDL誘導(dǎo)凝膠具有最大的G1和μ0，這可能是由于形成凝膠的作用力比其他兩種更強(qiáng)的原因所導(dǎo)致的。推遲時(shí)間（λ）代表達(dá)到凝膠最大形變的（1-1/e）所需要的時(shí)間，λ越大，表示達(dá)到完全形變?cè)骄徛齕24]。在恢復(fù)試驗(yàn)結(jié)束后，由于施加恒定的剪切應(yīng)力的作用會(huì)影響大部分凝膠發(fā)生形變達(dá)到最大，這部分形變稱為總形變。極小一部分形變由于撤掉應(yīng)力無法恢復(fù)回來，這部分形變稱為永久形變。而可以恢復(fù)的形變與總形變的比值稱為凝膠的恢復(fù)率。從表2可以看出，氯化鎂誘導(dǎo)的凝膠具有最大的恢復(fù)率，其次是GDL，硫酸鈣的最小，這與蠕變數(shù)據(jù)一致，豆?jié){凝膠如果具有較大的抵抗形變的能力，能夠耗散的變形能量更多，則表現(xiàn)出更好的恢復(fù)能力。

圖6 剪切應(yīng)變—時(shí)間變化

表2 Burger’s方程擬合四參數(shù)

3 結(jié)論

通過變溫掃描、頻率掃描、蠕變-恢復(fù)試驗(yàn)可知，凝固劑的種類和pH對(duì)豆?jié){凝固過程形成凝膠有很大影響。不同種類的凝固劑形成凝膠機(jī)理不同，對(duì)生成凝膠的強(qiáng)弱起著決定性作用。在動(dòng)態(tài)變溫過程中，溫度變化對(duì)pH下降速率有著很大影響，溫度越高，pH下降速率越快。在升溫過程中，隨著溫度的增加，凝固劑的pH不斷下降。升溫初期，彈性模量G’、黏性模量G’不斷下降，這與初始pH變化趨勢一致。隨著溫度的繼續(xù)升高，G’、G’出現(xiàn)先增加后下降再上升趨勢，由于釋放的離子與蛋白結(jié)合不夠緊密，在振蕩過程中，凝膠遭到破壞。隨著pH不斷下降，各凝固劑釋放離子濃度增加與豆?jié){中的蛋白結(jié)合緊密從而生成凝膠。豆腐凝膠從液轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)體，表現(xiàn)出固體的性質(zhì)。在保溫凝固過程中，G’、G’和pH幾乎無上升或下降趨勢，說明各凝固劑離子得到完全釋放，與蛋白充分結(jié)合起來，生成較強(qiáng)的凝膠。在降溫凝固過程中，G’、G’和pH均出現(xiàn)上升趨勢，說明在低溫條件下，氫鍵克服蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)部側(cè)鏈間的靜電斥力引起G’、G’和pH上升。在降溫結(jié)束后，3種凝固劑G’的大小決定凝膠強(qiáng)弱為GDL＞硫酸鈣＞氯化鎂，豆?jié){中各凝固劑pH的大小為氯化鎂＞硫酸鈣＞GDL。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，凝膠強(qiáng)度與pH大小呈反比，pH越低其凝膠強(qiáng)度越強(qiáng)。